Summary
Мы представляем протокол, чтобы разоблачить ствол мозга взрослой мыши с брюшной стороны. С помощью градиентно-рефракционного индексного объектива с миниатюрным микроскопом, кальций изображения могут быть использованы для изучения активности нижней оливковой нервной сомата in vivo.
Abstract
Нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, является единственным источником альпинистских волокон, которые образуют один из двух входных путей, входящих в мозжечок. IO уже давно предлагается иметь решающее значение для управления двигателем и его деятельность в настоящее время считается в центре многих гипотез как двигательных, так и когнитивных функций мозжечка. Хотя его физиология и функция были относительно хорошо изучены на одноклеточном уровне in vitro,в настоящее время нет никаких сообщений об организации сетевой активности IO у живых животных. Это в значительной степени связано с чрезвычайно сложным анатомическим расположением IO, что затрудняет подвержение обычным флуоресцентным методам визуализации, где оптический путь должен быть создан через весь мозг, расположенный dorsally в область интереса.
Здесь мы описываем альтернативный метод получения самых новых данных визуализации кальция на уровне IO. Метод использует экстремальное брюшное расположение IO и включает в себя хирургическую процедуру для вставки градиентно-рефракционного индекса (GRIN) объектив через шею внутренности вступают в контакт с вентальной поверхности датчика кальция GCaMP6s-выражая ИО у анестезированной мышей. Показано, что репрезентативная запись изображений кальция демонстрирует возможность записи активности нейронов IO после операции. Хотя это не выживаемость хирургии и записи должны быть проведены под наркозом, он позволяет избежать повреждения жизненно важных ядер ствола мозга и позволяет проводить большое разнообразие экспериментов, исследуя spatiotemporal модели активности и входной интеграции в IO. Эта процедура с модификациями может быть использована для записи в других, смежных областях брюшного ствола мозга.
Introduction
Основная цель системной нейронауки – понять, как патиотемпоральные модели активности нейронных сетей способствуют генерации поведения животных. Таким образом, флуоресцентная методология визуализации с использованием чувствительных к кальцию зондов в последнее десятилетие стала основным инструментом для изучения активности нейроннойсети у живых животных 1,2 , так как позволяет визуализироватьтакуюдинамику в пространственных масштабах от одиночных клеток до мезомасштабных схем. В последние годы общий подход, при котором нейронные цепи в поверхностных структурах мозга (таких как мозговые или мозжечковые кортисы)изобрагются через прозрачное черепное окно 3, дополняется использованием градиентно-рефракционных линз (GRIN)4, позволяющих изучать динамику сети в глубоких структурах мозга. В настоящее время доступные линзы GRIN позволяют достичь в структуры несколько миллиметров глубиной, такие как мышеловка миндалина, гиппокамп и базальныеганглии 5. Тем не менее, многие области интереса, такие как различные ядра в брюшной медулле лежат значительно глубже, помещая их в крайности досягаемости объектива GRIN.
Здесь мы описываем, как преодолеть эту трудность, воспользовавшись относительно легкой доступностью медуллы через брюшной аспект мозга. Используя взрослых мышей, где нижняя оливка (IO), ядро в брюшной медулле, была вирусно трансфицирована с датчиком кальция GCaMP6s, мы описываем хирургические шаги (измененные из метода, описанного первоначально в Khosrovani и др. 20076), чтобы поместить объектив GRIN на брюшной поверхности мозга обезболивающей мыши. Используя миниатюрный микроскоп, мы демонстрируем целесообразность записи нейронной активности в таких чрезвычайно вентраловых областях мозга. Хотя процедура обязательно не выживаемость хирургии и никаких экспериментов может быть выполнена в бодрствующим животным, метод позволяет изучение нетронутой динамики сети в контексте сенсорной или другой афферентной стимуляции пути, обеспечивая явные преимущества по сравнению с ex vivo-подходов, таких как использование острых препаратов ломтик.
Protocol
Были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные руководящие принципы по уходу и использованию животных. Методы асептической хирургии были применены к инъекции стереотаксиического вируса вектора.
