Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att robust generera och expandera mänskliga kardiomyocyter från patientens perifera blod mononukleära celler.
Abstract
Att generera patientspecifika kardiomyocyter från en enda bloddragning har lockat ett enormt intresse för precisionsmedicin på hjärt-kärlsjukdom. Hjärtdifferentiering från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) moduleras av definierade signalvägar som är väsentliga för embryonal hjärtutveckling. Många hjärt differentiering metoder på 2D och 3D plattformar har utvecklats med olika effektivitet och kardiomyocyter avkastning. Detta har förbryllat utredare utanför fältet eftersom mångfalden av dessa metoder kan vara svår att följa. Här presenterar vi ett omfattande protokoll som utarbetar robust generering och expansion av patientspecifika kardiomyocyter från perifera blod mononukleära celler (PBMCs). Vi beskriver först en högeffektiv iPSC omprogrammering protokoll från en patients blodprov med hjälp av icke-integration Sendai virus vektorer. Vi beskriver sedan en liten molekylmedierad monolayer differentieringsmetod som robust kan producera slå kardiomyocyter från de flesta mänskliga iPSC-linjer. Dessutom introduceras ett skalbart kardiomyocytexpansionsprotokoll med hjälp av en liten molekyl (CHIR99021) som snabbt kan expandera patientbaserade kardiomyocyter för industriella och kliniska tillämpningar. I slutet avbildas detaljerade protokoll för molekylär identifiering och elektrofysiologisk karakterisering av dessa iPSC-CMs. Vi förväntar oss att detta protokoll ska vara pragmatiskt för nybörjare med begränsad kunskap om kardiovaskulär utveckling och stamcellsbiologi.
Introduction
Upptäckten av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller har revolutionerat modern kardiovaskulär medicin1,2. Mänskliga iPSCs kan självförnyelse och generera alla celltyper i hjärtat, inklusive kardiomyocyter, endotelceller, släta muskelceller och hjärtfibblaster. Patient iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) kan fungera som obestämda resurser för modellering av genetiskt ärftliga hjärt-kärlsjukdomar (CVD) och testning av hjärtsäkerhet för nya läkemedel3. I synnerhet är patientens iPSC-CMs väl satta för att undersöka genetiska och molekylära etiologier av CVDs som härrör från defekter i kardiomyocyter, såsom långt QT syndrom4 och dilaterad kardiomyopati (DCM)5. I kombination med CRISPR/Cas9-medierad genomredigering har patientens iPSC-CMs öppnat en aldrig tidigare skådad väg för att förstå den komplexa genetiska grunden för CVD inklusive medfödda hjärtfel (CHDs)6,7,8. Mänskliga iPSC-CMs har också uppvisat potentialer att fungera som autologa cellkällor för att fylla på det skadade hjärtmuskelt under en hjärtattack9. Under de senaste åren har det blivit av största vikt att generera högkvalitativa mänskliga iPSC-CMs med definierade undertyper (förmakstyp, ventrikulär och nodal) för hjärtregenerering och drogtestning10.
Hjärtdifferentiering från mänskliga iPSCs har utvecklats kraftigt under det senaste decenniet. Differentieringsmetoderna har gått från embryoidkropp (EB)-baserad spontan differentiering till kemiskt definierad och riktad hjärtdifferentiering11. Viktiga signalmolekyler som är väsentliga för embryonal hjärtutveckling, såsom Wnt, BMP, Nodal och FGF manipuleras för att förbättra kardiomyocytdifferentiering från mänskliga iPSCs10,12. Betydande framsteg inkluderar sekventiell modulering av Wnt-signalering (aktivering följt av hämning) för robust generering av kardiomyocyter från mänskliga iPSCs13,14. Kemiskt definierade hjärtdifferentieringsrecept har undersökts för att underlätta storskalig produktion av slå kardiomyocyter15,16, som har potential att uppgraderas till industriell och klinisk nivåproduktion. Dessutom uppnås en robust expansion av tidiga iPSC-CMs för personer genom exponering för konstituerande Wnt-aktivering med hjälp av en liten kemikalie (CHIR99021)17. Senast genereras subtypspecifika kardiomyocyter genom manipulering av retinsyra (RA) och Wnt-signalvägar vid specifika differentieringsfönster under kardiomyocytens härstamning från mänskliga iPSCs18,19,20,21,22.
