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Developmental Biology

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Abstract

La generación de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de una sola extracción de sangre ha atraído un gran interés en la medicina de precisión sobre las enfermedades cardiovasculares. La diferenciación cardíaca de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) está modulada por vías de señalización definidas que son esenciales para el desarrollo del corazón embrionario. Se han desarrollado numerosos métodos de diferenciación cardíaca en plataformas 2-D y 3-D con diversas eficiencias y rendimiento de cardiomiocitos. Esto ha desconcertado a los investigadores fuera del campo, ya que la variedad de estos métodos puede ser difícil de seguir. Aquí presentamos un protocolo integral que elabora una generación y expansión robustas de cardiomiocitos específicos del paciente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Primero describimos un protocolo de reprogramación iPSC de alta eficiencia a partir de la muestra de sangre de un paciente utilizando vectores del virus de Sendai no integrados. A continuación, detallamos un pequeño método de diferenciación monocapa mediado por moléculas que puede producir cardiomiocitos de latido robusto a partir de la mayoría de las líneas iPSC humanas. Además, se introduce un protocolo de expansión de cardiomiocitos escalable utilizando una molécula pequeña (CHIR99021) que podría expandir rápidamente los cardiomiocitos derivados del paciente para aplicaciones de grado industrial y clínico. Al final, se representan protocolos detallados para la identificación molecular y la caracterización electrofisiológica de estos iPSC-CM. Esperamos que este protocolo sea pragmático para principiantes con conocimientos limitados sobre desarrollo cardiovascular y biología de células madre.

Introduction

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas por humanos ha revolucionado la medicina cardiovascular moderna1,2. Las iPSC humanas son capaces de autorrenovarse y generar todos los tipos de células en el corazón, incluidos los cardiomiocitos, las células endoteliales, las células del músculo liso y los fibroblastos cardíacos. Los cardiomiocitos derivados de iPSC para pacientes (iPSC-CM) pueden servir como recursos indefinidos para modelar enfermedades cardiovasculares genéticamente hereditarias (ECV) y probar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos3. En particular, los iPSC-CM de los pacientes están bien preparados para investigar etiologías genéticas y moleculares de las ECV que se derivan de defectos en los cardiomiocitos, como el síndrome de QT largo4 y la miocardiopatía dilatada (DCM)5. Combinados con la edición del genoma mediada por CRISPR / Cas9, los iPSC-CM de los pacientes han abierto una vía sin precedentes para comprender la compleja base genética de las ECV, incluidos los defectos cardíacos congénitos (CHD)6,7,8. Los iPSC-CM humanos también han exhibido potenciales para servir como fuentes de células autólogas para reponer el miocardio dañado durante un ataque cardíaco9. En los últimos años, se ha vuelto primordial generar iPSC-CM humanos de alta calidad con subtipos definidos (auricular, ventricular y nodal) para la regeneración cardíaca y las pruebas de drogas10.

La diferenciación cardíaca de las iPSC humanas ha avanzado mucho en la última década. Los métodos de diferenciación han pasado de la diferenciación espontánea basada en el cuerpo embrionario (EB) a la diferenciación cardíaca químicamente definida y dirigida11. Las moléculas de señalización clave esenciales para el desarrollo embrionario del corazón, como Wnt, BMP, Nodal y FGF, se manipulan para mejorar la diferenciación de los cardiomiocitos de las iPSC humanas10,12. Los avances significativos incluyen la modulación secuencial de la señalización Wnt (activación seguida de inhibición) para la generación robusta de cardiomiocitos a partir de iPSCs humanas13,14. Se han explorado recetas de diferenciación cardíaca definidas químicamente para facilitar la producción a gran escala de cardiomiocitos de latido15,16, que tienen el potencial de actualizarse a la producción a nivel industrial y clínico. Además, la expansión robusta de los primeros iPSC-CM humanos se logra mediante la exposición a la activación constitutiva de Wnt utilizando un pequeño producto químico (CHIR99021)17. Más recientemente, los cardiomiocitos específicos del subtipo se generan a través de la manipulación de las vías de señalización de ácido retinoico (AR) y Wnt en ventanas de diferenciación específicas durante el compromiso del linaje de cardiomiocitos de iPSCs humanas18,19,20,21,22.