1. Стереотаксисная инъекция переносчика вируса
ПРИМЕЧАНИЕ: Вирус, несущий генетический материал для выражения GCaMP6s (AAV9. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40) стереотаксис вводится как ранееописанные 7,8 со следующими изменениями.
- Используйте кварцевое стекло (внешний диаметр: 1,14 мм, внутренний диаметр: 0,53 мм) вместо борозиликатного стекла для изготовления пипетки с длинным и жестким конусом для впрыска ИО с помощью лазерного капиллярного шкива с параметрами, скорректированными как в руководстве продукта. После вытягивания, отрезать 1-2 мм от кончика пипетки скальпелем, чтобы приобрести 8-10 мм длиной конус с 15-20 мкм внутреннего диаметра кончика(рисунок 1a). Завершите пипетку, скошенный его кончик до 30 "формы иглы с вращающейся микропипетой beveler для облегчения проникновения мозга и меньше изгиба пипетки(рисунок 1a).
ПРИМЕЧАНИЕ: Широко используемые borosilicate стеклянная пипетка будет слишком гибким, чтобы правильно целевой глубоких областях, когда вытащил до этой длины. Инжектор нанолитров был использован со стеклянной пипеткой для доставки вируса в этом исследовании. Кроме того, можно использовать высокоточный стеклянный шприц или инжектор давления. - Убедитесь, что грудь мыши лежит на тепловой панели, чтобы ее шея не растягивается с достаточной поддержкой тела, и быть очень осторожным с выравнивание черепа при фиксации мыши на стереотаксис кадр (Рисунок 1b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разница Брегма-ламбда должна быть менее 0,05 мм в вертикальном измерении. - Используйте 6,2 мм хвостовой, ±0,5 мм боковой и 6,6 мм брюшной относительно брегмы в качестве координат для ориентации основного ядра IO (рисунок 1c).
ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное выравнивание мозга значительно увеличит уровень успеха инъекций вируса в IO. Координаты должны быть подтверждены экспериментатором, так как ожидаются значительные различия между лабораториями, штаммами мышей и отдельными исследователями. Для подготовки видеоматериалов для этой публикации мы использовали одну мужскую мышь C57Bl/6J. - Следуйте соответствующим институциональным руководящим принципам послеоперационного ухода и жилищных процедур для вирусно-трансфицированных животных в течение 3-4 недель.
Рисунок 1: Стереотаксис вирус вектор инъекции. (a ) лазерный вытащил кварцевый стеклянный пипетка имеет 10-12 мм длиной прямо конус. После вытягивания, отрезать 1-2 мм от кончика. Пипетка завершается путем скошения кончика до 30 "формы иглы. b)правильная инъекция зависит от правильного положения тела мыши в стереотаксисной раме. Подтмить грудь мыши, чтобы предотвратить растяжение шеи. Уровень мыши голову путем выравнивания брегма и lambda горизонтально. c)Координация IO по отношению к брегме показана в спинной вид (слева) черепа мыши и коронального вида (правый верх) мозга. Инъекция достигает боковой части основного (IOPr) и спинного (IOD) субнуклея IO (правое дно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
2. Подготовка инструментов и расходных материалов для операции на брюшном подходе
- Подготовьте интубацию трубки, разрезая 5-6 мм в длину и 0,8 мм в ширину щели от кончика 20-го калибра катетера, чтобы интубированное животное может выдохнуть(рисунок 2a).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез необходим для животных, чтобы выдыхать, если общий испаритель изофлурана с постоянным потоком воздуха используется. Если вентилятор используется в дополнение к испаритель, катетер может быть оставлен нетронутым. - Подготовь тупую иглу для поддержки трахеи во время трахеотомии. Отрежьте острый кончик 25-го калибра иглы плоскогубцами. Гладкая поверхность перелома с наждачной бумагой. Согните тупую иглу в середине примерно до 15 "с плоскогубцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изогнутая игла поднимает трахею мягко. Это может уменьшить деформацию трахеи. - Разбавить 50 мг/мл кетамина солевым раствором до 15%. Окончательная концентрация составляет 7,5 мг/мл.
- Соберите чистые хирургические инструменты и расходные средства, включая лидокаин гель, солевой раствор, желатин губки, абсорбющие тампоны, вазелин и чистящие ткани.
