Summary
この記事では、頭蓋顔面発達中の基底前脳のシグナル伝達とパターン化の特性をテストするために設計された組織移植技術について説明します。
Abstract
鳥類の胚は1世紀以上にわたってモデルシステムとして使用されており、脊椎動物の発生に関する基本的な理解につながっています。このモデルシステムの強みの1つは、キメラ胚における組織の効果と組織間の相互作用を直接評価できることです。我々はこれまでに、前脳からのシグナルが前鼻外胚葉帯(FEZ)におけるソニックハリネズミ(SHH)の発現ドメインの形状を制御することによって顔面形態形成に寄与することを示した。本稿では、前脳キメラの生成方法と、これらの実験の結果の実例について説明します。
Introduction
発生生物学における現代の研究の多くは、胚の形成における遺伝子の役割に焦点を当てています。遺伝的観点から発生メカニズムを調べるための優れたツールがあります。しかしながら、胚は組み立てられ、組織相互作用に応答して形態形成を受ける。鳥類系は、発生学がよく理解されていること、胚に容易にアクセスできること、鳥類系の分析のためのツールが十分に発達していること、胚が安価であることなどの理由で発生を調節するさまざまな組織相互作用を評価するために使用される古典的なツールです。
鳥類移植システムは、系統の追跡や発生中の組織相互作用の評価に、ほぼ1世紀にわたって広く採用されてきました1,2,3,4。このシステムは、上顎の形態形成を制御するシグナル伝達中枢である前鼻外胚葉帯(FEZ)を調べるために使用され5、以前にその技術を説明するビデオが公開されました6。ウズラのひよこに加えて、他の種も組織相互作用の分析のためのキメラを生産するために使用されてきました。例えば、野生型7および変異マウス8から移植されたマウスFEZおよびその他は、顔の骨格をパターン化する際の神経堤の役割を評価するためにアヒル、ウズラおよびニワトリ系を使用した9、10、11、12。
本研究では、ウズラ、アヒル、ヒナの胚の間で腹側前脳を相互に移植することにより、FEZにおける遺伝子発現パターンを制御する前脳の役割を評価した。前脳移植はこの分野では珍しいことではありません。これらの移植は、ウズラおよびアヒルの胚13における運動性の発達を評価するために使用されたが、これらの実験では、非神経誘導体に寄与する組織も移植された。他の研究では、鳥の聴覚回路は前脳移植14によって評価されていますが、これらの移植には、顔の形9,10に寄与し、FEZ15のSHH発現の調節に関与する推定神経堤細胞が含まれていました。そこで、神経管を閉じる前に、ある鳥種から別の鳥類に腹側前脳だけを移植するシステムを考案し、顔の形における脳の役割を評価しました16(図1A、B)。この方法は、移植片の神経堤汚染を欠いていた。本稿では、その方法を示し、期待される結果について説明し、直面する課題について説明します。
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Protocol
白いペキンアヒル(アナスプラティリンコス)、白いレグホンチキン(ガルスガルス)、および日本のウズラ(Cortunix coturnix japonica)は、HH7/817でステージマッチングされるまで、加湿チャンバー内で37°Cでインキュベートされます。
1.ドナー組織の準備
注:試薬とツールの準備、および実験的操作のために卵を開く方法が説明されています6。
- ニュートラルレッド、ガラストランスファーピペット、鋭利なタングステン針でDMEMメディアを準備します。
- 胚を露出させます(6に示すように)。
- ステージ7/8の胚の基底前脳の左側から組織移植片を採取します。湾曲した鋭利なタングステン針6 を使用して、長さ~0.3 mm、幅0.2 mmの前脳の一部をそっと切開し、針が神経管の軸と平行になるように前脳の下に針をスライドさせて、下にある内胚葉を含めないようにします。
- ガラストランスファーピペットを使用して、ドナー胚から移植片をピックアップします。
- 移植片をニュートラルレッドを含むDMEM(PBSで0.01%、23°C)に2分間移して染色し、染色したグラフトを生着の準備ができるまでニュートラルレッドを含まないDMEMに入れます。
2. ホストの準備
- 白いレグホンチキン(Gallus gallus)の受精卵を加湿チャンバー内で37°CでHH7/8 17までインキュベートします。
- 胚を露出させます(6に示すように)。
- 鋭利なタングステン針を使用して、ドナー組織を分離するために行われたように、移植片を収容するために左側から0.3 mm x 0.2 mmの基底前脳片を静かに切断し、次に除去することによって移植部位を準備します。
- 卵黄顆粒が作られた裂け目から漏れ始めるので明らかになるであろう、基礎となる内胚葉の過度の破壊を避けるように注意してください。これには練習が必要であり、すべての試行が成功するわけではありません。
- 宿主6に移した後、宿主の摘出された基底前脳を置換するように移植片を配置する。
- 穴にテープをしっかりと貼り、胚を37°Cのインキュベーターに戻し、分析に適した時間待ちます。
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Representative Results
キメラと移植汚染の評価
キメラを評価するために、キメラの程度および他の細胞型による移植片の汚染に対処するべきである。ウズラの組織をニワトリの胚に移植することによってキメラを作成することは、この種の分析を可能にする。QCPN抗体を用いてウズラ細胞を視覚化し、宿主組織と区別することができる(図1C、D)。この場合、腹側前脳に由来する組織のみを、移植片が神経堤を含む他の細胞型で汚染されていないことを示す抗体で染色した。キメラの程度は、ステレオロジーを使用して宿主細胞とドナー細胞をカウントするか、ドナー組織と宿主組織が占める領域を評価することによって、これらのセクションから推定できます。
形態学的および分子的転帰の評価