En este protocolo, detallamos un procedimiento de trabajo para la generación robusta y proliferación de CM humanos originados en células mononucleares de sangre periférica del paciente. Presentamos protocolos para 1) reprogramar PBMC humanos a iPSCs, 2) generación robusta de cardiomiocitos de latidos a partir de iPSCs humanos, 3) expansión rápida de iPSC-CMs tempranos, 4) caracterización molecular de iPSC-CMs humanos, y 5) medición electrofisiológica de iPSC-CM humanos a nivel de una sola célula por pinza de parche. Este protocolo cubre los procedimientos experimentales detallados para convertir las células sanguíneas de los pacientes en cardiomiocitos que golpean.

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Protocol

Los protocolos experimentales y el consentimiento informado para sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Nationwide Children's Hospital.

1. Preparación de medios de cultivo celular, soluciones y reactivos

  1. Preparar medios PBMC
    1. Mezclar 20 ml de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0,52 ml de suplemento. Añadir 20 μL de SCF y FLT3 cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 y EPO cada uno (concentración de stock: 100 μg/mL) y 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtrar en una campana estéril utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra esto como Medios de Sangre Completos.
    2. Mezclar 20 mL de medios de cultivo PBMC basales (1x) y 0.52 mL del Suplemento. Añadir 200 μL de L-glutamina alternativa (100x). Mézclalos bien. Filtre con una unidad de filtro de 0,22 μm. Nombra esto como Suplemento de Medios sanguíneos.
  2. Preparar medios E8 completos
    1. Mezcle 500 ml de medios basales E8 y 10 ml de suplemento de E8 (descongelado durante la noche a 4 ° C) para hacer medios E8 completos. Equilibre a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
  3. Preparar medios de paso de iPSC
    1. Añadir 40 μL de inhibidor de roca Y-27632 (dilución 1:5.000, concentración de stock: 10 mM) a 200 mL de medio E8 completo. Mézclalo bien. Equilibrar a RT antes de usar.
  4. Preparar medios de diferenciación de cardiomiocitos
    1. Media I: Mezclar 500 mL de RPMI1640 con 10 mL de B27 menos suplemento de insulina (50x).
    2. Medio II: Añadir un volumen apropiado de material CHIR99021 (inhibidor de GSK3) al Medio I (concentración final de CHIR99021 de 6 μM). Homogeneizar.
    3. Medio III: Añadir un volumen apropiado de material IWR-1 (inhibidor de Wnt) a Media I (concentración final de IWR-1 de 5 μM). Homogeneizar.
    4. Media IV: Mezclar 500 mL de RPMI1640 con 10 mL de suplemento de B27 (50x). Homogeneizar.
    5. Media V: Mezclar 500 mL de RPMI1640 (sin glucosa) con 10 mL de suplemento de B27 (50x). Homogeneizar.
    6. Medio VI: Añadir un volumen apropiado de material CHIR99021 a la Media IV (concentración final chiR99021 de 2 μM). Homogeneizar.
  5. Preparar medios de paso iPSC-CM
    1. Agregue 10 ml de reemplazo sérico knockout (KSR) a 90 ml de media IV (concentración final de KSR: 10%). Mezclar bien.
  6. Preparar medios de congelación iPSC-CM
    1. Agregue 1 ml de DMSO a 9 ml de KSR (concentraciones finales: 10% DMSO/ 90% KSR) y mezcle bien.
  7. Preparar placas de matriz de membrana basal de recubrimiento medio
    1. Descongelar el medio de matriz de membrana basal a 4 °C durante la noche y alícuota en tubos de 1,5 ml. Agregue 1 ml de este medio a 250 ml de medios DMEM/F12 (dilución 1:250) y mézclelos bien. Aplicar 2 ml de la solución diluida por pocillo en una placa de 6 pocillos e incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante 30 min antes de su uso.