I detta protokoll beskriver vi ett arbetsförfarande för robust generering och spridning av mänskliga CMs som härrör från patientens perifera blod mononukleära celler. Vi presenterar protokoll för 1) omprogrammering mänskliga PBMCs till iPSCs, 2) robust generation av slå kardiomyocyter från mänskliga iPSCs, 3) snabb expansion av tidiga iPSC-CMs, 4) molekylär karakterisering av mänskliga iPSC-CMs och 5) elektrofysiologisk mätning av mänskliga iPSC-CMs på encellsnivå med patch klämma. Detta protokoll täcker de detaljerade experimentella förfarandena för att omvandla patientens blodkroppar till att slå kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella protokollen och det informerade samtycket för människor godkändes av Institutional Review Board (IRB) vid Nationwide Children's Hospital.
1. Förberedelse av cellkulturmedier, lösningar och reagenser
- Förbereda PBMC-media
- Blanda 20 ml basal PBMC kulturmedia (1x) och 0,52 ml tillägg. Tillsätt 20 μL SCF och FLT3 vardera (lagerkoncentration: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 och EPO vardera (lagerkoncentration: 100 μg/ml) och 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Blanda dem noggrant. Filtrera i en steril huva med en 0,22-μm filterenhet. Namnge detta som Complete Blood Media.
- Blanda 20 ml basal PBMC kulturmedia (1x) och 0,52 ml av tillägget. Tillsätt 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Blanda dem noggrant. Filtrera med en filterenhet på 0,22-μm. Namnge detta som Supplement Blood Media.
- Förbereda kompletta E8-media
- Blanda 500 ml E8 basal media och 10 ml E8-tillägg (tinat över natten vid 4 °C) för att göra kompletta E8-media. Jämvikt till rumstemperatur (RT) före användning.
- Förbereda iPSC-passaging media
- Tillsätt 40 μL Y-27632 Rock inhibitor (1:5,000 utspädning, lagerkoncentration: 10 mM) till 200 ml komplett E8-media. Blanda det noggrant. Ekvilibrera till RT före användning.
- Förbereda differentieringsmedieringsmedium för kardiomyocyter
- Media I: Blanda 500 ml RPMI1640 med 10 ml B27 minus insulintillskott (50x).
- Media II: Tillsätt en lämplig volym CHIR99021 -bestånd (GSK3-hämmare) till Media I (CHIR99021 slutlig koncentration på 6 μM). Blanda ordentligt.
- Media III: Tillsätt en lämplig volym IWR-1 (Wnt inhibitor) lager till Media I (IWR-1 slutlig koncentration på 5 μM). Blanda ordentligt.
- Media IV: Blanda 500 ml RPMI1640 med 10 ml B27-tillägg (50x). Blanda ordentligt.
- Media V: Blanda 500 ml RPMI1640 (ingen glukos) med 10 ml B27-tillägg (50x). Blanda ordentligt.
- Media VI: Lägg till en lämplig volym chir99021-lager till Media IV (CHIR99021 slutlig koncentration på 2 μM). Blanda ordentligt.
- Förbereda iPSC-CM passaging media
- Tillsätt 10 ml knockout serumersättning (KSR) till 90 ml Media IV (KSR slutlig koncentration: 10%). Blanda väl.
- Förbereda frysmedium för iPSC-CM
- Tillsätt 1 ml DMSO till 9 ml KSR (slutliga koncentrationer: 10% DMSO/90% KSR) och blanda väl.
- Förbered källarmembranmatris medelstora plattor
- Tina källarmembranmatrismedium vid 4 °C över natten och alikvot i 1,5 ml rör. Tillsätt 1 ml dmem/F12-media (1:250 utspädning) och blanda dem noggrant. Applicera 2 ml av den utspädda lösningen per brunn i en 6-välplatta och inkubera i 5% CO2 vid 37 °C i 30 minuter före användning.
2. Omprogrammering av pbbc-nätverkskort
- Separera PBMCs från blodprover.
- Samla in patientblodprover (~5 ml) och överför till blodcellsseparationsrör (se Materialförteckning). Blanda genom att invertera 10x.
- Centrifugera vid 1 500 x g i 30 min vid rumstemperatur.
- Ta ut rören försiktigt och spraya med 70% etanol. Ta bort locken under en biosäkerhetshuv utan att störa de mononukleära cellerna (buffy layer). PBBC:er kommer att ligga i ett vitaktigt skikt precis under plasmaskiktet (figur 1A). Samla hela det fina skiktet med en 1000 μL pipett och överför till ett koniskt rör på 15 ml.
