Summary
Denne artikkelen beskriver en vevstransplantasjonsteknikk som ble designet for å teste signalerings- og mønsteregenskapene til basal forhjerne under kraniofacial utvikling.
Abstract
Fugleembryoet har blitt brukt som modellsystem i mer enn et århundre og har ført til grunnleggende forståelse av virveldyrutvikling. En av styrkene til dette modellsystemet er at effekten av og interaksjonen mellom vev kan vurderes direkte i kimære embryoer. Vi har tidligere vist at signaler fra forhjernen bidrar til ansiktsmorfogenese ved å regulere formen på uttrykksdomenet til Sonic hedgehog (SHH) i Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). I denne artikkelen beskrives metoden for å generere forhjernekimærene og gi illustrasjoner av resultatene av disse forsøkene.
Introduction
Mye moderne forskning innen utviklingsbiologi fokuserer på genenes rolle i å forme embryoer. Det finnes gode verktøy for å undersøke utviklingsmekanismer fra et genetisk perspektiv. Imidlertid er embryoer samlet og gjennomgår morfogenese som respons på vevsinteraksjoner. Fuglesystemet er et klassisk verktøy som brukes til å vurdere ulike vevsinteraksjoner som regulerer utviklingen av følgende grunner: embryologien er godt forstått, embryoene er lett tilgjengelige, verktøy for analyse av aviære systemer er godt utviklet, og embryoene er billige.
Fugletransplantasjonssystemet har vært mye brukt for avstamningssporing og for å vurdere vevsinteraksjoner under utvikling i nesten et århundre 1,2,3,4. Dette systemet ble brukt til å undersøke et signalsenter, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), som regulerer morfogenese i overkjeven5, og en video ble publisert som beskriver denne teknikken tidligere6. I tillegg til vaktelkylling har andre arter også blitt brukt til å produsere kimærer for analyse av vevsinteraksjoner. For eksempel ble musen FEZ transplantert fra vill type7 og mutante mus8, og andre har brukt et ande-, vaktel- og kyllingsystem for å vurdere rollen som nevralkam i mønster av ansiktsskjelettet 9,10,11,12.
I dette arbeidet ble forhjernens rolle i å regulere mønsteret av genuttrykk i FEZ ved å transplantere den ventrale forhjernen gjensidig blant vaktel-, and- og kyllingembryoer vurdert, fordi et signal fra forhjernen er nødvendig for å indusere Sonic pinnsvinuttrykk i FEZ. Forhjernetransplantasjoner er ikke unike i feltet. Disse transplantasjonene ble brukt til å vurdere utviklingen av motilitet i vaktel- og andeembryoer13, men i disse forsøkene ble vev som bidro til ikke-nevrale derivater også transplantert. I annet arbeid har hørselskretser hos fugler blitt vurdert ved hjernetransplantasjon14, men disse transplantasjonene inneholdt presumptive nevrale kamceller, som bidrar til ansiktsform 9,10 og deltar i regulering av SHH-uttrykk i FEZ 15. Derfor ble det utviklet et system for å transplantere bare den ventrale forhjernen fra en fugleart til en annen før lukking av nevralrøret for å vurdere hjernens rolle i ansiktsform16 (figur 1A,B). Denne metoden var blottet for nevralkamforurensning av transplantatet. I denne artikkelen illustreres metoden og de forventede resultatene beskrives, og utfordringene drøftes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hvit pekinand (Anas platyrhynchos), hvit leghornkylling (Gallus gallus) og japansk vaktel (Cortunix coturnix japonica) ruges ved 37 °C i et fuktet kammer til den matches på HH7/817.
1. Klargjøring av donorvevet
MERK: Fremstilling av reagenser og verktøy og hvordan man åpner egg for eksperimentell manipulasjon er beskrevet6.
- Forbered DMEM-medier med nøytral rød, en glassoverføringspipette og skjerpede wolframnåler.
- Utsett embryoer (som vist i6).
- Høst vevstransplantater fra venstre side av basal forhjerne av stadium 7/8 embryoer. Bruk buede skjerpede wolframnåler6 for å forsiktig snitte et stykke av forhjernen som måler ~ 0,3 mm i lengde med 0,2 mm i bredden, og pass på at du ikke inkluderer den underliggende endoderm ved å skyve nålen under forhjernen slik at nålen er parallell med aksen til nevrale røret.