2. Reprogramación iPSC de PBMC

  1. Separe los PBMC de las muestras de sangre.
    1. Recolectar muestras de sangre del paciente (~5 ml) y transferirlas a tubos de separación de células sanguíneas (ver Tabla de materiales). Mezclar invirtiendo 10x.
    2. Centrifugar a 1.500 x g durante 30 min a temperatura ambiente.
    3. Saque los tubos con cuidado y rocíe con etanol al 70%. Bajo una capucha de bioseguridad, retire las tapas sin perturbar las células mononucleares (capa buffy). Los PBMC estarán en una capa blanquecina justo debajo de la capa de plasma(Figura 1A). Recoge toda la capa buffy usando una pipeta de 1000 μL y transfiérela a un tubo cónico de 15 mL.
    4. Cuente el número de celda utilizando un contador de celda automatizado. Gire el tubo a 300 x g durante 25 min en RT.
    5. Deseche el sobrenadante. Lavar con 10 mL de DPBS (Ca2+/Mg2+ libre).
    6. Gire el tubo a 300 x g durante 15 min en RT.
    7. Retire el sobrenadante. Pellets de células de resuspend en 1 ml del medio de congelación (KSR más 10% DMSO). Ajuste la densidad celular para hacer 1 x 106 células por vial.
    8. Coloque los crioviales de PBMC en un recipiente de congelación celular y manténgalos a -80 °C durante la noche. Transfiera a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo al día siguiente.
  2. Reprogramación de iPSC.
    1. Agregue 3 ml de suplemento de medios sanguíneos en un tubo cónico de 15 ml. Descongele los PBMC en un baño de agua a 37 °C y transfiéralos a un tubo cónico. Girar a 300 x g durante 7 min en RT.
    2. Deseche el sobrenadante. Resuspend PBMCs con medios sanguíneos completos. Sembrarlos en dos pocillos de 24 placas de cultivo de tejido de pocillos (sin matriz de membrana basal).
    3. Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche. Al día siguiente retire suavemente la mitad de los medios viejos (0,5 ml) y agregue 0,5 ml de medios sanguíneos completos frescos.
    4. Cambie los medios cada dos días refrescando la mitad de los viejos medios.
    5. Después de una semana, lave agresivamente el pozo con 1 ml de suplemento de medios sanguíneos y transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml.
    6. Cuente el número de celda. Tomar 2 x 105 células y centrifugar a 300 x g durante 7 min.
    7. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con 300 μL de medios sanguíneos completos. Realice la transfección agregando el volumen apropiado de vectores de reprogramación del virus Sendai de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transfiéralos a un pocillo de una placa de 24 pocillos (sin matriz de membrana basal). Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche.
    8. Al día siguiente girar a 300 x g durante 7 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 2 ml de medios sanguíneos completos. Transfiera a un pozo de una placa de 6 pocillos pre-recubierta con matriz de membrana basal. Este es el día 1 (D1).
    9. No toques el plato al día siguiente.
    10. En D3, elimine 1 ml de los medios antiguos. Agregue 1 ml de suplemento de medios sanguíneos.
    11. Repita el paso 2.2.10 en D5.
    12. En D7, elimine 1 ml de los medios antiguos. Agregue 1 ml de medios E8 completos.
    13. En D8, repita el paso 2.2.12.
    14. En D9, quite los medios antiguos. Agregue 2 ml de medios E8 completos. Se espera que las células completamente reprogramadas se adhieran y comiencen a formar colonias.
    15. Actualice con 2 ml de medios E8 completos todos los días.
    16. Alrededor de 2 semanas después de la transducción del virus de Sendai, aparecerán grandes colonias de iPSC y estarán listas para la recolección.
    17. Corte las colonias de iPSC bajo un estereomicroscopio en la campana y transfiera colonias individuales a una placa de 24 pocillos recubierta de matriz de membrana basal precargada con 0,5 ml de medios de paso iPSC.
    18. Actualice con 0,5 ml de medios E8 completos todos los días hasta que las colonias de iPSC crezcan lo suficientemente grandes como para pasar a una nueva placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal.

3. Mantenimiento y pase de iPSC humano

  1. Cuando las iPSC humanas alcancen más del 90% de confluencia, elimine los medios antiguos. Enjuague con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Agregue 1 ml de EDTA de 0,5 mM en la solución DPBS. Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 5-8 min.
  3. Eliminar el EDTA por aspiración. Agregue 1 ml de medios de paso iPSC. Desaloje manualmente las iPSC.
  4. Tome 600-900 μL de suspensión de una sola célula y vuelva a placas en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal (dilución: 1: 6 a 1: 10). Incubar en 5% de CO2 a 37 °C durante la noche.
  5. Actualice con 2 ml de medios E8 completos todos los días. Los cultivos iPSC suelen alcanzar la confluencia después de 3-4 días.

