Summary
ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。
Abstract
単一の血液引き分けから患者固有の心筋細胞を生成することは、心血管疾患の精密医療に大きな関心を集めています。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からの心臓分化は、胚性心臓の発達に不可欠なシグナル伝達経路によって調節される。2次元および3次元プラットホーム上の多数の心臓分化方法は、様々な効率および心筋細胞収率と開発された。これらの方法の多様性は従うのが難しい可能性があり、これは現場外の調査官を困惑させた。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からの患者特異的心筋細胞の堅牢な生成と拡大を詳述した包括的なプロトコルを提示する。まず、非集積センダイウイルスベクターを用いた患者の血液サンプルからの高効率iPSCリプログラミングプロトコルについて説明する。次に、ほとんどのヒトiPSCラインから打ち負かす心筋細胞を堅牢に生成できる、小分子媒介単層分化法を詳述する。さらに、スケーラブルな心筋細胞拡張プロトコルは、産業および臨床グレードのアプリケーションのために患者由来の心筋細胞を急速に拡大することができる低分子(CHIR99021)を使用して導入されています。最後に、これらのiPSC-CMの分子同定と電気生理学的特徴付けのための詳細なプロトコルが描かれています。このプロトコルは、心血管の発達と幹細胞生物学に関する限られた知識を持つ初心者にとって実用的なものになることを期待しています。
Introduction
ヒト人工多能性幹細胞の発見は、現代の心臓血管医学1,2に革命を起こしました。ヒトのiPSCは、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、心臓線維芽細胞を含む、心臓内のすべての細胞タイプを自己再生し、生成することができます。iPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)は、遺伝的に遺伝性心血管疾患(CVD)をモデル化し、新薬の心の安全性をテストするための無期限のリソースとして役立つことができる3。特に、iPSC-CMは、長いQT症候群4および拡張型心筋症(DCM)5のような心筋細胞の欠陥に由来するCVDの遺伝的および分子的病因を調査する準備が整っている。CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集と組み合わせることで、患者iPSC-CMは先天性心不全(CHD)6、7、8を含むCVDの複雑な遺伝的基盤を理解するための前例のない道を開いた。ヒトiPSC-CMは、心臓発作9の間に損傷した心筋を補充するための自己細胞源として役立つ可能性を示している。近年、心臓再生および薬物検査10に対して、定義されたサブタイプ(心房、心室および節状)を有する高品質のヒトiPSC-CMを生成することが最も重要になっている。
ヒトiPSCとの心臓分化は、過去10年間で大きく進歩してきました。分化方法は、胚体(EB)ベースの自発的分化から化学的に定義され、指示された心臓分化11に行った。Wnt、BMP、Nodal、FGFなどの胚性心臓の発達に不可欠な主要なシグナル伝達分子は、ヒトiPSC10,12からの心筋細胞分化を増強するために操作される。顕著な進歩は、ヒトiPSC13,14から心筋細胞の堅牢な生成のためのWntシグナル伝達(活性化後の阻害)の順次変調を含む。化学的に定義された心臓分化のレシピは、産業および臨床レベルの生産にアップグレードされる可能性を有する拍動心筋細胞15、16の大規模な生産を容易にするために探求されてきた。また、初期ヒトiPSC-CMの堅牢な拡張は、小型化学物質(CHIR99021)17を用いた構成的なWnt活性化への曝露によって達成される。最近では、ヒトiPSC18、19、20、21、22からの心筋細胞系統のコミットメント中に特定の分化窓におけるレチノイン酸(RA)およびWntシグナル伝達経路の操作を介してサブタイプ特異的な心筋細胞が生成される。