- Включите испаритель изофлюран. Установите грелку для животных до 38 градусов по Цельсию.
- Поверните носовой конус стереотаксиальной рамы на 180 градусов по горизонтали, чтобы мышь можно было зафиксировать в вентральную сторону рамы вверх. Отрегулируйте высоту конуса носа так, чтобы он был на уровне ушных батончиков.
3. Администрация анестезии и подготовка мыши к операции
- Взвесить животное с весовой шкалой и рассчитать количество разбавленного кетамина для инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество кетамина необходимо 56,25 мг на кг массы тела. Таким образом, объем разбавленного кетамина составляет 7,5 мл на кг массы тела. Недостатки использования кетамина только включают плохое расслабление мышц, тахикардия и повышенный мышечный тонус9. В этом протоколе, однако, кетамин используется только для покрытия 10-20 с период, в течение которого изофлуран администрации прерывается из-за трахеотомии. Сохраняя этот шаг как можно более кратким, анестезия эффект изофлюран не значительно уменьшается и недостатки с использованием кетамина сведены к минимуму. - Поместите мышь в анестетической индукционной камеры предварительно заполнены 5% изофлюран. Когда животное полностью обезболено, показано на потере правого рефлекса и более глубокой и медленной дыхательной модели, переключите поток изофлюрана на носовой конус стереотаксиаической рамы и уменьшите концентрацию изофлюрана до 2,5%.
- Зафиксите животное в стереотаксисной раме брюшной стороны вверх(рисунок 2b). Отрегулируйте высоту и высоту носового конуса, чтобы убедиться, что животное может дышать легко. Держите животное в тепле с предварительно разогретой грелкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие нижней части тела животного с куском бумаги или алюминиевой фольги может помочь поддержанию температуры животного. - Удалите волосы на коже в области горла и бедра с бритвой и кремом для удаления волос(рисунок 2b). Местно нанесите лидокаин гель на кожу горла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик насыщения кислорода зажимом бедра периферического (SpO2), который будет использоваться в процедуре 6, лучше всего работает на лысой коже. - Мониторинг температуры животных с ректальным термометром(рисунок 2b).
- Ввись 1 мл теплого (37 градусов по Цельсию) солевого интраперитонеально, чтобы компенсировать потерю жидкости во время операции.
- Оцените глубину анестезии сильным щепоткой на задних конечность ног. Не следует вызывать никаких обнаруживаемых ответов.
Рисунок 2: Подготовка операции брюшного подхода. (a)Подготовка интубации трубки путем резки 5-6 мм в длину и 0,8 мм в ширину щели в кончике 20-го калибра катетера. b)Смонтировать вентралую сторону животного в стереотаксисной раме и настроить угол конуса носа, чтобы животное легко дышало. Бритье кожи вокруг горла и бедер областях. Прикрепите датчик SpO2 к бедру для мониторинга жизненно важных признаков мыши. Вставьте зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
4. Трахеотомия и интубация (20-25 мин)
- Разоблачение трахеи.
- Сделайте вертикальный разрез в коже горла вдоль средней линии. Отделить кожу шеи от внутренностей под ним с помощью тупого метода вскрытия и отрезать кожу, чтобы выявить слюнные железы(рисунок 3a-b, 4a).
- Бесплатные слюнные железы из соединительной ткани и перевернуть их боковой подвергать стернотиреоидной мышцы покрыты трахеи с силами (Рисунок 3b-c).
ПРИМЕЧАНИЕ: вазелин может быть применен на открытых тканей, чтобы держать их влажными. Избегайте области трахеи, чтобы держать его в чистоте для следующих шагов.
- трахеотомия
- Вводят первую дозу разбавленного кетамина (7,5 мг/мл) интраперитонально, 5 мл на кг массы тела (37,5 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает 3-5 мин для кетамина функционировать, таким образом, первая доза кетамина должны быть введены до отделения трахеи от окружающих мышц и кровеносных сосудов. Кетамин вводят в двух инъекциях из-за повышенного риска передозировки эффектов в сочетании с изофлюран анестезии. - Тщательно разделить стернотиреоидной мышцы вдоль средней линии с кончиком тонкой типсов подвергать трахеи (Рисунок 3c). Отсоедините трахею от кровеносных сосудов и пищевода с помощью типса методом тупого вскрытия.