4. Diferenciación de cardiomiocitos definida químicamente

  1. Cultive iPSCs humanas en medios E8 completos hasta un 95% de confluencia (3-4 días).
  2. Elimine los medios antiguos. Agregue 2 ml de diferenciación de CM Media II (6 μM CHIR en RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Esto es D0. No toque D1.
  3. En D2, reemplace con 2 ml de diferenciación de CM Media I (RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina).
  4. En D3, reemplace con 2 ml de diferenciación de CM Media III (5 μM IWR-1 en RPMI1640 más B27 menos suplemento de insulina). No toque D4.
  5. En D5, sustituir por 2 mL de diferenciación CM Media I.
  6. En D7, reemplace con 2 ml de CM diferenciación Media IV (RPMI1640 más suplemento B27). A partir de entonces, actualice los medios de comunicación cada dos días.
  7. En D11 cuando se observen células contraídas, sustituir por 2 mL de diferenciación cm Media V (sin glucosa).
  8. En D13, reemplace con 2 ml de diferenciación CM Media V.
  9. En D15, sustituir por 2 mL de diferenciación CM Media IV.
  10. En D17-D21, reemplace con 2 ml de diferenciación CM Media IV cada dos días.

5. Paso humano iPSC-CMs

  1. Retire los medios viejos y enjuague las células con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Aplique 1 ml de solución de disociación CM (ver Tabla de materiales)a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 5-8 min.
  3. Disociar mecánicamente iPSC-CM en células individuales mediante pipeteo vigoroso.
  4. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 2 ml de medios de paso cm (10% KSR en RMPI1640 más suplemento B27) para neutralizar la solución de disociación CM.
  5. Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
  6. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con un volumen deseado de medios de paso CM. Sembrarlos en una placa / plato recubierto de matriz de membrana basal. Los iPSC-CM humanos reanudan la latir 1-3 días después de la transmisión.

6. Expansión de los iPSC-CM humanos

  1. Enjuague D10-12 batiendo iPSC-CM con 3 ml de DPBS por cada pocillo de una placa de 6 pocillos una vez. Añadir 1 ml de solución de disociación de CM (paso 5.2). Incubar en 5% CO2 a 37 °C durante 7-10 min.
  2. Disociar mecánicamente iPSC-CM en células individuales mediante pipeteo vigoroso.
  3. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 2 ml de medios de paso de CM para neutralizar la solución de disociación de CM.
  4. Girar a 300 x g durante 5 min en RT.
  5. Deseche el sobrenadante. Resuspend células con un volumen apropiado de medios de paso CM. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para hacer suspensión de una sola celda. Sembra un millón de iPSC-CM en un plato de 10 cm recubierto de matriz de membrana basal.
  6. Al día siguiente retire los medios antiguos. Añadir 10 ml de medios de proliferación de cardiomiocitos (Media VI: 2 μM CHIR99021). Cambia los medios de comunicación cada dos días.
  7. Cuando los iPSC-CM se vuelvan confluentes después de 7-9 días de cultivo, repita el paso de paso para una mayor expansión de los iPSC-CM.

7. Inmunofluorescencia

  1. Antes de la tinción por inmunofluorescencia, sembra iPSC-CM en cubiertas recubiertas de matriz de membrana basal que se colocan en una placa de 24 pocillos (densidad de siembra: 0.5-1 x 106 células / ml). Mantenga iPSC-CM en cultivo durante al menos 4 días.
  2. Lave las células con 1 ml de DPBS una vez.
  3. Añadir 0,5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) e incubar durante 15 min a RT.
  4. Lavar las células con 1 ml de DPBS. Repita una vez.
  5. Añadir 0,5 mL de Tritón X-100 al 0,1% e incubar durante 20 min en RT.
  6. Lavar con 1 ml de DPBS dos veces.
  7. Añadir 0,5 mL de BSA al 0,2% en DPBS (solución de bloqueo). Incubar en RT durante 1 h.
  8. Añadir 200 μL de anticuerpo primario diluido con solución bloqueadora (dilución: 1:400-1:1000). Incubar a 4 °C durante la noche.
  9. Lave las células con 0,5 ml de solución bloqueadora durante 3 min con agitación. Repetir dos veces.
  10. Añadir 200 μL de anticuerpo secundario diluido en la solución bloqueadora. Incubar en RT durante 1 h.
  11. Enjuague las células tres veces con 0,5 ml de DPBS, cada una durante 3 minutos con agitación.
  12. Contratinúe núcleos con DAPI (dilución 1:2000) e incube durante 5 min a RT.
  13. Enjuague las células tres veces con 0,5 ml de DPBS.
  14. Monte células en las latas en un portaobjetos de microscopio utilizando 5 μl de medios de montaje. Conservar a 4 °C y proteger de la luz.