- Räkna cellnumret med hjälp av en automatiserad cellräknare. Snurra röret vid 300 x g i 25 min på RT.
- Kasta supernatanten. Tvätta med 10 ml DPBS (Ca2+/Mg2+ gratis).
- Snurra röret på 300 x g i 15 min på RT.
- Ta bort supernatanten. Resuspend cellpellets i 1 ml av frysmediet (KSR plus 10% DMSO). Justera celldensiteten för att göra 1 x 106 celler per flaska.
- Placera PBMC cryovials i en cellfrysningsbehållare och håll vid -80 °C över natten. Överför till en flytande kvävetank för långvarig lagring nästa dag.
- iPSC-omprogrammering.
- Tillsätt 3 ml tillägg blodmedia i ett 15 ml koniskt rör. Tina PBMCs i 37 °C vattenbad och överför dem till ett koniskt rör. Snurra på 300 x g i 7 min på RT.
- Kasta supernatanten. Återanvänd PBMCs med kompletta blodmedia. Frö dem i två brunnar av en 24 brunnspapperskulturplattor (ingen källarmembranmatris).
- Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C över natten. Nästa dag ta försiktigt bort hälften av det gamla mediet (0,5 ml) och tillsätt 0,5 ml färskt Complete Blood Media.
- Byt media varannan dag genom att uppdatera hälften av de gamla medierna.
- Efter en vecka, aggressivt tvätta brunnen med 1 ml Tillägg Blood Media och överföra celler till ett 15 mL centrifugrör.
- Räkna cellnumret. Ta 2 x 105 celler och centrifugera vid 300 x g i 7 min.
- Kasta supernatanten. Återanvänd celler med 300 μL komplett blodmedium. Utför transfektion genom att lägga till lämplig volym av Sendai virus omprogrammering vektorer enligt tillverkarens instruktioner. Överför dem till en brunn på en 24-välplatta (ingen källarmembranmatris). Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C över natten.
- Nästa dag snurrar vid 300 x g i 7 min. Ta bort supernatanten och återanvänd i 2 ml complete blood media. Överför till en brunn av en 6 brunnsplatta förbelagd med källarmembranmatris. Detta är dag 1 (D1).
- Rör inte tallriken nästa dag.
- På D3 tar du bort 1 ml av de gamla medierna. Tillsätt 1 ml tillägg blodmedia.
- Upprepa steg 2.2.10 på D5.
- På D7 tar du bort 1 ml av de gamla medierna. Lägg till 1 ml komplett E8-media.
- Upprepa steg 2.2.12 på D8.
- Ta bort de gamla medierna på D9. Lägg till 2 ml komplett E8-media. Helt omprogrammerade celler förväntas fästa och börja bilda kolonier.
- Uppdatera med 2 ml komplett E8-media varje dag.
- Cirka 2 veckor efter Sendai virustransduktion kommer stora iPSC-kolonier att dyka upp och vara redo för plockning.
- Skär iPSC-kolonier under ett stereomikroskop i huven och överför enskilda kolonier till en källarmembranmatrisbelagd 24-brunnsplatta förladdad med 0,5 ml iPSC-passaging media.
- Uppdatera med 0,5 ml komplett E8-media varje dag tills iPSC-kolonierna blir tillräckligt stora för att passa in i en ny källarmembranmatrisbelagd 6-brunnsplatta.
3. Underhåll och passaging för människa
- När mänskliga iPSCs når över 90% sammanflöde, ta bort gamla medier. Skölj med 3 ml DPBS en gång.
- Tillsätt 1 ml 0,5 mM EDTA i DPBS-lösning. Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C i 5-8 min.
- Ta bort EDTA genom strävan. Lägg till 1 mL i iPSC-passaging media. Flytta manuellt iPSCs.
- Ta 600-900 μL encellsfjädring och plätera dem på en källarmembranmatrisbelagd 6-brunnsplatta (utspädning: 1:6 till 1:10). Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C över natten.
- Uppdatera med 2 ml komplett E8-media varje dag. IPSC-kulturerna når vanligtvis sammanflöde efter 3-4 dagar.
4. Kemiskt definierad kardiomyocytdifferentiering
- Odla mänskliga iPSCs i kompletta E8-medier tills 95% sammanflöde (3-4 dagar).