本プロトコルでは、患者末梢血単核細胞由来のヒトCMの堅牢な生成と増殖のための作業手順を詳述する。1)ヒトPBMCをiPSCにリプログラミングするプロトコル、2)ヒトiPSCからの打ち負拍起動細胞の堅牢な生成、3)初期iPSC-CMの急速な拡大、4)ヒトiPSC-CMの分子特性化、および5)パッチクランプによる単一細胞レベルでのヒトiPSC-CMの電気生理学的測定のためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、患者の血液細胞を拍動心筋細胞に変換する詳細な実験手順をカバーしています。
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Protocol
実験議定書とヒト被験者のインフォームド・コンセントは、全国小児病院の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
1. 細胞培養培地、溶液、試薬の製造
- PBMC メディアの準備
- 20 mLの基礎PBMC培養培地(1x)と0.52 mLのサプリメントを混ぜます。SCFとFLT3の20 μL(ストック濃度:100 μg/mL)、4 μLのIL3、IL6、EPO(ストック濃度:100 μg/mL)、L-グルタミン代替(100x)を200 μL加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用して無菌フードでフィルター。これを完全な血液メディアと名前を付けます。
- 20 mL の基礎 PBMC 培養培地 (1x) と 0.52 mL のサプリメントを混合します。L-グルタミン代替(100x)の200 μLを加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用してフィルター。これを補足血液培地とします。
- 完全なE8メディアを準備する
- E8基底メディア500mLとE8サプリメント10mL(4°Cで一晩解凍)を混ぜて完全なE8メディアを作ります。使用前に室温(RT)に平衡化します。
- iPSCパスジングメディアの準備
- 40 μLの Y-27632 ロックインヒビター (1:5,000 希釈、ストック濃度: 10 mM) を完全な E8 媒体の 200 mL に加えます。十分に混ぜます。使用前にRTに平衡化します。
- 心筋細胞分化培地の準備
- メディアI:500 mLのRPMI1640を10 mLのB27マイナスインスリンサプリメント(50x)と混合する。
- メディアII:メディアI(CHIR99021最終濃度6μM)に適切な量のCHIR99021(GSK3阻害剤)ストックを追加します。よく混ぜます。
- メディアIII:IWR-1(Wnt阻害剤)ストックの適切なボリュームをメディアI(IWR-1最終濃度5μM)に追加します。よく混ぜます。
- メディアIV:B27サプリメント(50x)の10 mLとRPMI1640の500 mLを混合します。よく混ぜます。
- メディアV:混合 500 rpmI1640 (無グルコース) 10 mL の B27 サプリメント (50x).よく混ぜます。
- メディアVI:メディアIV(CHIR99021最終濃度2μM)に適切な量のCHIR99021ストックを追加します。よく混ぜます。
- iPSC-CMパッセイメディアの準備
- メディアIV(KSR最終濃度:10%)の90 mLにノックアウト血清交換(KSR)の10 mLを加えます。よく混ぜます。
- iPSC-CM凍結メディアの準備
- 1 mL の DMSO を KSR の 9 mL (最終濃度: 10% DMSO/90% KSR) に加え、よく混ぜます。
- 基質膜マトリックス中被覆プレートを準備する
- 一晩4°Cで基質膜マトリックス培地を解凍し、1.5 mLチューブでアリコートを行います。この培地の1 mLをDMEM/F12培地(1:250希釈)の250 mLに加え、十分に混ぜます。希釈液2 mLを6ウェルプレートにウェルあたり2 mL塗布し、37°Cで5%CO2 で30分間インキュベートします。
2. PBMCのiPSCリプログラミング
- 血液サンプルからPBMCsを分離します。
- 患者の血液サンプル(〜5 mL)を収集し、血液細胞分離管に移す( 材料表を参照)。10倍反転して混ぜます。
- 室温で30分間1,500 x g の遠心分離機。
- 慎重にチューブを取り出し、70%エタノールでスプレーします。バイオセーフティフードの下で、単核細胞(バフィー層)を邪魔することなくキャップを取り外します。PBMCはプラズマ層のすぐ下に白っぽい層になります(図1A)。1000 μL ピペットを使用して全体のバフィー層を収集し、15 mL の円錐管に移します。