8. Preparación de muestras de citometría de flujo

  1. Lave los iPSC-CM humanos con 3 ml de DPBS una vez.
  2. Añadir 1 ml de solución de disociación de CM e incubar en CO2 al 5% a 37 °C durante 7-10 min.
  3. Desaloje las células con una pipeta de 1.000 μL. Transfiera la suspensión celular a un tubo REDONDO FACS a través de una tapa de colador. El tubo FACS se rellena previamente con 1 ml de medios de paso iPSC-CM (10% KSR) para neutralizar la actividad enzimática.
  4. Girar a 300 x g durante 5 min.
  5. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita celular. Añadir 250 μL de solución de fijación/permeabilización (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 20 min a 4 °C.
  6. Añadir 1 ml de tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente y gire a 300 x g durante 4 min.
  7. Deseche el sobrenadante. Añadir 100 μL de anticuerpos primarios diluidos (1:200-1:500) en 1x tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente e incube durante la noche a 4 °C.
  8. Lave las células agregando 1 ml de tampón Perm/Wash. Vórtice brevemente y gire a 300 x g durante 4 min.
  9. Deseche el sobrenadante. Añadir 100 μL de anticuerpos secundarios diluidos (1:500-1:1.000). Vórtice brevemente e incube en RT durante 1 h. Proteger de la luz si los anticuerpos secundarios se conjugan con fluorescencia sensible a la luz.
  10. Lave las células agregando 1 ml de tampón Perm/wash. Vórtice brevemente y gire a 300 g durante 4 min.
  11. Deseche el sobrenadante. Células resuspend con 400 μL de tampón de tinción FACS (PBS/4% FBS). Conservar a 4 °C hasta su carga en un instrumento FACS.

9. qPCR en tiempo real

  1. Elimine los medios antiguos en la cultura iPSC-CM humana. Agregue 500-700 μL de tampón de lisis a las células lisadas. Incubar durante 3 min en RT. Lisado de células scape y transferir a un tubo libre de RNasa de 1,5 ml. Proceda a la extracción total de ARN inmediatamente o almacene a -80 °C.
  2. Aísle el ARN total utilizando un kit de extracción de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Medir la concentración de ARN y evaluar la calidad del ARN total mediante un espectrofotómetro.
  4. Realice una reacción de transcripción inversa utilizando un kit de síntesis de ADNc. El volumen total de la reacción RT es de 20 μL, incluyendo 4 μL de mezcla de reacción (5x), 1 μL de transcriptasa inversa, 1 μg de ARN total y agua libre de RNasa.
  5. Incubar la mezcla completa de reacción RT en un termociclador utilizando el siguiente protocolo: 25 °C durante 5 min; 46 °C durante 20 min; 95 °C durante 1 min; mantener a 4 °C.
  6. Diluya el ADNc en 1:10 usando agua libre de nucleasas. Configure la reacción qPCR en tiempo real mezclando 1 μL de plantilla de ADNc, 1 μL de cebadores/sonda, 10 μL de mezcla maestra de qPCR y 8 μL de agua libre de nucleasas.
  7. Ejecutar en un sistema de PCR en tiempo real. El protocolo de ciclo es de 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 seg, 60 °C 1 min, repetir durante 40 ciclos.
  8. Recolectar valores de CT para cada gen en cada muestra. La abundancia relativa de ARNm se calcula restando el valor CT del gen objetivo del valor CT de un gen de limpieza. La expresión génica relativa se analiza mediante el método2 -ΔΔCT.

10. Grabación de abrazadera de parche de celda entera

  1. Disociar iPSC-CM en células individuales utilizando la solución de disociación de CM como se describió anteriormente.
  2. Células de semillas a baja densidad en cubiertas recubiertas de matriz de membrana basal. Cultivarlos durante 3-4 días en Media IV.
  3. Extraiga pipetas (resistencia 0.9-1.5 MΩ) de capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor horizontal de microelectrodos.
  4. Incubar células en solución de Tyrode (pH=7,35).
  5. Llene las pipetas con solución de electrodo (pH=7.3) compuesta por los siguientes productos químicos: 120 mM de ácido aspártico, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.3 mM Na-GTP, 14 mM de fosfocreatina, 4 mM de K-ATP y 2mM de creatina fosfoquinasa.
  6. Coloque las celdas en el modo de abrazadera actual utilizando un pulso de corriente de umbral diastólico de 1,5-2 5 ms a 1 Hz.
  7. Registre potenciales de acción (AP) utilizando un amplificador de microelectrodo y una placa de adquisición impulsada por software.