- Интраперитонально вводят вторую дозу разбавленного кетамина (7,5 мг/мл), 2,5 мл на кг массы тела (18,75 мг/кг).
- Вставьте тупую иглу под трахею поперечно, чтобы поддержать его (Рисунок 3d). Держите эту иглу пальцами, чтобы поддержать трахею. Руководство швовая нить вокруг третьего кольца трахеи caudal к щитовидной железе с половиной круга иглы(рисунок 3d). Сделайте четыре инструментальных галстука на этом трахеенном кольце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нить, привязанная к трахее кольцо используется для обеспечения трахеи к груди животного. Не отрезай нить от иглы полукругового круга на этом шаге. Трахеальные кольца сделаны из хряща, который является гибким, но менее сильным, чем кости. Не завязывая шовную нить слишком туго или кольцо может сломаться. - Pinch груди кожи с парой щипев. Пирс груди кожи с той же половины круга иглы, используемые в последний шаг и привести нить через кожу, в рамках подготовки к обеспечению трахеи к груди в следующем шаге (Рисунок 3d).
- Аккуратно поднимите трахею, потянув нить, привязанную к трахеальному кольцу, и разрежьте трахею рострал к связанному кольцу и хвостовую к щитовидной железе. Потяните каудальную трахею к груди. Поднимите отверстие трахеи, добавив небольшой кусочек хирургической губки под ним.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что более 5 минут прошло после второй инъекции кетамина перед резки трахеи для обеспечения уровня анестезии. - Удалите оставшуюся жидкость внутри открывающейся кончика трахеи тонкой полоской чистящих тканей. Переключите поток изофлюрана из стереотаксийного конуса носа на инубную трубку. Вставьте интубацию трубки в трахею глубиной около 2 мм и убедитесь, что часть щели в трубке остается за пределами трахеи, чтобыдыхание (рисунок 3e, 4b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно отрегулируйте угол трубки и глубину вставки, чтобы мышь дышала плавно и не повреждала трахею. Нефтяное желе может быть применено на внешней стороне трахеи, чтобы предотвратить его от высыхания, так что трахея не разрыв легко. - Зафиксите трахею на коже грудной клетки, сделав 3-4 инструментальных связей. Свяжите трахею с шовной нитью, чтобы обеспечить трубку иноподации(рисунок 3e, 4b).
- Вводят первую дозу разбавленного кетамина (7,5 мг/мл) интраперитонально, 5 мл на кг массы тела (37,5 мг/кг).
Рисунок 3: Трахеотомия и итонация мыши. (a-c) панели показывают процесс разоблачения трахеи. а)Удалить горло кожи, перерезав вдоль пунктирной линии. b)Переверните слюнные железы (SG) сбокулом, чтобы разоблачить трахею, покрытую стернотиреоидной мышцей (SM). c)Разрежьте открытый SM вдоль пунктирной линии, чтобы разоблачить трахею. (d-e) панели показывают трахеотомию. d)поддержка трахеи тупой и изогнутой иглой. Привяжу третье кольцо трахеи к щитовидной железе для обеспечения трахеи к коже грудной клетки. e)Нанесите изофлюран с инубляторной трубкой с разрезом в кончике. Закрепеть трахею к коже грудной клетки швовой нитью. Закрепейте интубацию трубки к трахее, связывая их вместе. Масштабная планка в 5 мм, применяется ко всем панелям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схематическая диаграмма операции брюшного подхода с бокового вида. (a)Схематический рисунок с соответствующими анатомическими частями, указанными в их относительном расположении, когда мышь помещается вентральную сторону вверх. Сокращения: атлас мышечного покрытия (AM), продольные мышцы (ЛМ), слюнные железы (SG), стернотиреоидные мышцы (SM), щитовидная железа (TG). b)Схема расположения трубки инотубации по отношению к трахее, когда трахеотомия завершена. Трахея обеспечивается связями на коже грудной клетки (T-трахея). Индубация трубки (IT) обеспечивается связей вокруг трахеи конца (Т-трубка). c)Удалите атлас передней клубней (AAT), чтобы очистить линию зрения от IO. d)Схема, описывающая позиционирование миниатюрного микроскопа (ММ) и объектива GRIN над IO для эксперимента с визуализацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
5. Разоблачение ствола мозга (40-45 мин)
- Разрежьте грудитиреоидную мышцу вдоль мышечного волокна с помощью тонких типсов. Вырезать изолированную часть с весенними ножницами (Рисунок 3e).