- Bruk glassoverføringspipetten til å plukke opp transplantatet fra donorembryoet.
- Overfør transplantatet til DMEM som inneholder nøytral rød (0,01 % i PBS, 23 °C) i 2 minutter for å flekke det, og legg deretter det fargede transplantatet i DMEM som ikke inneholder nøytral rød før det er klart for transplantasjon.
2. Forbereder verten
- Inkuber befruktede egg fra hvit leghornkylling (Gallus gallus) ved 37 °C i et fuktet kammer til HH7/8 17.
- Utsett embryoer (som vist i6).
- Ved hjelp av skjerpet wolfram nåler, forberede graft stedet ved forsiktig kutte, deretter fjerne en 0,3 mm ved 0,2 mm stykke basal forhjernen fra venstre side for å imøtekomme graft som ble gjort for å isolere donor vev.
- Pass på å unngå overdreven forstyrrelse av den underliggende endodermen, noe som vil være tydelig da eggeplommegranulater vil begynne å lekke gjennom enhver tåre som er laget. Dette krever øvelse, og ikke alle forsøk vil lykkes.
- Etter overføring til verten6, plasser transplantatet for å erstatte den utryddede basale forhjernen til verten.
- Plasser tape tett over hullet og returner embryoet til 37 ° C inkubatoren for riktig tid for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering av kimerisme og transplantasjonsforurensning
For å vurdere kimærene, bør omfanget av kimerisme og forurensning av transplantatet med andre celletyper behandles. Å lage kimærer ved å transplantere vaktelvev i kyllingembryoer muliggjør denne typen analyse. Ved hjelp av QCPN-antistoffet kan vaktelceller visualiseres og skilles fra vertsvevet (figur 1 C,D). I dette tilfellet ble bare vev avledet fra den ventrale forhjernen farget med antistoffet, noe som indikerer at transplantatet ikke var forurenset med andre celletyper, inkludert nevrale kam. Omfanget av kimerisme kan estimeres fra disse seksjonene ved hjelp av stereologi for enten å telle verts- og donorceller eller ved å vurdere området okkupert av donor- og vertsvev.
Vurdering av morfologiske og molekylære utfall
Målet var å vurdere virkningen av den ventrale forhjernen på ansiktsmorfologi og SHH-uttrykk i FEZ. I utgangspunktet ble vaktelvev transplantert i andeembryoer for å bruke QCPN til å vurdere kimerisme som beskrevet ovenfor. Den raskere utviklende vaktelhjernen førte imidlertid til alvorlig deformerte kimærer (figur 2), noe som utelukket denne tilnærmingen i forsøkene. På grunn av denne begrensningen ble transplantasjon av andevev i kyllingembryoer brukt til eksperimentell analyse. Selv om dette ikke tillot vurdering av kimerisme, ble vaktelkyllingsystemet brukt til å gjøre dette og bekreftet at alle transplantatene bare besto av nevralvev16. De resulterende andekyllingkimærene hadde morfologiske forandringer som antydet at hjernen deltok i regulering av morfologi (figur 3). Andesiden av transplantasjonen så ut til å utvikle seg langsommere og virket mer andelignende. En kvantitativ analyse ble brukt til å bestemme at disse kimærene ble forskjøvet mot andemorfologi16. Som kontroller ble scenen matchet ande- og kyllingembryoer, samt kylling-kyllingkimærer brukt.
Hele mount in situ hybridisering ble brukt til å vurdere SHH uttrykk. I likhet med morfologien fremsto SHH-uttrykket på andesiden av kimæren mer andelignende (figur 3). En kvantitativ analyse18 ble også brukt for å vise at dette uttrykksdomenet var korrelert med hodeform16.
Figur 1. Transplantasjon og vurdering av kimerisme i eksperimentelle embryoer
(A) Dorsal visning av stadium 8 kyllingembryo farget med nøytral rød som viser plasseringen av transplantatet og engraftment stedet. Stiplet linje er omtrentlig nivå vist i B. (B) Tverrsnitt gjennom et stadium 8 kyllingembryo etter in situ hybridisering for å vise SHH-uttrykk . Den omtrentlige plasseringen av transplantatet er vist, rød stiplet boks. (C) Immunfarging for å oppdage QCPN i vaktelkyllingkimærer viser at transplantatet er utbredt og bare bidrar til ventro-laterale nevrale rør (pil) og ventral optisk kopp (pilspiss). (D) Høyere forstørrelse i C. Skalastenger: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Vurdering av morfologi av vaktelandkimærer.
