Summary
Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.
Abstract
O embrião aviário tem sido usado como um sistema modelo por mais de um século e levou à compreensão fundamental do desenvolvimento de vertebrados. Um dos pontos fortes desse sistema modelo é que o efeito e a interação entre os tecidos podem ser avaliados diretamente em embriões quiméricos. Mostramos anteriormente que sinais do prosencéfalo contribuem para a morfogênese facial regulando a forma do domínio de expressão do ouriço sônico (SHH) na Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ). Neste artigo, o método de gerar quimeras do prosencéfalo e fornecer ilustrações dos resultados desses experimentos é descrito.
Introduction
Muitas pesquisas contemporâneas em biologia do desenvolvimento se concentram no papel dos genes na formação de embriões. Existem boas ferramentas para examinar os mecanismos de desenvolvimento de uma perspectiva genética. No entanto, os embriões são montados e sofrem morfogênese em resposta às interações teciduais. O sistema aviário é uma ferramenta clássica usada para avaliar a variedade de interações teciduais que regulam o desenvolvimento pelas seguintes razões: a embriologia é bem compreendida, os embriões são facilmente acessíveis, as ferramentas para análise de sistemas aviários são bem desenvolvidas e os embriões são baratos.
O sistema de transplante aviário tem sido amplamente empregado para rastreamento de linhagens e para avaliar interações teciduais durante o desenvolvimentohá quase um século 1,2,3,4. Esse sistema foi utilizado para investigar um centro de sinalização, a Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula a morfogênese da mandíbulasuperior5, e um vídeo foi publicado descrevendo essa técnicaanteriormente6. Além das codornas-pintinhos, outras espécies também têm sido utilizadas na produção de quimeras para análise de interações teciduais. Por exemplo, o camundongo FEZ foi transplantado de camundongos selvagens tipo7 e mutantes8, e outros utilizaram os sistemas pato, codorna e pintinho para avaliar o papel da crista neural na padronização do esqueleto facial 9,10,11,12.
Neste trabalho, o papel do prosencéfalo na regulação do padrão de expressão gênica no FEZ através do transplante do prosencéfalo ventral reciprocamente entre embriões de codorna, pato e pintinho foi avaliado, pois um sinal do prosencéfalo é necessário para induzir a expressão do ouriço sônico no FEZ. Os transplantes de prosencéfalo não são únicos no campo. Esses transplantes foram utilizados para avaliar o desenvolvimento da motilidade em embriões de codornas epatos13, embora nesses experimentos também tenham sido transplantados tecidos que contribuíram para derivados não neurais. Em outros trabalhos, circuitos auditivos em aves foram avaliados por transplante de prosencéfalo14, mas esses transplantes continham células presuntivas da crista neural, que contribuem para a formafacial9,10 e participam da regulação da expressão de SHH noFEZ15. Assim, um sistema para transplantar apenas o prosencéfalo ventral de uma espécie de ave para outra antes do fechamento do tubo neural foi concebido para avaliar o papel do cérebro na forma facial16 (Figura 1A,B). Este método foi isento de contaminação da crista neural do enxerto. Neste artigo, o método é ilustrado e os resultados esperados são descritos, e os desafios enfrentados são discutidos.
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Protocol
Pato Pekin branco (Anas platyrhynchos), galinha Leghorn branco (Gallus gallus) e codorna japonesa (Cortunix coturnix japonica) são incubados a 37 °C em câmara umidificada até estágio combinado em HH7/817.
1. Preparação do tecido doador
NOTA: A preparação de reagentes e ferramentas e a forma de abrir ovos para manipulação experimental foram descritas6.
- Prepare meios DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e agulhas de tungstênio afiadas.
- Expor embriões (como mostrado em6).
- Colher enxertos teciduais do lado esquerdo do prosencéfalo basal de embriões estágio 7/8. Use agulhas curvas de tungstênioafiadas 6 para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo medindo ~0,3 mm de comprimento por 0,2 mm de largura, certificando-se de não incluir a endoderme subjacente deslizando a agulha abaixo do prosencéfalo para que a agulha fique paralela ao eixo do tubo neural.