- 自動セル カウンターを使用してセル番号をカウントします。RTで25分間300 x g でチューブを回転させます。
- 上清を捨てます。DPBS(Ca2+/Mg2+無料)10 mLで洗浄してください。
- RTで15分間300 x g でチューブを回転させます。
- 上清を取り除く。凍結培地の1mL(KSRプラス10%DMSO)で細胞ペレットを再懸濁する。セル密度を調整して、バイアルあたり1 x 106 のセルを作ります。
- PBMCクリオビアルを細胞凍結容器に入れ、一晩で-80°Cに保ちます。翌日に長期保存のために液体窒素タンクに移します。
- iPSCのリプログラミング。
- 15 mLの円錐形の管に3 mLのサプリメント血液培地を加える。37°Cの水浴でPBMCsを解凍し、円錐形のチューブに移します。RTで7分間300 x g でスピンします。
- 上清を捨てます。完全な血液メディアでPBMCを再中断します。24ウェル組織培養プレート(基部膜マトリックスなし)の2つの井戸に播種します。
- 一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。翌日は古いメディアの半分(0.5 ml)をそっと取り除き、0.5 mLの新鮮な完全な血液メディアを加えます。
- 古いメディアの半分をリフレッシュして、1日おきにメディアを変更します。
- 1週間後、1 mLのサプリメント血液培地でウェルを積極的に洗浄し、細胞を15 mL遠心分離チューブに移します。
- セル番号をカウントします。2 x 105 細胞と遠心分離機を300 x g で7分間服用します。
- 上清を捨てます。完全な血液メディアの300 μLの細胞を再懸濁させる。メーカーの指示に従ってセンダイウイルスリプログラミングベクターの適切な量を追加することにより、トランスフェクションを実行します。24ウェルプレート(基部膜マトリックスなし)の1つの井戸にそれらを転送します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。
- 翌日は300×gで7分間スピンします。上清を取り除き、完全な血液メディアの2 mLで再中断します。基膜マトリックスであらかじめコーティングされた6ウェルプレートの1つの井戸に移します。これは 1 日目 (D1) です。
- 次の日に皿に触れないでください。
- D3 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。サプリメント血液培地の1 mLを追加します。
- D5 でステップ 2.2.10 を繰り返します。
- D7 で、古いメディアの 1 mL を取り外します。完全なE8メディアの1 mLを追加します。
- D8 で、ステップ 2.2.12 を繰り返します。
- D9 で、古いメディアを取り外します。完全なE8メディアの2 mLを追加します。完全に再プログラムされた細胞は、コロニーの形成を取り付け、開始することが期待される。
- 毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。
- 仙台ウイルスの感染から約2週間で、大型のiPSCコロニーが出現し、ピッキングの準備が整います。
- フード内の実体顕微鏡下でiPSCコロニーを切断し、0.5 mLのiPSC通過媒体をプリロードした基質膜マトリックスコーティングされた24ウェルプレートに個々のコロニーを移管します。
- iPSCコロニーが新しい基膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートに通過するのに十分な大きさになるまで、毎日0.5 mLの完全なE8培地でリフレッシュしてください。
3. ヒトiPSCのメンテナンスと過渡
- ヒトのiPSCが90%以上の合流率に達したら、古いメディアを取り除く。3 mLのDPBSを一度にすすいでください。
- DPBS溶液に0.5 mM EDTAの1 mLを加えます。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。
- 吸引によってEDTAを取り除く。iPSC通過媒体を1 mL追加します。iPSC を手動で取り外します。
- 600-900 μLの単一細胞懸濁液を取り、基質膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート(希釈:1:6〜1:10)に再板します。一晩で5%CO2を37°Cでインキュベートする。