- Ta bort det gamla mediet. Tillsätt 2 ml CM-differentiering Media II (6 μM CHIR i RPMI1640 plus B27 minus insulintillskott) till varje brunn på en 6-välplatta. Det här är D0. Rör inte vid D1.
- På D2, ersätt med 2 ml CM differentiering Media I (RPMI1640 plus B27 minus insulintillskott).
- På D3, ersätt med 2 ml CM differentiering Media III (5 μM IWR-1 i RPMI1640 plus B27 minus insulintillskott). Rör inte vid D4.
- På D5, ersätt med 2 ml CM differentiering Media I.
- På D7, ersätt med 2 ml CM differentiering Media IV (RPMI1640 plus B27 tillägg). Därefter uppdaterar du media varannan dag.
- På D11 när kontrakterande celler observeras, ersätt med 2 ml CM-differentiering Media V (ingen glukos).
- På D13, ersätt med 2 ml CM differentiering Media V.
- På D15, ersätt med 2 ml CM differentiering Media IV.
- På D17-D21, ersätt med 2 ml CM differentiering Media IV varannan dag.
5. Passage mänskliga iPSC-CMs
- Ta bort gamla medier och skölj cellerna med 3 ml DPBS en gång.
- Applicera 1 ml CM-dissociationslösning (se Tabell över material)på varje brunn på en 6-välplatta. Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C i 5-8 min.
- Mekaniskt dissociera iPSC-CMs i enstaka celler genom kraftig pipettering.
- Överför celler till ett koniskt rör på 15 mL. Lägg till 2 ml CM-passaging media (10% KSR i RMPI1640 plus B27 tillägg) för att neutralisera CM dissociation lösning.
- Snurra på 300 x g i 5 min på RT.
- Kasta supernatanten. Återanvänd celler med önskad volym CM-passaging-media. Så dem till en källarmembranmatrisbelagd tallrik/skål. Mänskliga iPSC-CMs återupptar slå 1-3 dagar efter passaging.
6. Expansion av mänskliga iPSC-CMs
- Skölj D10-12 slå iPSC-CMs med 3 ml DPBS för varje brunn av en 6-väl tallrik en gång. Tillsätt 1 ml CM-dissociationslösning (steg 5.2). Inkubera i 5% CO2 vid 37 °C i 7-10 min.
- Mekaniskt dissociera iPSC-CMs i enstaka celler genom kraftig pipettering.
- Överför celler till ett koniskt rör på 15 mL. Lägg till 2 ml CM-passaging-media för att neutralisera CM-dissociationslösningen.
- Snurra på 300 x g i 5 min på RT.
- Kasta supernatanten. Återanvänd celler med en lämplig volym CM-passaging-media. Pipettera upp och ner för att göra encellsfjädring. Så en miljon iPSC-CMs till en källarmembranmatrisbelagd 10 cm maträtt.
- Nästa dag ta bort gamla medier. Tillsätt 10 ml kardiomyocytproliferationsmedium (Media VI: 2 μM CHIR99021). Byt media varannan dag.
- När iPSC-CMs blir sammanflöde efter 7-9 dagars kultur, upprepa passaging-steget för ytterligare expansion av iPSC-CMs.
7. Immunofluorescens
- Innan immunofluorescensfärgning, frö iPSC-CMs på källarmembranmatrisbelagda täckslipar som placeras i en 24 brunnsplatta (såddtäthet: 0,5-1 x 106 celler/ml). Underhåll iPSC-CMs i kultur i minst 4 dagar.
- Tvätta celler med 1 ml DPBS en gång.
- Tillsätt 0,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) och inkubera i 15 min vid RT.
- Tvätta celler med 1 ml DPBS. Upprepa en gång.
- Tillsätt 0,5 ml 0,1% Triton X-100 och inkubera i 20 minuter på RT.
- Tvätta med 1 ml DPBS två gånger.
- Tillsätt 0,5 ml 0,2 % BSA i DPBS (blockeringslösning). Inkubera vid RT i 1 h.
- Tillsätt 200 μL primär antikropp utspädd med blockerande lösning (utspädning: 1:400-1:1000). Inkubera vid 4 °C över natten.
- Tvätta cellerna med 0,5 ml blockeringslösning i 3 minuter med skakning. Upprepa två gånger.
- Tillsätt 200 μL sekundär antikropp utspädd i blockeringslösningen. Inkubera vid RT i 1 h.
