Summary
Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stata progettata per testare le proprietà di segnalazione e pattern del proencefalo basale durante lo sviluppo craniofacciale.
Abstract
L'embrione aviario è stato utilizzato come sistema modello per più di un secolo e ha portato a una comprensione fondamentale dello sviluppo dei vertebrati. Uno dei punti di forza di questo sistema modello è che l'effetto e l'interazione tra i tessuti possono essere valutati direttamente negli embrioni chimerici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i segnali provenienti dal proencefalo contribuiscono alla morfogenesi facciale regolando la forma del dominio di espressione del riccio sonico (SHH) nella zona ectodermica frontonasale (FEZ). In questo articolo, viene descritto il metodo per generare le chimere del proencefalo e fornire illustrazioni dei risultati di questi esperimenti.
Introduction
Gran parte della ricerca contemporanea in biologia dello sviluppo si concentra sul ruolo dei geni nella formazione degli embrioni. Ci sono buoni strumenti per esaminare i meccanismi di sviluppo da una prospettiva genetica. Tuttavia, gli embrioni vengono assemblati e subiscono morfogenesi in risposta alle interazioni tissutali. Il sistema aviario è uno strumento classico utilizzato per valutare la varietà di interazioni tissutali che regolano lo sviluppo per i seguenti motivi: l'embriologia è ben compresa, gli embrioni sono facilmente accessibili, gli strumenti per l'analisi dei sistemi aviari sono ben sviluppati e gli embrioni sono poco costosi.
Il sistema di trapianto aviario è stato ampiamente utilizzato per tracciare il lignaggio e per valutare le interazioni tissutali durante lo sviluppo per quasi un secolo 1,2,3,4. Questo sistema è stato utilizzato per studiare un centro di segnalazione, la zona ectodermica frontonasale (FEZ), che regola la morfogenesi della mascella superiore5, ed è stato pubblicato un video che descrive quella tecnica in precedenza6. Oltre al pulcino di quaglia, altre specie sono state utilizzate anche per produrre chimere per l'analisi delle interazioni tissutali. Ad esempio, il topo FEZ è stato trapiantato da topi selvatici di tipo7 e topi mutanti8, e altri hanno utilizzato un sistema di anatra, quaglia e pulcino per valutare il ruolo della cresta neurale nel modellare lo scheletro facciale 9,10,11,12.
In questo lavoro, è stato valutato il ruolo del proencefalo nella regolazione del modello di espressione genica nella zona FEZ trapiantando reciprocamente il proencefalo ventrale tra embrioni di quaglia, anatra e pulcino, perché è necessario un segnale dal proencefalo per indurre l'espressione del riccio sonico nella FEZ. I trapianti di proencefalo non sono unici nel campo. Questi trapianti sono stati utilizzati per valutare lo sviluppo della motilità negli embrioni di quaglia e anatra13, sebbene in questi esperimenti siano stati trapiantati anche tessuti che hanno contribuito a derivati non neurali. In altri lavori, i circuiti uditivi negli uccelli sono stati valutati mediante trapianto di proencefalo14, ma questi trapianti contenevano presunte cellule della cresta neurale, che contribuiscono alla forma del viso 9,10 e partecipano alla regolazione dell'espressione di SHH nella FEZ 15. Quindi, è stato ideato un sistema per trapiantare solo il proencefalo ventrale da una specie di uccello a un'altra prima della chiusura del tubo neurale per valutare il ruolo del cervello nella forma facciale16 (Figura 1A, B). Questo metodo era privo di contaminazione della cresta neurale dell'innesto. In questo articolo, il metodo è illustrato e vengono descritti i risultati attesi e vengono discusse le sfide affrontate.
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Protocol
L'anatra pechinese bianca (Anas platyrhynchos), il pollo livornese bianco (Gallus gallus) e la quaglia giapponese (Cortunix coturnix japonica) vengono incubati a 37 °C in una camera umidificata fino allo stadio HH7/817.
1. Preparazione del tessuto donatore
NOTA: È stata descritta la preparazione dei reagenti e degli strumenti e come aprire le uova per la manipolazione sperimentale6.
- Preparare i supporti DMEM con rosso neutro, una pipetta di trasferimento di vetro e aghi di tungsteno affilati.
- Esporre gli embrioni (come mostrato alpunto 6).
- Innesti di tessuto prelevati dal lato sinistro del proencefalo basale degli embrioni allo stadio 7/8. Utilizzare aghi di tungsteno affilati curvi6 per incidere delicatamente un pezzo del proencefalo che misura ~ 0,3 mm di lunghezza per 0,2 mm di larghezza, assicurandosi di non includere l'endoderma sottostante facendo scorrere l'ago sotto il proencefalo in modo che l'ago sia parallelo all'asse del tubo neurale.