- 毎日2mLの完全なE8メディアでリフレッシュしてください。iPSC培養は通常3~4日後に合流する。
4. 化学的に定義された心筋細胞分化
- 95%コンフルエント(3-4日)まで完全なE8メディアでヒトiPSCを培養する。
- 古いメディアを取り外します。6ウェルプレートの各ウェルにCM分化メディアII(RPMI1640の6 μM CHIRとB27マイナスインスリンサプリメント)を2 mL加えます。これはD0です。D1に触れないでください。
- D2では、CM分化培地I(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメント)の2 mLに置き換えてください。
- D3では、CM分化培地IIIの2 mL(RPMI1640プラスB27マイナスインスリンサプリメントで5μM IWR-1)に交換してください。D4に触れないでください。
- D5 では、CM 分化メディア I の 2 mL に置き換えます。
- D7では、CM分化メディアIV(RPMI1640プラスB27サプリメント)の2 mLに交換してください。その後、1 日おきにメディアを更新します。
- D11上で細胞が収縮する場合、CM分化培地V(無グルコース)の2mLに交換する。
- D13 では、CM 分化メディア V の 2 mL に交換します。
- D15では、CM分化メディアIVの2 mLに交換してください。
- D17-D21 では、CM 分化メディア IV の 2 mL を 1 日おきに交換します。
5. ヒトiPSC-CMの通路
- DPBS の 3 mL で古い培地を取り除き、細胞を一度すすい。
- 6ウェルプレートの各ウェルにCM解離解液1 mL( 材料表を参照)を適用します。5-8分間、37°Cで5%CO2 でインキュベートします。
- iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。
- 細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体(RMPI1640とB27の補足の10%KSR)の2 mLを加える。
- RTで5分間300 x g で回転します。
- 上清を捨てます。CM通過媒体の所望の容積を有する細胞を再中断する。基部の膜マトリックスコーティングされたプレート/皿に播種します。ヒトiPSC-CMは、通過後1〜3日で殴打を再開します。
6. ヒトiPSC-CMの拡大
- 6ウェルプレートのウェルごとに3 mLのDPBSでiPSC-CMを1回打つD10-12をすすいます。CM解離ソリューションを1 mL追加します(ステップ5.2)。37°Cで5%CO2 で7〜10分間インキュベートします。
- iPSC-CMを、激しいピペット処理により単一細胞に機械的に解化する。
- 細胞を15 mL円錐形チューブに移します。CMの解離の解決を中和するためにCMの通過媒体の2 mLを加える。
- RTで5分間300 x g で回転します。
- 上清を捨てます。適切な量の CM 通過媒体を持つセルを再中断します。ピペットを上下にして単一細胞懸濁液を作ります。100万個のiPSC-CMを基部の膜マトリックスコーティングされた10cm皿に種分します。
- 次の日は古いメディアを削除します。10 mLの心筋細胞増殖培地(メディアVI:2 μM CHIR99021)を加えます。1 日おきにメディアを変更します。
- iPSC-CM が 7~9 日培養後にコンフルエントになった場合は、iPSC-CM のさらなる拡張のために、継ぎ手のステップを繰り返します。
7. 免疫蛍光
- 免疫蛍光染色の前に、24ウェルプレートに配置された基質膜マトリックスコーティングカバーリップ(シードiPSC-CM:播種密度:0.5-1 x 106 細胞/mL)にシードします。少なくとも 4 日間は、iPSC-CM をカルチャに保持します。
- 1 mLのDPBSを使用して細胞を1回洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の0.5 mLを加え、RTで15分間インキュベートします。
- 1 mLのDPBSを用いて細胞を洗浄する。1 回繰り返します。
- 0.1%トリトンX-100の0.5 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。
- 1 mL の DPBS を 2 回洗います。