- Skölj cellerna tre gånger med 0,5 ml DPBS, var och en i 3 minuter med skakning.
- Mottainkärnor med DAPI (1:2000 utspädning) och inkubera i 5 min på RT.
- Skölj cellerna tre gånger med 0,5 ml DPBS.
- Montera celler på täckverktygen på en mikroskopbild med hjälp av 5 μl monteringsmedium. Förvara vid 4 °C och skydda mot ljus.
8. Provberedning av flödescytometri
- Tvätta mänskliga iPSC-CMs med 3 ml DPBS en gång.
- Tillsätt 1 ml CM-dissociationslösning och inkubera i 5% CO2 vid 37 °C i 7-10 min.
- Lossa celler med en pipett på 1 000 μL. Överför cellfjädringen till ett runt FACS-rör genom ett sillock. FACS-röret är förfyllt med 1 ml iPSC-CM passaging media (10% KSR) för att neutralisera enzymaktiviteten.
- Snurra vid 300 x g i 5 min.
- Ta bort supernatant utan att störa cellpelleten. Tillsätt 250 μL fixerings-/permeabiliseringslösning (se Materialtabell). Inkubera i 20 min vid 4 °C.
- Tillsätt 1 ml Perm/Wash-buffert. Virvel kort och snurra på 300 x g i 4 min.
- Kasta supernatanten. Tillsätt 100 μL utspädda primära antikroppar (1:200-1:500) i 1x Perm/Wash buffert. Virvel kort och inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml Perm/Wash-buffert. Virvel kort och snurra på 300 x g i 4 min.
- Kasta supernatanten. Tillsätt 100 μL utspädda sekundära antikroppar (1:500-1:1 000). Vortex kort och inkubera på RT i 1 h. Skydda mot ljus om sekundära antikroppar konjugeras med ljuskänslig fluorescens.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml Perm/tvättbuffert. Vortex kort och snurra på 300g i 4 min.
- Kasta supernatanten. Återsuspendceller med 400 μL FACS färgbuffert (PBS/4% FBS). Förvara vid 4 °C tills den lastas till ett FACS-instrument.
9. QPCR i realtid
- Ta bort gamla medier i mänsklig iPSC-CM-kultur. Tillsätt 500-700 μL lysbuffert till lysateceller. Inkubera i 3 minuter på RT. Scape cell lysate och överför till ett 1,5 ml RNase-fritt rör. Fortsätt till total RNA-extraktion omedelbart eller lagra vid -80 °C.
- Isolera totalt RNA med hjälp av ett RNA-extraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Mät RNA-koncentrationen och utvärdera kvaliteten på det totala RNA med en spektrofotometer.
- Utför omvänd transkriptionsreaktion med hjälp av ett cDNA-synteskit. Den totala volymen RT-reaktion är 20 μL inklusive 4 μL reaktionsblandning (5x), 1 μL omvänd transkriptas,1 μg totalt RNA- och RNasefritt vatten.
- Inkubera hela RT-reaktionsblandningen i en termisk cyklist med följande protokoll: 25 °C i 5 min; 46 °C i 20 minuter; 95 °C i 1 min; håll vid 4 °C.
- Späd cDNA senast 1:10 med nukleasfritt vatten. Ställ in qPCR-reaktionen i realtid genom att blanda 1 μL cDNA-mall, 1 μL primer/sond, 10 μL qPCR-huvudblandning och 8 μL nukleasfritt vatten.
- Kör i ett PCR-system i realtid. Cykelprotokollet är 50 °C 2 min (håll), 95 °C 10 min (håll), 95 °C 15 sek, 60 °C 1 min, upprepa i 40 cykler.
- Samla in CT-värden för varje gen i varje prov. Relativ mRNA-överflöd beräknas genom att subtrahera CT-värdet av målgenen från CT-värdet för en hushållningsgen. Relativt genuttryck analyseras med 2-ΔΔCT-metoden.
10. Inspelning av hela cellplåsterklämma
- Dela upp iPSC-CMs i enstaka celler med hjälp av CM-dissociationslösning som tidigare beskrivits.
- Fröceller med låg densitet på källarmembranmatrisbelagda täcken. Odla dem i 3-4 dagar i Media IV.
- Dra pipetter (motstånd 0,9-1,5 MΩ) från kapillärer av borosilikatglas med hjälp av en horisontell mikroelektroddragare.
- Inkubera celler i Tyrlids lösning (pH=7,35).