- Тщательно освободите оставную трахею и гортань от мышц, чтобы свести к минимуму повреждения кровеносных сосудов в мышцах. Удалите оставную трахею и гортань. Освободите пищевод от прикрепленной ткани типсами и отрежьте его весенними ножницами. (Рисунок 5a).
- Удалите мышцы, покрывающие вентерающую арку и переднюю клубень атласа с мелкими тибрями и пружинные ножницы(рисунок 5b).
ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении мышцы, разделить его часть с кончиком тонкой типсов. Отрежьте отделенную часть ножницами весны. Повторите это несколько раз, чтобы разоблачить атлас брюшной арки, чтобы свести к минимуму риск разрыва кровеносных сосудов. - Вырезать вентрал арки атласа с rongeur(рисунок 4c, 5c). Удалите переднюю клубень атласа. Удалите кровь и жидкость с хирургической губкой, чтобы посмотреть foramen magnum и ствол мозга(рисунок 4c, 5d).
- Расширьте foramen magnum путем удаления затылочной кости с rongeur. (Рисунок 5d-e).
- Удалите тонкий хрящ над foramen magnum с тонкими миппами и весенними ножницами. Тщательно очистить периостеальный слой dura mater с тонкой типсов, чтобы иметь четкое представление о брюшной ствол мозга (Рисунок 5f). Не ломай дура-матер.
Рисунок 5: Разоблачить ствол мозга мыши для изображения кальция. (a-f) панели показывают процесс разоблачения ствола мозга. a)Удалить стернотиреоидную мышцу (SM), помеченную на рисунке 3e. Отрежьте гортань и пищевод. b)Удалить продольную мышцу (ЛМ) и атлас мышечного покрытия (AM). c)Вырезать атласные вентрал арки (АВА) с помощью rongeur и удалить атлас передней клубней (AAT). d)отрезать затылчной кости (OB), чтобы расширить foramen magnum (FM). (e)Расширенный FM.( f) Тонкий хрящ выше foramen magnum удаляется. Периостейный слой dura mater снимается. Квадрат указывает на область, содержащую поверхностные нейроны IO. g)Изображение IO с объективом GRIN. Масштабная планка в 5 мм, применяется к a-c. Шкала бар в d'2 мм, применяется к d-e. Масштабная планка в 2 мм. Масштабная планка в 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
6. Кальций изображения
- Зажим датчик SpO2 на бедре мыши для мониторинга жизненно важных признаков, таких как частота сердечных сокращений, насыщение кислородом и частота дыхания (Рисунок 2b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сердечных сокращений должна быть между 500 bpm и 600 bpm, насыщение кислородом должно быть выше, чем 90%, и частота дыхания должна быть 50-70 вдохов вминуту 10,11. - Намонтировать зонд объектива GRIN (диаметр 9 мм. 1 мм) на имплантативном стержне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите объектив GRIN с 70% пропитанной этанолом очистки тканей перед визуализацией для хорошего качества изображения. - Зафиксировать имплантатный стержень на стереотаксисной раме и установить миниатюрный микроскоп на имплантатацию стержня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка миниатюрного микроскопа для визуализации должна быть завершена в соответствии с соответствующими рекомендациями пользователя продукта. - Добавьте несколько капель теплого солевого раствора в область ствола мозга для погружения в объектив GRIN.
- Подойди к стволу мозга с объективом GRIN(рисунок 4d, 5g). Включите возбуждение синий светодиод (455 ± 8) в миниатюрном микроскопе. Найдите GCaMP6s-трансфицированных нейронов IO путем мониторинга флуоресценции изображения из миниатюрного микроскопа. Ищите нейроны IO в прямоугольной области 0,5-1,7 мм рострал к оставшемуся атласу и 0,6-1,1 мм боковой к средней линии в поверхностной области брюшного ствола мозга(рисунок 5f).