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Representative Results

Reprogramación de iPSC humanos desde PBMC
Después del precultivo con medios sanguíneos completos durante 7 días, los PBMC se vuelven grandes con núcleos y citoplasma visibles(Figura 1B),lo que indica que están listos para la transfección del virus. Después de la transfección con los factores de reprogramación del virus de Sendai, los PBMC se someterán a un proceso de reprogramación epigenética durante otra semana. Por lo general, obtenemos 30-50 colonias de iPSC de la transfección de 1 x10 5 PBMC y la eficiencia de reprogramación es de 0.03% -0.05%. Las células completamente reprogramadas se unirán y comenzarán a formar colonias cuando se introduzcan en el medio E8 completo(Figura 1C). Estas colonias tempranas de iPSC se expanden durante otros 7 días y luego se cortan mecánicamente y se recogen individualmente. Cada colonia de iPSC se transfiere a un pozo de una placa de 6 pocillos para establecer líneas iPSC individuales. Después de 4-5 pasajes, las colonias de iPSC se volverán puras con muy pocas células diferenciadas alrededor (Figura 1D). En esta etapa, la mayoría de las células en las colonias de iPSC son OCT4 y NANOG positivas(Figura 1E),demostrando su pluripotencia. Las líneas iPSC estables se establecen en el quinto pasaje.

Diferenciación cardíaca
El protocolo de diferenciación cardíaca se representa en la Figura 1F. La diferenciación cardíaca se inicia cuando las iPSC se mantienen durante al menos 10 pasajes. El grado de confluencia de iPSC es crítico cuando se aplica CHIR99021. La densidad celular es más del 90% confluente pero no sobreconfluente. Si las colonias de iPSC se llenan demasiado, comenzarán la diferenciación espontánea que afectará negativamente la eficiencia de diferenciación de cardiomiocitos dirigida. Los cardiomiocitos que golpean generalmente se observan después del día 12 de diferenciación (Video 1). La fecha en la que se produce el inicio de la paliza varía y depende de las líneas iPSC en uso. Después de la inanición y el replanteo de glucosa, los iPSC-CM muestran latidos espontáneos (Video 2) y estructura de sarcómero alineada con troponina T cardíaca intercalada (TNNT2) y α-actinina (Figura 1G-H). Además, la pureza de los iPSC-CMs es alta, con más del 93% de las células siendo TNNT2+ como lo muestra el análisis FACS(Figura 1I).

Aunque los iPSC-CM son relativamente inmaduros en comparación con los cardiomiocitos adultos, muestran potenciales de acción similares a los ventriculares y auriculares medidos por la pinza de parche de células enteras(Figura 2A,B). En una diferenciación cardíaca típica, los iPSC-CM del día 30 son una mezcla de subtipos ventriculares, auriculares y ganglionares, y los CM ventriculares representan la mayoría (60%, Figura 2C)utilizando el protocolo de diferenciación mencionado anteriormente(Figura 1F). Los diferentes protocolos de diferenciación producen porcentajes variables de subtipos de cardiomiocitos debido a la activación de distintas vías de señalización durante la determinación del linaje celular10. Los CM ventriculares están marcados con MYL2 (MLC2v, Figura 2D),mientras que los iPSC-CM auriculares están marcados por NR2F2 (COUP-TFII, Figura 2E). Estos marcadores están altamente expresados en iPSC-CM más maduros (>D30) en lugar de aquellos en etapa temprana.

Expansión de iPSC-CM mediante la activación de Wnt
En los mamíferos, los cardiomiocitos adultos no se dividen activamente para la autorrenovación. Este fenómeno también tiene lugar para los iPSC-CM humanos. Una vez madurado más allá de D30, la división celular de los iPSC-CM es un evento raro, lo que limita su capacidad para la producción en masa a nivel clínico e industrial. Para imitar el entorno de desarrollo durante la proliferación de cardiomiocitos embrionarios, activamos la vía Wnt por CHIR99021 para estimular la multiplicación de iPSC-CM tempranos. Los iPSC-CM D12-14 (después de la purificación por privación de glucosa) se siembran a una densidad baja en presencia de 2 μM CHIR99021. La activación de Wnt estimula la división celular de iPSC-CM y promueve la expresión de reguladores del ciclo celular como la ciclina D1(Figura 3A)que puede empujar el ciclo celular para avanzar a través de la fase G1. Curiosamente, CHIR99021 permite una proliferación robusta de iPSC-CM tempranos para 2 pasajes en comparación con los controles(Figura 3B). Sin embargo, la capacidad de proliferación de los iPSC-CM disminuye con el paso extensivo(Figura 3B),lo que es consistente con la proliferación cardíaca limitada y bien controlada durante el desarrollo embrionario del corazón. Además, no parece que CHIR99021 sea capaz de estimular la expansión de iPSC-CM más maduros cuando alcanzan más de 30 días de diferenciación y desarrollan estructuras estables de sarcómeros.