- Fyll pipetter med elektrodlösning (pH=7.3) bestående av följande kemikalier: 120 mM aspartsyra, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosphocreatine, 4 mM K-ATP och 2m creatine phosphocreatine.
- Placera cellerna i det aktuella klämläget med en diastolisk tröskel på 1,5-2 5 ms strömpuls vid 1 Hz.
- Registrera actionpotentialer (APs) med hjälp av en mikroelektrodförstärkare och ett programvarudrivet förvärvskort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mänsklig iPSC-omprogrammering från PBMCs
Efter förkultur med Complete Blood Media i 7 dagar blir PBMCs stora med synliga kärnor och cytoplasma (figur 1B), vilket indikerar att de är redo för virustransfektion. Efter transfektion med Sendai virus omprogrammeringsfaktorer, PBMCs kommer att genomgå en epigenetisk omprogrammering process för ytterligare en vecka. Vanligtvis får vi 30-50 iPSC-kolonier från transfektionen av 1 x 105 PBMCs och omprogrammeringseffektiviteten är 0,03%-0,05%. Helt omprogrammerade celler kommer att fästa och börja bilda kolonier när de introduceras till hela E8-mediet (figur 1C). Dessa tidiga iPSC-kolonier utökas i ytterligare 7 dagar och skärs sedan mekaniskt och plockas upp individuellt. Varje iPSC-koloni överförs till en brunn av en 6-brunnsplatta för att upprätta enskilda iPSC-linjer. Efter 4-5 passager blir iPSC-kolonier rena med mycket få differentierade celler runt (figur 1D). I detta skede är de flesta cellerna i iPSC-kolonier OCT4 och NANOG-positiva (figur 1E), vilket visar deras pluripotens. Stabila iPSC-linjer upprättas av den femte passagen.
Hjärtdifferentiering
Hjärtdifferentieringsprotokollet beskrivs i figur 1F. Hjärtdifferentiering initieras när iPSCs upprätthålls i minst 10 passager. Graden av iPSC-sammanflöde är avgörande när CHIR99021 tillämpas. Celltätheten är mer än 90% sammanflöde men inte överkonfluent. Om iPSC kolonier blir för trångt, kommer de att starta spontan differentiering som negativt kommer att påverka den riktade kardiomyocyt differentiering effektivitet. Slå kardiomyocyter observeras vanligtvis efter dag 12 av differentiering(Video 1). Det datum då misshandeln börjar varierar och beror på de iPSC-linjer som används. Efter glukossvält och replating visar iPSC-CMs spontan misshandel (Video 2) och justerad sarkomerstruktur med interkalerad hjärt troponin T (TNNT2) och α-aktinin (figur 1G-H). Dessutom är renheten hos iPSC-CMs hög, med mer än 93% av cellerna är TNNT2+ vilket framgår av FACS-analys(figur 1I).
Även om iPSC-CMs är relativt omogna jämfört med vuxna kardiomyocyter, visar de ventrikulära och förmaksliknande aktionspotentialer mätt med hela cellplåsterklämma(figur 2A,B). I en typisk hjärtdifferentiering är dag 30 iPSC-CMs en blandning av ventrikulära, förmaks- och nodalliknande undertyper, där ventrikulära CMs står för majoriteten (60%, figur 2C) med hjälp av ovannämnda differentieringsprotokoll (figur 1F). Olika differentieringsprotokoll ger olika procentandelar kardiomyocytundertyper på grund av distinkt aktivering av signalvägar under celllinjebestämning10. Ventrikulära CMs är märkta med MYL2 (MLC2v, figur 2D)medan förmaksflamma iPSC-CMs är märkta med NR2F2 (COUP-TFII, figur 2E). Dessa markörer uttrycks starkt i mer mogna iPSC-CMs (>D30) snarare än de i ett tidigt skede.