- DPBS(ブロッキング溶液)に0.2%BSAの0.5 mLを加えます。RTで1時間インキュベートする。
- ブロッキング溶液で希釈した一次抗体200μLを加える(希釈:1:400-1:1000)。一晩4°Cでインキュベートします。
- 0.5 mLのブロッキング溶液を使用して3分間揺れで細胞を洗浄します。2 回繰り返します。
- ブロッキング溶液に希釈した200μLの二次抗体を添加します。RTで1時間インキュベートする。
- 0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスし、それぞれ3分間揺れ動かします。
- カウンターステイン核とDAPI(1:2000希釈)、RTで5分間インキュベートする。
- 0.5 mLのDPBSで細胞を3回リンスする。
- 5 μlの取り付けメディアを使用して、カバーリップ上のセルを顕微鏡スライドに取り付けます。4°Cで保管し、光から保護します。
8. フローサイトメトリーサンプル調製
- 3 mLのDPBSでヒトiPSC-CMを1回洗います。
- CM解離液1 mLを加え、37°Cで5%CO2 で7~10分間インキュベートします。
- 1,000 μL ピペットを使用して細胞を取り出します。ストレーナーキャップを通して丸いFACSチューブに細胞懸濁液を移す。FACSチューブは、酵素活性を中和するために1mLのiPSC-CM通過媒体(10%KSR)で予め充填されています。
- 300 x g で 5 分間スピンします。
- 細胞ペレットを乱さずに上清を除去する。250 μLの固定/透過性解析ソリューションを追加します(資料表を参照)。4°Cで20分間インキュベートします。
- 1 mL のペルミ/ウォッシュバッファを追加します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。
- 上清を捨てます。1x Perm/Washバッファーに100 μLの希釈一次抗体(1:200-1:500)を加えます。渦を短時間で4°Cで一晩インキュベートする。
- ペルミ/ウォッシュバッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で、300 x g で4分間回転します。
- 上清を捨てます。希釈二次抗体を100 μL加えます(1:500-1:1,000)。渦は短時間、RTで1時間インキュベートする。二次抗体が光感受性蛍光と共役する場合は、光から保護します。
- ペルミ/洗浄バッファーの1 mLを加えて細胞を洗浄します。渦は短時間で回転し、300gで4分間回転します。
- 上清を捨てます。400 μL の FACS 染色バッファー (PBS/4% FBS) を持つセルを再中断します。FACS機器にロードするまで4°Cで保管してください。
9. リアルタイムの qPCR
- 人間のiPSC-CM文化の古いメディアを削除します。500~700 μL のライシスバッファーを細胞のリセートに加えます。RT. スケープ細胞ライセートで3分間インキュベートし、1.5 ml RNaseフリーチューブに移します。RNAの全量抽出を直ちに行うか、-80°Cで保存してください。
- メーカーの指示に従って、RNA抽出キットを使用して全RNAを分離します。
- RNA濃度を測定し、分光光度計で全RNAの品質を評価します。
- cDNA合成キットを用いて逆転写反応を行う。RT反応の総体積は、4 μLの反応ミックス(5x)、1 μLの逆転写酵素、1 μgの全RNAおよびRNaseフリー水を含む20 μLです。
- 次のプロトコルを使用してサーマルサイクラーで完全なRT反応ミックスをインキュベート: 25 °C 5分間;46°C 20分間。95°C 1分間。4 °Cで保持します。
- ヌクレアーゼを含まない水を用いてcDNAを1:10で希釈する。1 μLのcDNAテンプレート、プライマー/プローブ1 μL、qPCRマスターミックス10 μL、ヌクレアーゼフリー水8 μLを混合して、リアルタイムqPCR反応を設定します。
- リアルタイム PCR システムで実行します。サイクリングプロトコルは50°C2分(ホールド)、95°C 10分(ホールド)、95°C 15秒、60°C1分、40サイクル繰り返します。
- 各サンプル中の各遺伝子のCT 値を収集する。mRNAの相対的存在量は、ハウスキーピング遺伝子のCT 値から標的遺伝子のCT 値を差し引くことによって計算される。相対遺伝子発現は、2-ΔΔCT 法により解析される。