Figure 1
Figura 1: Reprogramación de iPSC humanos y diferenciación de cardiomiocitos. (A) Un diagrama esquemático que muestra la capa de PBMC después de la separación de las muestras de sangre del paciente. (B) Los PBMC ampliados están listos para la transfección. (C) Colonias humanas tempranas de iPSC. (D) Una línea iPSC establecida en el pasaje 5. (E) Las iPSC humanas son positivas para los marcadores de pluripotencia OCT4 (verde) y NANOG (rojo). Los núcleos están contrateñidos por DAPI (azul). (F) Visión general de un protocolo de diferenciación de cardiomiocitos. (G-H) La estructura del sarcómero de los iPSC-CM se revela por tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra TNNT2 (verde) y α-actinina (rojo). Los núcleos están contrateñidos por DAPI (azul). (I) Análisis FACS de iPSC-CM utilizando un anticuerpo contra TNNT2. Barras de escala: 200 μm (B-D), 50 μm (E y G) y 20 μm (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Subtipos de cardiomiocitos en iPSC-CMs humanos. (A-B) Duraciones potenciales de acción representativas para iPSC-CM similares a ventriculares (A) y auriculares (B). (C) Porcentajes representativos de subtipos similares a los ventrículos, auriculares y ganglionares en los iPSC-CM humanos. (D-E) Los iPSC-CM D30 se tiñen con anticuerpos contra el marcador de cardiomiocitos ventriculares MYL2(D)y el marcador auricular NR2F2(E). Las células se tiñen simultáneamente con un anticuerpo TNNT2. Los núcleos están contrateñidos por DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm (D-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Expansión de iPSC-CM humanos por activación de Wnt. (A) El porcentaje de iPSC-CM positivos de ciclina D1 aumenta en presencia de CHIR99021. Las células se tiñen dos veces con anticuerpos contra TNNT2 (rojo) y ciclina D1 (verde). Los núcleos están contrateñidos por DAPI (azul). (B) El número de células cambia de pliegue durante la expansión de iPSC-CM humanos con o sin CHIR99021 en los primeros 3 pasajes. El eje Y muestra los cambios en el pliegue del número de celda. CHIR99021 estimula la proliferación robusta de iPSC-CM tempranos. Barras de escala: 50 μm (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1. Superando a los iPSC-CM humanos en el día 18 de diferenciación. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 2. Vencer a los iPSC-CM humanos en el día 25 después de la purificación metabólica. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Durante la reprogramación de iPSC, es fundamental cultivar PBMC durante 1 semana hasta que se agranden con núcleos y citoplasma claros. Debido a que los PBMC no proliferan, un número de células apropiado para la transducción viral es importante para una reprogramación exitosa de iPSC. El número celular de PBMC, la multiplicidad de la infección (MOI) y el título del virus deben considerarse y ajustarse para alcanzar los resultados óptimos de transducción. Para la diferenciación cardíaca, la densidad de siembra inicial es crítica para que las iPSC alcancen más del 90% de confluencia el día en que se administra CHIR99021. Por un lado, si las iPSC son menos confluentes en el momento de la diferenciación cardíaca, CHIR99021 será tóxico y conducirá a una muerte celular sustancial. Por otro lado, si las iPSC son sobreconfluentes, sufrirán una diferenciación espontánea que comprometerá la eficiencia de la diferenciación cardíaca dirigida. Para la expansión de los iPSC-CM tempranos, se debe tener en cuenta el tiempo y la calidad de los cardiomiocitos. Los primeros iPSC-CM pueden multiplicarse robustamente solo cuando la pureza de los cardiomiocitos es lo suficientemente alta. Los no cardiomiocitos existentes en el cultivo también pueden proliferar en respuesta al tratamiento con CHIR99021, lo que afectará negativamente la proliferación de iPSC-CM tempranos. Además, es crucial estimular la expansión de los cardiomiocitos para el día 20 de la diferenciación. Una vez que los iPSC-CM pasen el día 30, será difícil para ellos reanudar una división robusta.