Expansion av iPSC-CMs genom Wnt-aktivering
Hos däggdjur delar vuxna kardiomyocyter inte aktivt för självförnyelse. Detta fenomen äger också rum för mänskliga iPSC-CMs. När mogna bortom D30, cell uppdelning av iPSC-CMs är en sällsynt händelse, vilket begränsar deras förmåga till klinisk- och industriell-nivå massproduktion. För att efterlikna utvecklingsmiljön under embryonala kardiomyocyt spridning, aktiverar vi Wnt vägen av CHIR99021 för att stimulera multiplikation av tidiga iPSC-CMs. D12-14 iPSC-CMs (efter rening genom glukosbrist) sås med låg densitet i närvaro av 2 μM CHIR99021. Wnt-aktivering stimulerar celldelning av iPSC-CMs och främjar uttrycket av cellcykelregulatorer som Cyclin D1 (figur 3A) som kan driva cellcykeln för att gå vidare genom G1-fasen. Intressant nog möjliggör CHIR99021 robust spridning av tidiga iPSC-CMs för 2 passager jämfört med kontrollerna (figur 3B). Spridningsförmågan hos iPSC-CMs minskar dock med omfattande passage (figur 3B), vilket är förenligt med den begränsade och välkontrollerade hjärtproliferation under embryonal hjärtutveckling. Det verkar inte heller som om CHIR99021 kan stimulera expansionen av mer mogna iPSC-CMs när de når över 30 dagars differentiering och utveckla stabila sarkomerstrukturer.
Figur 1: Human iPSC omprogrammering och kardiomyocyt differentiering. (A) Ett schematiskt diagram som visar PBMC-skiktet efter separation av patientens blodprover. b)Utvidgade PBBC:er är klara för omsting. C)Tidiga mänskliga iPSC-kolonier. d)En etablerad iPSC-linje vid passage 5. (E) Mänskliga iPSC är positiva för pluripotency markörer OCT4 (grön) och NANOG (röd). Kärnor är kontradevigde av DAPI (blå). (F) Översikt över ett kardiomyocyt differentieringsprotokoll. (G-H) Sarkomer struktur av iPSC-CMs avslöjas av immunofluorescens färgning med antikroppar mot TNNT2 (grön) och α-aktinin (röd). Kärnor är kontradevigde av DAPI (blå). (I)FACS-analys av iPSC-CMs med en antikropp mot TNNT2. Skalstänger: 200 μm (B-D), 50 μm (E och G) och 20 μm (H). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kardiomyocytundertyper hos mänskliga iPSC-CMs. (A-B) Representativa åtgärder potentiella varaktigheter för ventrikulära(A) och förmaksliknande (B) iPSC-CMs. (C) Representativa procentandelar ventrikulära, förmaks- och nodliknande undertyper i mänskliga iPSC-CMs. (D-E) D30 iPSC-CMs är färgade med antikroppar mot ventrikulär kardiomyocytmarkör MYL2 (D) och förmaksmarkör NR2F2 (E). Cellerna färgas samtidigt med en TNNT2-antikropp. Kärnor är kontradevigde av DAPI (blå). Skalstänger: 50 μm (D-E). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Expansion av mänskliga iPSC-CMs genom Wnt-aktivering. (A) Andelen Cyclin D1-positiva iPSC-CMs ökar i närvaro av CHIR99021. Cellerna är dubbelfärgade med antikroppar mot TNNT2 (röd) och Cyclin D1 (grön). Kärnor är kontradevigde av DAPI (blå). (B) Cellnummerveckförändringar under expansionen av mänskliga iPSC-CMs med eller utan CHIR99021 i de första 3 passagerna. Y-axeln visar cellnummervecket. CHIR99021 stimulerar en robust spridning av tidiga iPSC-CMs. Skalstänger: 50 μm (A). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Video 1. Slå mänskliga iPSC-CMs på dag 18 av differentiering. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2. Slå mänskliga iPSC-CMs på dag 25 efter metabolisk rening. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under iPSC omprogrammering är det viktigt att odla PBMCs i 1 vecka tills de förstoras med tydliga kärnor och cytoplasma. Eftersom PBMCs inte förökar sig är ett lämpligt cellnummer för viral transduktion viktigt för framgångsrik iPSC-omprogrammering. Cellantal PBMCs, multiplicity av infektion (MOI) och titer av virus bör övervägas och justeras för att nå optimala transduktion resultat. För hjärtdifferentiering är initial såddtäthet avgörande för att iPSCs ska nå över 90% sammanflöde den dag då CHIR99021 administreras. Å ena sidan, om iPSCs är mindre sammanflöde vid tidpunkten för hjärtdifferentiering, kommer CHIR99021 att vara giftigt och leda till betydande celldöd. Å andra sidan, om iPSCs är över sammanflöde, kommer de att genomgå spontan differentiering som kommer att äventyra effektiviteten i riktad hjärtdifferentiering. Vid utbyggnaden av tidiga iPSC-CMs bör tidpunkten och kardiomyocytkvaliteten beaktas. Tidiga iPSC-CMs kan robust multiplicera endast när renheten hos kardiomyocyter är tillräckligt hög. Befintliga icke-kardiomyocyter i kulturen kan också spridas som svar på CHIR99021-behandling, vilket kommer att påverka spridningen av tidiga iPSC-CMs negativt. Dessutom är det viktigt att stimulera kardiomyocytexpansion dag 20 av differentiering. När iPSC-CMs passerar över dag 30 kommer det att vara svårt för dem att återuppta robust delning.