目的は、FEZの顔の形態と SHH 発現に対する腹側前脳の影響を評価することでした。最初に、上記のようにキメラ性を評価するためにQCPNを使用するために、ウズラ組織をアヒルの胚に移植した。しかし、ウズラの脳の発達が速いため、キメラがひどく変形し(図2)、実験ではこのアプローチが妨げられました。この制限のために、ニワトリ胚へのアヒル組織移植が実験的分析に使用された。これはキメラの評価を可能にしませんでしたが、ウズラのひよこシステムを使用してこれを行い、すべての移植片が神経組織のみで構成されていることを確認しました16。結果として得られたアヒルとヒヨコのキメラは、脳が形態調節に関与していることを示唆する形態学的変化を示しました(図3)。移植のアヒル側は発達が遅く、よりアヒルのように見えました。定量分析を使用して、これらのキメラがアヒルの形態16に移行したことを決定しました。対照段階として、アヒルとひよこの胚、ならびにひよこ - ひよこキメラが使用されました。
SHH発現を評価するために、その場ハイブリダイゼーションのホールマウントを使用した。形態と同様に、キメラのアヒル側のSHH発現はよりアヒルのように見えました(図3)。定量分析18も、この発現ドメインが頭部形状16と相関していることを示すために使用された。
図 1.実験胚におけるキメラの移植と評価
(a)移植片及び生着部位の位置を示す中性赤色で染色されたステージ8ニワトリ胚の背側図。点線はBに示す近似レベルである。 (B)in situハイブリダイゼーション後のステージ8ニワトリ胚を通る断面は SHH 発現を示す。移植片のおおよその位置、赤い点線のボックスが示されています。(C)ウズラ-ヒヨコキメラのQCPNを検出するための免疫染色は、移植片が広範であり、腹外側神経管(矢印)および腹側視カップ(矢じり)にのみ寄与することを示しています。(D)C.スケールバーの高倍率:A:500μm、B:100μm、C:1mm、D:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.ウズラとアヒルのキメラの形態の評価。
(A、B)ステージ22のウズラとアヒルのキメラの2つの例。これらの胚には深刻な奇形があり、それ以上の分析ができません。スケールバー: 2 mm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.アヒルひよこキメラの評価。
(A)正常なヒナおよび(B)ハック胚をステージ22で、その場ハイブリダイゼーションに全マウントしてSHH発現を可視化する。(C)ニワトリ-ヒナ対照は、正常なニワトリ胚に似たSHHおよび形態のパターンを示す。(D)アヒルとヒナのキメラは、SHH発現の変化したパターンを示します。移植された側では、SHH発現(黄色の点線)はより丸みを帯びており、アヒルのパターンに似ています。鼻腔はまた、宿主側のより「スリット」のような外観(赤い矢印)と比較して、移植側(黄色の矢印)でより丸みを帯びています。赤いバーは正中線を示し、移植は画像の右側にあります。スケールバー: 1 mm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された方法は、基底前脳と隣接する外胚葉との間の組織相互作用の検査を可能にする。このアプローチは、ドナー組織が腹側前脳に限定されていたため、以前の前脳移植方法とは異なります。これにより、顔面形態のパターン化に関与することが示されている神経堤細胞の移植が排除されます9,10。したがって、移植片を基底前脳に制限することは、計画された実験結果を評価するために不可欠でした。
前脳移植を採用した以前の研究では13,14、神経外組織の存在は、結果が行動的であるか、または全体的な脳発達に関する宿主とドナーの環境を具体的にテストしたため、計画された結果測定値の解釈を妨げませんでした。これは、これらの発生学的アプローチを使用して実験を設計する際の重要な考慮事項であり、実現可能性は厳密さとバランスをとる必要があります。たとえば、推定神経堤細胞を除外するという要件は、克服すべき重大な障害を生み出しました。移植は初期の神経ラ期の胚に対して行われなければならなかった。これらの段階では、内胚葉は移植部位のすぐ隣にあり、生存率を低下させるため、内胚葉に損傷を与えないように細心の注意を払う必要がありました。内胚葉による移植片の汚染がアウトカム指標に影響を与えるかどうかは明らかではないが、目標は、顔の発達に対する腹側前脳の影響のみを分離することでした。したがって、この目的のために、追加の厳密さが保証されました。
宿主種とドナー種の発生速度を考慮する必要があります。これらの動物の割合の違いは、発達中の顔の骨格をパターン化する上で神経堤細胞の役割を評価する上で有利に使用されてきましたが19,20、この場合、発達の速いウズラの神経組織は、発達の遅いアヒルに移植されたときに非常に奇形の胚を作成しました。これは、ウズラの組織をニワトリの宿主に移植することによって作成された別のキメラのセットでキメラと汚染を評価する必要があることを意味し、理想的ではありませんが、これは接ぎ木技術に自信を与えました。
全体として、発生中の組織相互作用を評価するためのキメラを作成することは、発生のメカニズムを理解するのに役立つ強力なアプローチになる可能性があります。結果が可能な限り決定的なものになるように計画段階で注意を払い、手術による変動を説明するために正常な胚やその他のキメラを含む適切な対照を決定する必要があります。この場合、観察された変化は微妙であるため、定量分析を採用することが非常に重要でした。
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Disclosures
すべての著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立歯科頭蓋顔面研究所によって、賞番号R01DE019648、R01DE018234、およびR01DE019638でサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