10. 全セルパッチクランプ記録
- 前述のようにCM解解を用いてiPSC-CMを単一細胞に解離する。
- 基部膜マトリックスコーティングカバーリップ上の低密度で細胞をシード。メディアIVで3〜4日間培養します。
- ホウケイ酸ガラスの毛細血管からピペット(抵抗0.9~1.5 MΩ)を引き出し、水平マイクロ電極プーラーを使用します。
- タイロード溶液中の細胞をインキュベートする(pH=7.35)。
- ピペットに以下の化学物質で構成される電極溶液(pH=7.3)を充填する:120 mMアスパラギン酸、 20 mM KCl、2 mM MgCl2、5mM HEPES、10 mM NaCl、5 mM EGTA、0.3 mM Na-GTP、14 mMホスホクレアチン、4 mM K-ATPおよび2mMクレアチンホスホキナーゼ。
- 1 Hz で 1.5-2 拡張期しきい値 5 ms 電流パルスを使用して、現在のクランプ モードにセルを配置します。
- マイクロ電極アンプとソフトウェア駆動型取得ボードを使用して、アクション電位(AP)を記録します。
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Representative Results
PBMCからのヒトiPSCリプログラミング
完全な血液培地を7日間用いて培養した後、PBMCsは可視核と細胞質(図1B)で大きくなり、ウイルストランスフェクションの準備ができていることを示す。センダイウイルスのリプログラミング因子によるトランスフェクションの後、PBMCはエピジェネティックなリプログラミングプロセスを1週間受ける。一般的に、1 x 10 5 PBMCのトランスフェクションから30〜50 個のiPSCコロニーを得て、リプログラミング効率は0.03%-0.05%です。完全に再プログラムされた細胞は、完全なE8メディアに導入されるとコロニーを付着し、形成を開始します(図1C)。これらの初期のiPSCコロニーはさらに7日間拡張され、その後機械的に切断され、個別に拾われます。各iPSCコロニーは、個々のiPSCラインを確立するために、6ウェルプレートの1つのウェルに転送されます。4-5の通過後、iPSCコロニーは純粋になり、周りの分化細胞が非常に少なくなる(図1D)。この段階では、iPSCコロニーの細胞の大部分はOCT4およびNANOG陽性(図1E)であり、多能性を示す。安定したiPSCラインは5番節によって確立される。
心臓分化
心臓分化プロトコルは図 1Fに示されています。心臓分化は、iPSCが少なくとも10の通路のために維持されると開始される。iPSC合流度の程度は、CHIR99021を適用する際に重要です。細胞密度は90%以上のコンフルエントですが、コンフルエントには過ぎません。iPSCコロニーが混みすぎると、自発的分化が始まり、指向性心筋細胞分化効率に悪影響を及ぼす。心筋細胞を打つことは、通常、分化の12日目の後に観察される(ビデオ1)。打ちの発症が生じる日付は、様々であり、使用中のiPSCラインによって異なります。グルコースの飢餓と再めっきの後、iPSC-CMは自発的な拍動(ビデオ2)とインターカルパレーション心筋トロポニンT(TNNT2)およびαアクチニンを有するサルコメア構造を整列させた(図1G-H)。また、iPSC-CMの純度は高く、FACS分析で示されているように細胞の93%以上がTNNT2+である(図1I)。
iPSC-CMは成人型心筋細胞に比べて比較的未熟であるが、全細胞パッチクランプで測定される心室および心房様作用電位を示す(図2A、B)。典型的な心臓分化において、30日目のiPSC-CMは心室、心房、および節状のサブタイプの混合物であり、心室CMが上記の分化プロトコルを使用して大部分(60%、図2C)を占めている(図1F)。異なる分化プロトコルは、細胞系分線決定10の間に活性化する明確なシグナル伝達経路による心筋細胞サブタイプの変化する割合を生み出す。心室CMはMYL2(MLC2v、図2D)でラベル付けされ、心房iPSC-CMはNR2F2(COUP-TFII、図2E)によってマークされます。これらのマーカーは、初期段階のマーカーではなく、より成熟したiPSC-CM(>D30)で高発現されています。
Wnt活性化によるiPSC-CMの拡張