ПРИМЕЧАНИЕ: При поиске соответствующего поля зрения для визуализации IO ищите место, где средний диаметр сомата совпадает с диаметром IO нейрона сомата (около 15мкм 12). Соседние регионы в медуллярном ретикулярном образовании состоят из значительно большихклеток 13,14. Будьте осторожны при перемещении объектива GRIN вертикально, так как нажатие его на ствол мозга слишком сильно может убить животное.
7. Евтанизация животных после процедуры
- В конце эксперимента усыпляйте животное с помощью вывиха шейки матки или другим методом, одобренным местной лабораторной регуляцией по уходу за животными.
- Для дальнейшего исследования гистологии, сначала анестезировать животное с инъекционным препаратом, таким как кетамин / ксилазин сочетание (100 мг/кг и 10 мг/кг,соответственно) 15 до перфузии сердца с решением Ringer следуют фиксативное решение для исправления мозга.
8. Обработка данных
- Предварительная обработка записанного видео с изображением кальция перед анализом данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага использовалось коммерческое программное обеспечение для обработки данных в сопровождении миниатюрного микроскопа, и к этому относятся следующие этапы протокола. Кроме того, бесплатное и открытое программное обеспечение, такое как CaImAn16,MINIPIPE17и MiniscoPy18, может быть использовано как для предварительной обработки, так и для анализа.- Загрузите записанное видео с изображением кальция в программное обеспечение для обработки данных.
- Нажмите кнопку Preprocess. Определите площадь урожая, исключая регионы без флуоресцентных нейронов и обуработав видео, чтобы уменьшить размер файла для более быстрой обработки.
- Нажмите кнопку пространственного фильтра. Установите низкий отключок и высокий отключок для пространственного фильтра до 0,005пикселя -1и 0,5пикселя -1 соответственно. Нанесите пространственный фильтр на каждый кадр видео, чтобы увеличить контрастность и сгладить изображение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственный фильтр является полосой Госсианого фильтра. Низкочастотные компоненты, происходящие из внефокусных ячеек, могут сбить с толку коррекцию движения на следующем этапе. Компонент высокой пространственной частоты может привести к тому, что видео будет казаться менее гладким. - Нажмите кнопку Коррекция движения. Примените коррекцию движения к видео, используя первый кадр в качестве эталонного кадра, чтобы уменьшить связанные с движением артефакты, вызванные кровотоком в стволе мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция движения использует метод регистрации изображений, разработанный Thevenaz et al19. - Экспорт скорректированного движения видео в формате TIFF.
- Применить CNMF-E20 на движение исправленное видео в MATLAB для выявления отдельных нейронов, следуя инструкциям для кода CNMF-E MATLAB в онлайн-хранилище21.
ПРИМЕЧАНИЕ: CNMF-E является ограниченным не-негативный подход факторизации матрицы настроены для однофотонной визуализации. Демо-скрипты в репозитории могут быть изменены и использованы для обработки данных.
Representative Results
Здесь мы представляем репрезентативную запись, полученную методом, как описано. На рисунке 6a показано расположение ярко помеченных клеток IO, визуализированых в ходе эксперимента. Темные диагональные полосы кровеносных сосудов. Обратите внимание на переменную яркость отдельных клеток, в результате переменной эффективности трансфекции. На панели Рисунок 6b мы показываем средние нормализованные интенсивности флуоресценции (deltaF/F) следы, полученные из сомата указано с цветами и числами в панели. Отклонения вверх представляют собой переходное увеличение внутриклеточного кальция. Обратите внимание, как различное выражение GCaMP6s (отраженное в яркости ячейки в панели a) приводит к переменным соотношениям сигнала к шуму (SNR).