- Utilizzando la pipetta di trasferimento di vetro, prelevare l'innesto dall'embrione donatore.
- Trasferire l'innesto in DMEM contenente Neutral Red (0,01% in PBS, 23 °C) per 2 minuti per colorarlo, quindi posizionare l'innesto colorato in DMEM che non contiene Neutral Red fino al momento dell'attecchimento.
2. Preparazione dell'host
- Incubare uova fecondate di pollo livornese bianco (Gallus gallus) a 37 °C in camera umidificata fino a HH7/8 17.
- Esporre gli embrioni (come mostrato alpunto 6).
- Utilizzando aghi di tungsteno affilati, preparare il sito di innesto tagliando delicatamente, quindi rimuovendo un pezzo di proencefalo basale di 0,3 mm per 0,2 mm dal lato sinistro per ospitare l'innesto come è stato fatto per isolare il tessuto donatore.
- Fare attenzione ad evitare un'eccessiva interruzione dell'endoderma sottostante, che sarà evidente poiché i granuli di tuorlo inizieranno a fuoriuscire attraverso qualsiasi lacrima che viene fatta. Questo richiede pratica e non tutti i tentativi avranno successo.
- Dopo il trasferimento all'ospite6, posizionare l'innesto per sostituire il proencefalo basale estirpato dell'ospite.
- Posizionare saldamente del nastro adesivo sul foro e riportare l'embrione nell'incubatore a 37 °C per il periodo di tempo appropriato per l'analisi.
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Representative Results
Valutazione del chimerismo e della contaminazione da trapianto
Al fine di valutare le chimere, deve essere affrontata l'entità del chimerismo e della contaminazione dell'innesto con altri tipi di cellule. La creazione di chimere trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino consente questo tipo di analisi. Utilizzando l'anticorpo QCPN le cellule di quaglia possono essere visualizzate e distinte dai tessuti ospiti (Figura 1 C,D). In questo caso, solo i tessuti derivati dal proencefalo ventrale sono stati colorati con l'anticorpo che indica che l'innesto non era contaminato da altri tipi di cellule, inclusa la cresta neurale. L'estensione del chimerismo potrebbe essere stimata da queste sezioni usando la stereologia per contare le cellule dell'ospite e del donatore o valutando l'area occupata dai tessuti del donatore e dell'ospite.
Valutazione degli esiti morfologici e molecolari
L'obiettivo era valutare l'impatto del proencefalo ventrale sulla morfologia facciale e sull'espressione di SHH nella FEZ. Inizialmente, il tessuto di quaglia è stato trapiantato in embrioni di anatra al fine di utilizzare QCPN per valutare il chimerismo come descritto sopra. Tuttavia, il cervello di quaglia che si sviluppa più rapidamente ha portato a chimere gravemente deformate (Figura 2), che hanno precluso questo approccio negli esperimenti. A causa di questa limitazione, il trapianto di tessuti d'anatra in embrioni di pollo è stato utilizzato per l'analisi sperimentale. Sebbene ciò non consentisse la valutazione del chimerismo, il sistema dei pulcini di quaglia è stato utilizzato per farlo e ha confermato che tutti gli innesti erano costituiti solo da tessuto neurale16. Le chimere duck-chick risultanti avevano cambiamenti morfologici che suggerivano che il cervello partecipasse alla regolazione della morfologia (Figura 3). Il lato anatra del trapianto sembrava svilupparsi più lentamente e appariva più simile a un'anatra. Un'analisi quantitativa è stata utilizzata per determinare che queste chimere sono state spostate verso la morfologia dell'anatra16. Come fase di controllo sono stati utilizzati embrioni di anatra e pulcino, nonché chimere pulcino-pulcino.
L'ibridazione in situ a montaggio intero è stata utilizzata per valutare l'espressione di SHH . Simile alla morfologia, l'espressione di SHH sul lato dell'anatra della chimera appariva più simile a un'anatra (Figura 3). Un'analisi quantitativa18 è stata anche utilizzata per mostrare che questo dominio di espressione era correlato con la forma della testa16.