哺乳類では、成体心筋細胞は自己再生のために積極的に分裂しない。この現象は、ヒトのiPSC-CMにも起こる。D30を超えて成熟すると、iPSC-CMの細胞分裂はまれな出来事であり、臨床および産業レベルの大量生産能力を制限します。胚性心筋細胞増殖時の発生環境を模倣するために、CHIR99021によってWnt経路を活性化し、初期のiPSC-CMの増殖を刺激する。D12-14 iPSC-CM(グルコース欠乏による精製後)は、2μM CHIR99021の存在下で低密度で播種されます。Wnt活性化は、iPSC-CMの細胞分裂を刺激し、細胞周期を押し上げG1相を進めることができるCyclin D1(図3A)などの細胞周期調節因子の発現を促進する。興味深いことに、CHIR99021は、コントロールと比較して2つの通路に対して初期のiPSC-CMの堅牢な増殖を可能にする(図3B)。しかし、iPSC-CMの増殖能は、胚性心臓の発達中の限られた十分に制御された心臓増殖と一致する広範な通路(図3B)によって減少する。また、CHIR99021は30日以上の分化に達し、安定したサルコメア構造を発達させると、より成熟したiPSC-CMの膨張を刺激できるとは思えない。
図1: ヒトiPSCリプログラミングと心筋細胞分化(A)患者の血液サンプルの分離後のPBMC層を示す模式図である。(B)拡大されたPBMCは、トランスフェクションの準備ができています。(C) 初期のヒト iPSC コロニー。(D) 通路5に確立されたiPSCライン。(E) ヒトのiPSCは、多能性マーカーOCT4(緑色)とNANOG(赤)に陽性である。核はDAPI(青)によってカウンターされます。(F) 心筋細胞分化プロトコルの概要(G-H)iPSC-CMのサルコメア構造は、TNNT2(緑色)およびαアクチニン(赤色)に対する抗体を用いた免疫蛍光染色法によって明らかにされる。核はDAPI(青)によってカウンターされます。(I) TNNT2に対する抗体を用いたiPSC-CMのFACS分析スケールバー:200μm(B-D)、50μm(EおよびG)、20 μm(H)) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: ヒトiPSC-CMにおける心筋細胞サブタイプ(A-B)心室様(A)及び心房様(B)の代表的な作用電位持続時間(C) ヒトiPSC-CMにおける心室、心房および節線様サブタイプの代表割合。(D-E)D30 iPSC-CMは、心室心筋細胞マーカーMYL2(D)および心房マーカーNR2F2(E)に対する抗体で染色される。細胞は、同時にTNNT2抗体で染色される。核はDAPI(青)によってカウンターされます。スケールバー:50μm(D-E)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Wnt活性化によるヒトiPSC-CMの拡大(A)CYR99021の存在下でサイクリンD1陽性iPSC-CMの割合が増加する。細胞は、TNNT2(赤色)およびサイクリンD1(緑色)に対する抗体で二重染色される。核はDAPI(青)によってカウンターされます。(B)最初の3節において、CHIR99021の有無にかかわらずヒトiPSC-CMの拡張中に細胞数が変化する。Y軸は、セルの数の折り畳み変化を示します。CHIR99021は初期のiPSC-CMの強い増殖を刺激する。スケールバー:50μm(A)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1.分化の18日目にヒトiPSC-CMを打ち負かす. こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ 2.代謝精製後の25日目にヒトiPSC-CMを打ち負かす. こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
iPSCリプログラミングの間、明確な核と細胞質で拡大されるまで1週間培養PBMCsに重要です。PBMCsは増殖しないため、iPSCのリプログラミングを成功させるためには、ウイルス導入に適切な細胞数が重要です。PBMCsの細胞数、感染の多重度(MOI)およびウイルスの価動体は、最適なトランスダクション結果に到達するために考慮され、調整されるべきである。心臓分化の場合、初期シード密度は、chiR99021 が投与された日に iPSC が 90% 以上のコンフルエントに到達するために重要です。一方で、心臓分化時にiPSCのコンフルエントが少ない場合、CHIR99021は毒性があり、実質的な細胞死につながります。一方、iPSCがコンフルエントを超えた場合、自発的な分化が起こって、指向性心臓分化の効率が損なわれます。初期のiPSC-CMの拡張については、タイミングと心筋細胞の品質を考慮する必要があります。初期のiPSC-CMは、心筋細胞の純度が十分に高い場合にのみ、強く増殖することができます。培養中の既存の非心筋細胞もCHIR99021治療に応答して増殖し、初期のiPSC-CMの増殖に悪影響を及ぼす可能性がある。さらに、分化の20日目までに心筋細胞の膨張を刺激することが重要です。iPSC-CMが30日目に通過すると、堅牢な分割を再開することは困難になります。
ヒトiPSCは、最初はレトロウイルス媒介トランスフェクション1,2を介して真皮および肺線維芽細胞に由来した。これらのリプログラミング方法には、患者iPSCの臨床翻訳の進行を妨げる2つの主要な問題があります:1)レトロウイルスが宿主ゲノムに統合され、潜在的な遺伝子変異が導入されます。2)患者由来の線維芽細胞は、多くの患者が衰退する可能性のある皮膚生検を必要とする。本プロトコルでは、商用非統合センダイウイルス23およびPBMCを利用して患者iPSCを強固に導出するプロトコルを記述する。これらのiPSCは外因性のリプログラミングベクターを含まないので、自己再生と多能性を無期限に維持することができます。さらに、患者の血液サンプルは臨床検査室で容易に収集される。当社のプロトコルは汎用性が高く、大規模なリポジトリおよび臨床翻訳24のための患者および疾患固有のiPSCの大量生産に使用できます。
堅牢な心筋細胞分化は、ヒトiPSCからの心臓分化中の特定のシグナル伝達経路の逐次変調によって達成される。心臓の仕様と増殖に関与する主要な経路は、Wnt、BMP、アクチビン、ノッチ、VEGFおよびレチノイン酸(RA)10、12を含む。ここでは、小さい化学物質によるWntシグナル伝達の逐次変調による効率的な心臓分化プロトコルを提示する:最初にCHIR99021による活性化、次にIWR-113、14による阻害。小さい化学薬品は安定しており、成長因子を使用するものと比較して一貫した分化結果を与える。このプロトコルによって生成されるほとんどのiPSC-CMは心室様心筋細胞であり、心房様細胞および結節様細胞と混合される。サブタイプ特異的な心筋細胞の精密生成は、後で分化ステップ10,12を微調整することにより達成される。例えば、IWR-1治療直後にRAを添加すると心房様心筋細胞の割合が高くなるのに対し、RA阻害は心室様iPSC-CM18,22の生成を促進する。分化の後の段階でのWntシグナル伝達活性化は、患者特異的な生物学的ペースメーカー細胞の生成に有望である節因性心筋細胞19、21への心臓前駆細胞の誘導を促進する。
ヒトiPSC-CMは未熟であり、増殖能が限られている25.胚性心臓発達中、増殖が減少する間に成熟が進む。iPSC-CMが、胚性心筋細胞の拡張を反映した、堅牢な増殖のために刺激できる狭いウィンドウがあります。ここでは、WntアクティベーターCHIR99021を使用して、最近のレポート17と一致する期間限定の初期のiPSC-CMの増殖を促進します。Wntシグナル伝達経路は、NOTCHやHippo26、27などの複数の上流経路を持つクロストークを通じて心筋細胞増殖に影響を与える可能性があると推測される。NOTCHシグナル伝達は心筋細胞増殖を促進するのに対し、Hippo経路は心臓の成長と心臓サイズ28、29、30を制限する。NOTCHとHippoの相互作用が下流のWnt活性を決定し、適切な程度の心臓増殖を微調整する方法はまだ不明である。我々のプロトコルは、心室左心症候群(HLHS)や心室中隔(PA-IVS)を伴う肺閉鎖症などの心室心筋細胞の形成不全によって引き起こされる先天性心欠損の疾患メカニズムを研究するための心筋細胞増殖のための興味深いモデルを提供してきた。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、米国心臓協会(AHA)キャリア開発賞18CDA34110293(M-T.Z.)、追加ベンチャーズAVIFおよびSVRF賞(M-T.Z.)、国立衛生研究所(NIH NHLBI)が1R01HL1242245、1R01HL1225220およびR010.I096(D010.6)によって支援されました。明タオ・ジャオ博士は、全国小児病院のアビゲイル・ウェクスナー研究所のスタートアップ資金にも支えられてきました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
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