Mänskliga iPSCs härleddes ursprungligen från dermal och lung fibroblasts via retrovirus-medierad transfekt1,2. Det finns två stora problem med dessa omprogrammeringsmetoder som förhindrar framsteg i klinisk översättning av patientens iPSCs: 1) retroviruset integreras i värdgenomet och därmed införa potentiella genetiska mutationer; 2) Patient-härledda fibroblaster kräver huden tarmbiopsier som många patienter kan minska. I det här protokollet beskriver vi ett protokoll som använder kommersiella icke-integration Sendai virus23 och PBMCs för att robust härleda patientens iPSCs. Dessa iPSCs är fria från exogena omprogrammering vektorer och kan upprätthållas med självförnyelse och pluripotency på obestämd tid. Dessutom samlas patientblodprover lätt i kliniska laboratorier. Vårt protokoll är mångsidigt och kan användas för massproduktion av patient- och sjukdomsspecifika iPSCs för storskaliga slutförvar och kliniska översättningar24.
Robust cardiomyocyte differentiering uppnås genom sekventiell modulering av specifika signalering vägar under hjärt differentiering från mänskliga iPSCs. Viktiga vägar som är involverade i hjärtspecifikation och spridning inkluderar Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF och retinsyra (RA) 10,12. Här presenterar vi ett effektivt hjärtdifferentieringsprotokoll genom sekventiell modulering av Wnt-signalering av små kemikalier: först aktivering av CHIR99021 och sedan hämning av IWR-113,14. Små kemikalier är stabila och ger konsekventa differentieringsresultat jämfört med dem som använder tillväxtfaktorer. De flesta iPSC-CMs som genereras av detta protokoll är ventrikulära-liknande kardiomyocyter, blandade med förmaks- och nodalliknande celler. Precisionsgenerering av subtypspecifika kardiomyocyter uppnås genom finjustering av senare differentieringssteg10,12. Till exempel ger tillsats av RA omedelbart efter IWR-1-behandling en hög andel förmaksliknande kardiomyocyter medan RA-hämning främjar generering av ventrikulärliknande iPSC-CMs18,22. Wnt signalering aktivering i ett senare skede av differentiering främjar induktion av hjärt stamceller till nod-liknande kardiomyocyter19,21, vilket är lovande för generering av patientspecifika biologiska pacemakerceller.
Mänskliga iPSC-CMs är omogna och har begränsad spridningsförmåga25. Under embryonal hjärt utveckling fortsätter mognaden medan spridningen minskar. Det finns ett smalt fönster när iPSC-CMs kan stimuleras för robust spridning, vilket återspeglar embryonal kardiomyocytexpansion. Här använder vi en Wnt-aktivator CHIR99021 för att främja spridningen av tidiga iPSC-CMs under en begränsad period, vilket överensstämmer med en ny rapport17. Det spekuleras att Wnt signalvägen påverkar kardiomyocyt spridning eventuellt genom crosstalk med flera uppströms vägar såsom NOTCH och Hippo26,27. NOTCH-signalering främjar kardiomyocytproliferation medan Hippo-vägen begränsar hjärttillväxt och hjärtstorlek28,29,30. Det är fortfarande okänt hur interaktionen mellan NOTCH och Hippo bestämmer nedströms Wnt aktivitet och finjusterar en lämplig grad av hjärtproliferation. Vårt protokoll har gett en intressant modell för kardiomyocyt spridning att studera sjukdom mekanismer av medfödda hjärtfel som orsakas av hypoplasi av Ventrikulärt kardiomyocyter, såsom hypoplastiska vänstra hjärtat syndrom (HLHS) och pulmonell atresia med intakt ventrikulärt septum (PA-IVS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF och SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) beviljar 1R01HL124245, 1R01HL132520 och R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao stöddes också av startfonder från Abigail Wexner Research Institute vid Nationwide Children's Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