Рисунок 6: Пример записи активности нейронов IO в анестезированных мыши. ( ) Представитель пример кадра из записи после пространственной фильтрации. Яркими пятнами являются IO нейрональной сомата, некоторые из которых были указаны как регионы интересов (ROIs, цветные числа). Темные полосы кровеносных сосудов. b) Примерследов deltaF/F, полученных из ROIs, указанных в панели a. Отклонения вверх отражают увеличение сигнала кальция. Масштабная планка в a'10 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Discussion
Поскольку хирургическая процедура включает в себя операции, выполняемые в области горла с многочисленными жизненно важными структурами (артериями, нервами), важно, чтобы она проводилась исследователем с высоким уровнем хирургических навыков. Далее мы выделяем и комментируем несколько ключевых моментов процедуры; однако, следует напомнить, что никакое количество письменных советов не может вытеснить опыт, мастерство и интуицию исследователя.
Наиболее важным шагом в хирургии является трахеотомия. Она включает в себя резки трахеи, переключение изофлюрана из конуса носа в инубации трубки, обеспечение трахеи к коже грудной клетки и связывания трахеи и инубации трубки вместе. Все эти операции должны быть завершены в гладкой и быстрой манере, чтобы избежать несчастных случаев, таких как неадекватная анестезия, приток жидкости в трахею или инуляции трубки соскальзывания. Нужно иметь протокол ясно в виду, прежде чем резки трахеи.
Кровоизлияние является одной из основных причин смерти животных в этой операции. Так как область шеи плотная с кровеносными сосудами, разрез должен быть выполнен только тогда, когда линия видимости ясна, чтобы избежать резки невидимых вен и артерий. Таким образом, мышцы и соединительные ткани, заслоняющие зрение, должны быть удалены, а кровь из сломанных капилляров должна быть очищена перед продвижением.
С начала операции животное может прожить в живых длительное время (более 8 часов). Тем не менее, важно закончить хирургическую процедуру быстро, так что больше времени для изучения нейронов ствола мозга, когда физиологическое состояние животных хорошее. Квалифицированный исследователь может закончить всю процедуру за 70 минут.
Хотя метод обеспечивает чистый вид поверхностей брюшного мозга, это, к сожалению, невозможно сделать это без выполнения трахеотомии, а также удаление значительного количества тканей в области горла. Поэтому животному нельзя позволить проснуться от наркоза. Кроме того, несмотря на то, что животное можно поддерживать в живых в течение многих часов при тщательной корректировке анестезии, поддержании температуры тела и гидратации, неизбежно, что длительные эксперименты в конечном итоге приведет к ослаблению состояния животного. Это оставлено на экспертизу исследователя, чтобы рассмотреть максимальную продолжительность стабильных записей.
Еще одно потенциальное ограничение метода, описанное здесь, заключается в том, что, поскольку объектив GRIN не вставляется в паренхиму мозга, можно изучить только относительно поверхностные нейроны (150-200 мкм). В то время как хирургическая имплантация объектива GRIN технически возможна, метод острой хирургии не позволяет достаточно времени для нейронов, чтобы оправиться от окислительного стресса и наличие крови после имплантации, вероятно, ухудшит качество изображения за пределами приемлемого.
Несмотря на вышеуказанные опасения, мы считаем, что это первый раз, когда метод для виво изображения нейронов IO представлен. Это позволяет изутовить spatiotemporal деятельности в нейронах IO в контексте in vivo в присутствии нетронутых афферентных входов от сенсорных систем, а также сигналов от мозжечковых ядер и мезодиенцефалическогосоединения 22, подвиг, который не был возможен до сих пор. С помощью этого метода, функция IO теперь может быть исследована в большей глубине с сочетанием сенсорной и оптогенетической стимуляции. Примечательно, что с эволюцией визуализации напряжения (например, наш недавний метод визуализации напряжения в IO 23), мы надеемся, что представленный хирургический метод будет вдохновлять многочисленных исследователей взять на себя задачу изучения того, как IO способствует генерации мозжечковых сложных шипов.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Эндрю Скотта из медиа-центра OIST за помощь в записи и редактировании видео. Кроме того, мы благодарим Хьюго Hoedemaker за его помощь в разработке хирургии разоблачить ствол мозга и д-р Кевин Дорганс за его помощь в рисовании диаграмм для цифр. Кроме того, большое спасибо Сальваторе Лакаве за его закадровый голос, а также всем членам nRIM и домашним животным за постоянную поддержку благополучия в трудные времена COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