- Usando a pipeta de transferência de vidro, pegue o enxerto do embrião doador.
- Transfira o enxerto para DMEM contendo Vermelho Neutro (0,01% em PBS, 23 °C) por 2 minutos para corá-lo e, em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha Vermelho Neutro até que esteja pronto para o enxerto.
2. Preparação do anfitrião
- Incubar ovos fertilizados de galinha Leghorn branca (Gallus gallus) a 37 °C em câmara umidificada até HH7/8 17.
- Expor embriões (como mostrado em6).
- Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando suavemente e, em seguida, removendo um pedaço de prosencéfalo basal de 0,3 mm por 0,2 mm do lado esquerdo para acomodar o enxerto, como foi feito para isolar o tecido doador.
- Tome cuidado para evitar a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita. Isso exige prática e nem todas as tentativas serão bem-sucedidas.
- Após transferência para o hospedeiro6, posicionar o enxerto para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro.
- Coloque a fita adesiva firmemente sobre o orifício e devolva o embrião à incubadora a 37 °C durante o período de tempo adequado para análise.
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Representative Results
Avaliação do quimerismo e contaminação por transplantes
Para avaliar as quimeras, a extensão do quimerismo e a contaminação do enxerto com outros tipos celulares devem ser abordadas. A criação de quimeras através do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos permite esse tipo de análise. O uso do anticorpo QCPN células de codorna podem ser visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro (Figura 1 C,D). Neste caso, apenas tecidos derivados do prosencéfalo ventral foram corados com o anticorpo, indicando que o enxerto não estava contaminado com outros tipos celulares, incluindo crista neural. A extensão do quimerismo pode ser estimada a partir desses cortes usando estereologia para contar células do hospedeiro e doador ou avaliando a área ocupada pelo doador e tecidos do hospedeiro.
Avaliação de Desfechos Morfológicos e Moleculares
O objetivo foi avaliar o impacto do prosencéfalo ventral na morfologia facial e expressão de SHH no FEZ. Inicialmente, o tecido de codorna foi transplantado em embriões de pato, a fim de usar QCPN para avaliar o quimerismo como descrito acima. No entanto, o desenvolvimento mais rápido do cérebro de codornas levou a quimeras severamente deformadas (Figura 2), o que impossibilitou essa abordagem nos experimentos. Devido a esta limitação, o transplante de tecidos de pato em embriões de galinha foi utilizado para análise experimental. Embora isso não permitisse avaliar o quimerismo, o sistema de pintos de codorna foi utilizado para fazer isso e confirmou que todos os enxertos eram compostos apenas de tecidoneural16. As quimeras resultantes de pato-pintinho apresentaram alterações morfológicas que sugeriram que o cérebro participou da regulação da morfologia (Figura 3). O lado pato do transplante parecia se desenvolver mais lentamente e parecia mais parecido com pato. Uma análise quantitativa foi usada para determinar que essas quimeras foram deslocadas para a morfologia dopato16. Como estágio controle, foram utilizados embriões de pato e pintinho, bem como quimeras de pintinhos.
Hibridização in situ de montagem inteira foi utilizada para avaliar a expressão de SHH . Semelhante à morfologia, a expressão de SHH no lado do pato da quimera pareceu mais semelhante a um pato (Figura 3). Uma análise quantitativa18 também foi utilizada para mostrar que esse domínio de expressão estava correlacionado com a forma dacabeça16.
Gráfico 1. Transplante e Avaliação do Quimerismo em Embriões Experimentais
(A) Vista dorsal do embrião de galinha estágio 8 corado com vermelho neutro mostrando a localização do enxerto e do local de enxerto. A linha pontilhada é o nível aproximado mostrado em B. (B) Secção transversal através de um embrião de galinha estágio 8 após hibridização in situ para mostrar expressão de SHH . A localização aproximada do enxerto é mostrada, caixa pontilhada vermelha. (C) A imunomarcação para detecção de QCPN em quimeras de codornas mostra que o enxerto está disseminado e contribui apenas para o tubo neural ventrolateral (seta) e a taça óptica ventral (cabeça de seta). (D) Maior magnificação em C. Barras de escala: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. Avaliação da morfologia de quimeras de codornas.