Las iPSC humanas se derivaron inicialmente de fibroblastos dérmicos y pulmonares a través de la transfección mediada por retrovirus1,2. Hay dos problemas principales con estos métodos de reprogramación que impiden el progreso en la traducción clínica de las iPSC del paciente: 1) el retrovirus se integra en el genoma del huésped introduciendo así posibles mutaciones genéticas; 2) los fibroblastos derivados del paciente requieren biopsias de piel que muchos pacientes pueden rechazar. En este protocolo, describimos un protocolo que utiliza virus de Sendai23 y PBMC comerciales sin integración para derivar de manera robusta las iPSC de los pacientes. Estas iPSC están libres de vectores de reprogramación exógenos y se pueden mantener con autorrenovación y pluripotencia indefinidamente. Además, las muestras de sangre de los pacientes se recogen fácilmente en los laboratorios clínicos. Nuestro protocolo es versátil y se puede utilizar para la producción en masa de iPSC específicas para pacientes y enfermedades para repositorios a gran escala y traducciones clínicas24.

La diferenciación robusta de cardiomiocitos se logra mediante la modulación secuencial de vías de señalización específicas durante la diferenciación cardíaca de las iPSC humanas. Las vías clave involucradas en la especificación y proliferación cardíaca incluyen Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF y ácido retinoico (RA) 10,12. Aquí presentamos un protocolo eficiente de diferenciación cardíaca por modulación secuencial de la señalización Wnt por pequeños químicos: primero la activación por CHIR99021 y luego la inhibición por IWR-113,14. Los productos químicos pequeños son estables y dan resultados de diferenciación consistentes en comparación con aquellos que utilizan factores de crecimiento. La mayoría de los iPSC-CM generados por este protocolo son cardiomiocitos similares a los ventrículos, mezclados con células auriculares y ganglionares. La generación de precisión de cardiomiocitos específicos de subtipo se logra a través del ajuste fino de los pasos de diferenciaciónposteriores 10,12. Por ejemplo, la adición de AR inmediatamente después del tratamiento con IWR-1 produce un alto porcentaje de cardiomiocitos auriculares, mientras que la inhibición de la AR promueve la generación de iPSC-CM similares a los ventrículos18,22. La activación de la señalización Wnt en una etapa posterior de la diferenciación promueve la inducción de células progenitoras cardíacas a cardiomiocitos similares a los ganglios19,21, lo cual es prometedor para la generación de células de marcapasos biológicos específicos del paciente.

Los iPSC-CM humanos son inmaduros y tienen una capacidad de proliferación limitada25. Durante el desarrollo cardíaco embrionario, la maduración procede mientras que la proliferación disminuye. Hay una ventana estrecha cuando los iPSC-CM pueden ser estimulados para una proliferación robusta, que refleja la expansión embrionaria de los cardiomiocitos. Aquí utilizamos un activador Wnt CHIR99021 para promover la proliferación de iPSC-CM tempranos durante un período limitado, lo cual es consistente con un informe reciente17. Se especula que la vía de señalización Wnt afecta la proliferación de cardiomiocitos posiblemente a través de la diafonía con múltiples vías aguas arriba como NOTCH e Hippo26,27. La señalización NOTCH promueve la proliferación de cardiomiocitos, mientras que la vía hippo restringe el crecimiento cardíaco y el tamaño del corazón28,29,30. Todavía se desconoce cómo la interacción entre NOTCH e Hippo determina la actividad de Wnt aguas abajo y ajusta un grado apropiado de proliferación cardíaca. Nuestro protocolo ha proporcionado un modelo interesante para la proliferación de cardiomiocitos para estudiar los mecanismos de enfermedad de los defectos cardíacos congénitos que son causados por la hipoplasia de los cardiomiocitos ventriculares, como el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS) y la atresia pulmonar con tabique ventricular intacto (PA-IVS).

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo Profesional 18CDA34110293 (M-T.Z.) de la American Heart Association (AHA), los premios AVIF y SVRF de La American Heart Association (M-T.Z.), las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH / NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 y R01HL096962 (I.D.). El Dr. Ming-Tao Zhao también recibió el apoyo de fondos iniciales del Instituto de Investigación Abigail Wexner en el Nationwide Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

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References

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Biología del desarrollo Número 168 células mononucleares de sangre periférica PBMC células madre pluripotentes inducidas por humanos iPSC diferenciación cardíaca reprogramación de iPSC expansión de cardiomiocitos.
Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes
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Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

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