Figura 1. Trapianto e valutazione del chimerismo negli embrioni sperimentali
(A) Vista dorsale dell'embrione di pollo allo stadio 8 colorato di rosso neutro che mostra la posizione del sito di innesto e attecchimento. La linea tratteggiata è il livello approssimativo mostrato in B. (B) Sezione trasversale attraverso un embrione di pollo allo stadio 8 dopo ibridazione in situ per mostrare l'espressione di SHH . Viene mostrata la posizione approssimativa dell'innesto, casella tratteggiata rossa. (C) L'immunocolorazione per rilevare la QCPN nelle chimere quaglia-pulcino mostra che l'innesto è diffuso e contribuisce solo al tubo neurale ventro-laterale (freccia) e alla coppa ottica ventrale (punta di freccia). (D) Maggiore ingrandimento in C. Barre di scala: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Valutazione della morfologia delle chimere di quaglia-anatra.
(A, B) Due esempi di chimere di quaglia-anatra allo stadio 22. Questi embrioni hanno gravi malformazioni che precludono ulteriori analisi. Barra scala: 2 mm Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Valutazione delle chimere Duck-Chick.
(A) Embrioni normali di pulcino e (B) anatra allo stadio 22 dopo ibridazione in situ a montaggio intero per visualizzare l'espressione di SHH . (C) Un controllo pulcino-pulcino mostra un modello di SHH e morfologia che assomiglia a un normale embrione di pulcino. (D) Una chimera di anatra-pulcino mostra un modello alterato di espressione SHH . Sul lato trapiantato l'espressione SHH (linea tratteggiata gialla) è più arrotondata e ricorda il motivo dell'anatra. La fossa nasale è anche più arrotondata sul lato trapiantato (freccia gialla) rispetto all'aspetto più "a fessura" sul lato ospite (freccia rossa). La barra rossa indica la linea mediana e il trapianto è sul lato destro dell'immagine. Barra scala: 1 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo descritto consente l'esame delle interazioni tissutali tra il proencefalo basale e l'ectoderma adiacente. Questo approccio differisce dai precedenti metodi di trapianto del proencefalo, perché il tessuto del donatore era limitato al proencefalo ventrale. Questo elimina il trapianto delle cellule della cresta neurale, che hanno dimostrato di partecipare al pattern della morfologia facciale 9,10. Quindi, limitare l'innesto al proencefalo basale era essenziale per valutare i risultati sperimentali pianificati.
Nella ricerca precedente che ha impiegato trapianti di proencefalo13,14 la presenza di tessuto extra-neurale non ha interferito con l'interpretazione delle misure di esito pianificate, perché i risultati erano comportamentali o specificamente testati l'ambiente ospite e donatore sullo sviluppo generale del cervello. Questa è una considerazione importante nella progettazione di esperimenti che utilizzano questi approcci embriologici e la fattibilità deve essere bilanciata con rigore. Ad esempio, l'obbligo di escludere le presunte cellule della cresta neurale ha creato ostacoli significativi da superare. I trapianti dovevano essere eseguiti su embrioni allo stadio precoce di neurula. In queste fasi l'endoderma è immediatamente adiacente al sito di trapianto e si è dovuto prestare estrema attenzione per evitare di danneggiare l'endoderma, perché questo riduce la sopravvivenza. Mentre non è chiaro che la contaminazione dell'innesto da parte dell'endoderma avrebbe avuto un impatto sulle misure di esito, l'obiettivo era quello di isolare esclusivamente l'effetto del proencefalo ventrale sullo sviluppo facciale. Quindi, per questo scopo il rigore extra era giustificato.
Occorre prendere in considerazione il tasso di sviluppo delle specie ospiti e donatrici. Mentre le differenze nei tassi di questi animali sono state utilizzate a vantaggio nel valutare il ruolo delle cellule della cresta neurale nel modellare lo scheletro facciale in via di sviluppo19,20, in questo caso, il tessuto neurale di quaglia a sviluppo più rapido ha creato embrioni estremamente malformati quando trapiantati nell'anatra a sviluppo più lento. Ciò significava che il chimerismo e la contaminazione dovevano essere valutati in un'altra serie di chimere create dall'innesto di tessuto di quaglia in ospiti di pulcino e, sebbene non fosse l'ideale, ciò forniva fiducia nella tecnica di innesto.
Nel complesso, la creazione di chimere per valutare le interazioni tissutali durante lo sviluppo può essere un approccio potente per aiutare a comprendere i meccanismi di sviluppo. È necessario prestare attenzione durante le fasi di pianificazione per garantire che i risultati siano il più conclusivi possibile e determinati controlli appropriati che includono embrioni normali e altre chimere per tenere conto delle variazioni dovute alla chirurgia. In questo caso, era molto importante impiegare analisi quantitative, perché i cambiamenti osservati erano sottili.
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Disclosures
Tutti gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental and Craniofacial Research del National Institutes of Health con i numeri di premio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