(A, B) Dois exemplos de quimeras de codorna-pato no estágio 22. Esses embriões apresentam malformações graves que impedem análises posteriores. Barra de escala: 2 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Avaliando quimeras de pato-pintinho.
(A) Embriões normais de pintinhos e (B) de pato no estágio 22 após hibridização in situ montada inteira para visualização da expressão de SHH . (C) Um controle de pintinhos mostra um padrão de SHH e morfologia que se assemelha a um embrião de pintinho normal. (D) Uma quimera pato-pintinho mostra um padrão alterado de expressão de SHH . No lado transplantado, a expressão SHH (linha pontilhada amarela) é mais arredondada e se assemelha ao padrão de pato. A fossa nasal também é mais arredondada no lado transplantado (seta amarela) em comparação com a aparência mais "fenda" no lado do hospedeiro (seta vermelha). A barra vermelha indica a linha média e o transplante está no lado direito da imagem. Barra de escala: 1 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito permite examinar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o ectoderma adjacente. Essa abordagem difere dos métodos anteriores de transplante de prosencéfalo, pois o tecido doador era restrito ao prosencéfalo ventral. Isso elimina o transplante das células da crista neural, que comprovadamente participam da padronização da morfologiafacial9,10. Assim, a restrição do enxerto ao prosencéfalo basal foi essencial para avaliar os resultados experimentais planejados.
Nas pesquisas anteriores que empregaram transplantes de prosencéfalo13,14, a presença de tecido extraneural não interferiu na interpretação dos desfechos planejados, pois os desfechos foram comportamentais ou testaram especificamente o ambiente do hospedeiro e do doador no desenvolvimento global do cérebro. Esta é uma consideração importante no planejamento de experimentos usando essas abordagens embriológicas e a viabilidade deve ser equilibrada com rigor. Por exemplo, a exigência de excluir as células presuntivas da crista neural criou obstáculos significativos a serem superados. Os transplantes tiveram que ser realizados em embriões em estágio inicial de neurula. Nessas fases, a endoderme encontra-se imediatamente adjacente ao local do transplante, e foi necessário extremo cuidado para não lesar a endoderme, pois isso reduz a sobrevida. Embora não esteja claro se a contaminação do enxerto pela endoderme afetaria as medidas de desfecho, o objetivo foi isolar exclusivamente o efeito do prosencéfalo ventral no desenvolvimento facial. Assim, para isso justificava-se o rigor extra.
É necessário ter em conta a taxa de desenvolvimento das espécies hospedeiras e dadoras. Embora diferenças nas taxas desses animais tenham sido usadas como vantagem na avaliação do papel das células da crista neural na padronização do esqueleto facial em desenvolvimento19,20, neste caso, o tecido neural de codorna de desenvolvimento mais rápido criou embriões extremamente malformados quando transplantados para o pato de desenvolvimento mais lento. Isso significava que o quimerismo e a contaminação tinham que ser avaliados em outro conjunto de quimeras criadas pelo enxerto de tecido de codorna em hospedeiros pintinhos e, embora não fosse o ideal, isso forneceu confiança na técnica de enxertia.
Em geral, a criação de quimeras para avaliar as interações teciduais durante o desenvolvimento pode ser uma abordagem poderosa para ajudar a entender os mecanismos de desenvolvimento. É preciso ter cuidado durante as etapas de planejamento para garantir que os resultados sejam o mais conclusivos possível, e controles apropriados devem ser determinados que incluam embriões normais e outras quimeras para explicar a variação devido à cirurgia. Nesse caso, foi muito importante empregar análises quantitativas, pois as mudanças observadas foram sutis.
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Disclosures
Todos os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de prêmio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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