نقدم بروتوكولا لكشف جذع دماغ الفأر البالغ من الجانب البطني. باستخدام عدسة مؤشر الانحدار الانكسار مع المجهر مصغرة، يمكن استخدام التصوير الكالسيوم لفحص نشاط سوماتا الزيتون العصبية أدنى في الجسم الحي.
الزيتون السفلي (IO) ، نواة في النخاع البطني ، هو المصدر الوحيد لتسلق الألياف التي تشكل أحد مساري الإدخال اللذين يدخلان المخيخ. منذ فترة طويلة اقترح IO أن تكون حاسمة للتحكم في المحركات ويعتبر نشاطها حاليا أن يكون في مركز العديد من الفرضيات من كل من الوظائف الحركية والمعرفية للماخيخ. في حين أن علم وظائف الأعضاء ووظيفته قد درست بشكل جيد نسبيا على مستوى خلية واحدة في المختبر، في الوقت الحاضر لا توجد تقارير عن تنظيم نشاط شبكة IO في الحيوانات الحية. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الموقع التشريحي الصعب للغاية ل IO ، مما يجعل من الصعب الخضوع لطرق التصوير الفلورية التقليدية ، حيث يجب إنشاء مسار بصري من خلال الدماغ بأكمله الموجود بشكل الظهري إلى المنطقة ذات الاهتمام.
هنا نحن وصف طريقة بديلة للحصول على أحدث مستوى الكالسيوم التصوير البيانات من شبكة IO. تستفيد الطريقة من الموقع البطني الشديد ل IO وتنطوي على إجراء جراحي لإدخال عدسة مؤشر الانكسار المتدرجة (GRIN) من خلال أحشاء الرقبة لتلامس السطح البطني لمستشعر الكالسيوم GCaMP6s-Expressing IO في الفئران المخدرة. يظهر تسجيل تصوير الكالسيوم التمثيلي لإثبات جدوى تسجيل نشاط الخلايا العصبية IO بعد الجراحة. في حين أن هذه هي عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة ويجب إجراء التسجيلات تحت التخدير، فإنه يتجنب الضرر لنوى جذع الدماغ الحرجة للحياة ويسمح بإجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التجارب التحقيق في أنماط النشاط الصدغي ملعقة والتكامل المدخلات في IO. يمكن استخدام هذا الإجراء مع تعديلات للتسجيلات في مناطق أخرى مجاورة من جذع الدماغ البطني.
الهدف الرئيسي من نظم علم الأعصاب هو فهم كيف أنماط النشاط الصدغي ملعقة من الشبكات العصبية تسهم في توليد السلوك الحيواني. وهكذا، أصبحت منهجية التصوير الفلورية التي تستخدم المسابير الحساسة للكالسيوم في العقد الماضي أداة رئيسية لفحص نشاط شبكة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية1،2، لأنها تسمح بتصور مثل هذه الديناميكيات عبر المقاييس المكانية التي تتراوح من الخلايا المفردة إلى الدوائر المتوسطة. في السنوات الأخيرة ، تم تصوير النهج الشائع حيث يتم تصوير الدوائر العصبية في هياكل الدماغ السطحية (مثل القشريات الدماغية أو المخيخية) من خلال نافذة الجمجمة الشفافة3 باستخدام عدسات مؤشر الانكسار المتدرجة (GRIN) 4 مما يسمح بفحصديناميكيات الشبكة في هياكل الدماغ العميقة. تسمح عدسات GRIN المتاحة حاليا بالوصول إلى هياكل بعمق عدة ملليمترات ، مثل اللوزة الماوس ، قرن آمون والعصابات القاعدية5. ومع ذلك ، فإن العديد من المناطق ذات الاهتمام مثل النوى المختلفة في النخاع البطني تكمن أعمق بكثير ، مما يضعها في أقصى نطاق وصول عدسة GRIN.
هنا، ونحن نصف كيفية التغلب على هذه الصعوبة من خلال الاستفادة من سهولة الوصول نسبيا من النخاع من خلال الجانب البطني من الدماغ. باستخدام الفئران البالغة حيث الزيتون السفلي (IO) ، نواة في النخاع البطني ، تم إصابة فيروسيا بمستشعر الكالسيوم GCaMP6s ، ونصف الخطوات الجراحية (المعدلة من الطريقة الموصوفة أصلا في Khosrovani وآخرون 20076)لوضع عدسة GRIN على السطح البطني لدماغ فأر مخدر. باستخدام المجهر مصغرة، ونحن نظهر جدوى تسجيل نشاط الخلايا العصبية في مثل هذه المناطق الدماغ البطني للغاية. في حين أن الإجراء هو بالضرورة عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة ولا يمكن إجراء أي تجارب في الحيوانات مستيقظا، والطريقة تسمح بفحص ديناميات الشبكة سليمة في سياق التحفيز المسار الحسي أو غيرها من afferent، وتوفير مزايا واضحة على النهج السابق فيفو مثل استخدام الاستعدادات شريحة حادة.