(A, B) To eksempler på vaktel-and-kimærer på stadium 22. Disse embryoene har alvorlige misdannelser som utelukker videre analyse. Skala bar: 2 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Vurdering av ande-chick kimærer.
(A) Normal kylling og (B) andeembryoer på stadium 22 etter hel montering in situ hybridisering for å visualisere SHH uttrykk. (C) En kylling-kylling-kontroll viser et mønster av SHH og morfologi som ligner et normalt kyllingembryo. (D) En and-chick chimera viser et endret mønster av SHH uttrykk. På den transplanterte siden er SHH-uttrykk (gul stiplet linje) mer avrundet og ligner andemønsteret. Nesegropen er også mer avrundet på den transplanterte siden (gul pil) sammenlignet med det mer "spalte" utseendet på vertssiden (rød pil). Den røde linjen indikerer midtlinjen og transplantasjonen er på høyre side av bildet. Skala bar: 1 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metoden tillater undersøkelse av vevsinteraksjonene mellom den basale forhjernen og den tilstøtende ektodermen. Denne tilnærmingen skiller seg fra tidligere forhjernetransplantasjonsmetoder, fordi donorvevet var begrenset til den ventrale forhjernen. Dette eliminerer transplantasjon av nevrale kamceller, som har vist seg å delta i mønster ansikts morfologi 9,10. Derfor var det viktig å begrense transplantatet til basal forhjerne for å evaluere de eksperimentelle resultatene som var planlagt.
I den forrige undersøkelsen som benyttet forhjernetransplantasjoner13,14 forstyrret tilstedeværelsen av ekstranevrale vev ikke tolkningen av de planlagte utfallsmålene, fordi resultatene enten var atferdsmessige eller spesifikt testet verts- og donormiljøet på generell hjerneutvikling. Dette er en viktig faktor i utformingen av eksperimenter ved hjelp av disse embryologiske tilnærmingene, og gjennomførbarheten må balanseres med strenghet. For eksempel skapte kravet om å ekskludere de presumptive nevrale kamcellene betydelige hindringer for å overvinne. Transplantasjonene måtte utføres på embryoer på tidlig nervestadium. På disse stadiene er endoderm umiddelbart ved siden av transplantasjonsstedet, og ekstrem forsiktighet måtte utvises for å unngå å skade endodermen, fordi dette reduserer overlevelsen. Selv om det ikke er klart at forurensning av transplantatet av endoderm ville påvirke utfallsmål, var målet å utelukkende isolere effekten av den ventrale forhjernen på ansiktsutvikling. Så for dette formålet var den ekstra strengheten berettiget.
Det må tas hensyn til utviklingshastigheten til verts- og donorartene. Mens forskjeller i frekvensen av disse dyrene har blitt brukt til fordel for å vurdere rollen som nevrale kamceller i mønster av det utviklende ansiktsskjelettet19,20, i dette tilfellet skapte det raskere utviklende vaktelnevrale vevet ekstremt misdannede embryoer når de ble transplantert i den langsommere utviklende anden. Dette betydde at kimerisme og forurensning måtte vurderes i et annet sett med kimærer opprettet ved poding av vaktelvev i kyllingverter, og selv om det ikke var ideelt, ga dette tillit til podeteknikken.
Samlet sett kan det å skape kimærer for å vurdere vevsinteraksjoner under utvikling være en kraftig tilnærming for å forstå utviklingsmekanismer. Forsiktighet må gis i planleggingsfasen for å sikre at resultatene vil være så avgjørende som mulig, og passende kontroller bestemmes som inkluderer normale embryoer og andre kimærer for å ta hensyn til variasjon på grunn av kirurgi. I dette tilfellet var det svært viktig å bruke kvantitative analyser, fordi de observerte endringene var subtile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Dental and Craniofacial Research av National Institutes of Health under tildelingsnummer R01DE019648, R01DE018234 og R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