بما أن العملية الجراحية تنطوي على عمليات أجريت في منطقة الحلق مع العديد من الهياكل الحيوية الحرجة (الشرايين والأعصاب) ، فمن الضروري أن يتم إجراؤها من قبل باحث لديه مهارات جراحية عالية المستوى. وفيما يلي، نسلط الضوء على عدة نقاط رئيسية في الإجراء ون التعليق عليها؛ ومع ذلك ، يجب تذكيره بأنه لا يمكن لأي قدر من المشورة المكتوبة أن يحل محل تجربة الباحث ومهارته وحدسه.
الخطوة الأكثر أهمية في الجراحة هي القصبة الهوائية. وهو ينطوي على قطع القصبة الهوائية، وتحويل isoflurane من مخروط الأنف إلى أنبوب التنبيب، وتأمين القصبة الهوائية إلى جلد الصدر و ربط القصبة الهوائية وأنبوب التنبيب معا. يجب أن تكتمل جميع هذه العمليات بطريقة سلسة وسريعة لتجنب الحوادث، مثل عدم كفاية التخدير، وتدفق السوائل إلى القصبة الهوائية أو أنبوب التنبيب الانزلاق. يجب على المرء أن يبقي البروتوكول واضحا في الاعتبار قبل قطع القصبة الهوائية.
النزيف هو أحد الأسباب الرئيسية لوفاة الحيوانات في هذه الجراحة. وبما أن منطقة الرقبة كثيفة بالأوعية الدموية، فلا ينبغي تنفيذ القطع إلا عندما يكون خط البصر واضحا لتجنب قطع الأوردة والشرايين غير المرئية. لذلك ، يجب إزالة العضلات والأنسجة الضامة التي تحجب الرؤية ، ويجب تنظيف الدم من الشعيرات الدموية المكسورة قبل التقدم.
يمكن إبقاء الحيوان على قيد الحياة لفترة طويلة (أكثر من 8 ساعات) من بداية الجراحة. ومع ذلك، من المهم لإنهاء العملية الجراحية بسرعة حتى يكون هناك المزيد من الوقت لفحص الخلايا العصبية جذع الدماغ عندما حالة فسيولوجية الحيوان جيدة. يمكن للباحث المهرة إنهاء الإجراء بأكمله في 70 دقيقة.
في حين أن الطريقة توفر رؤية نظيفة لأسطح الدماغ البطنية ، فمن المستحيل للأسف القيام بذلك دون إجراء استئصال القصبة الهوائية وكذلك إزالة كمية كبيرة من الأنسجة في منطقة الحلق. لذلك ، لا يمكن السماح للحيوان بالاستيقاظ من التخدير. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أنه من الممكن للحفاظ على الحيوان على قيد الحياة لساعات عديدة مع التكيف الدقيق للتسليم مخدر، والحفاظ على درجة حرارة الجسم والترطيب، فمن المحتم أن التجارب لفترات طويلة سيؤدي في نهاية المطاف إلى إضعاف حالة الحيوان. ويترك الأمر لخبرة الباحث للنظر في المدة القصوى للتسجيلات المستقرة.
وهناك قيد محتمل آخر للطريقة كما هو موضح هنا هو أنه بما أن عدسة GRIN لا يتم إدخالها في بارنشيما الدماغ ، يمكن فحص الخلايا العصبية السطحية نسبيا فقط (~ 150-200 ميكرومتر). في حين أن الزرع الجراحي لعدسة GRIN ممكن تقنيا ، إلا أن طريقة الجراحة الحادة لا تسمح بوقت كاف للخلايا العصبية للتعافي من الإجهاد التأكسدي ووجود الدم بعد الزرع من المرجح أن يؤدي إلى تدهور جودة الصورة بشكل يفوق المقبول.
على الرغم من المخاوف المذكورة أعلاه ، نعتقد أن هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تقديم طريقة للتصوير الحي للخلايا العصبية IO. فإنه يسمح بفحص النشاط الصدغي ملعقة في الخلايا العصبية IO في سياق في الجسم الحي في وجود مدخلات afferent سليمة من النظم الحسية، فضلا عن إشارات من نواة المخيخ وتقاطع mesodiencephalic22، وهو إنجاز لم يكن ممكنا حتى الآن. مع هذه الطريقة ، يمكن الآن التحقيق في وظيفة IO بعمق أكبر مع مزيج من التحفيز الحسي والبتوجيني. وتجدر الإشارة إلى أنه مع تطور تصوير الجهد (مثل طريقتنا الحديثة للتصوير الكهربائي في IO 23)، نأمل أن تلهم الطريقة الجراحية المقدمة العديد من الباحثين لمواجهة التحدي المتمثل في التحقيق في كيفية مساهمة IO في توليد المسامير المعقدة المخيخية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر أندرو سكوت من المركز الإعلامي ل OIST لمساعدته في تسجيل الفيديو وتحريره. أيضا، نشكر هوغو هويدميكر لمساعدته في تطوير الجراحة لفضح جذع الدماغ والدكتور كيفن دورغانز لمساعدته في رسم الرسوم البيانية للأرقام. بالإضافة إلى ذلك ، شكرا جزيلا لسالفاتوري Lacava لصوته عبر السرد ، فضلا عن جميع أعضاء nRIM والحيوانات الأليفة لمواصلة الدعم للرفاه في الأوقات الصعبة من COVID – 19.
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |