我们提出一个协议,从心室侧暴露成年小鼠的脑系统。通过使用带微型显微镜的梯度折射指数透镜,钙成像可用于检查体内低劣橄榄神经索玛塔的活性。
劣质橄榄(IO)是心室中核中的一个核,是攀爬纤维的唯一来源,形成进入小脑的两条输入通道之一。长期以来,IO一直被认为是运动控制的关键,其活动目前被认为是小脑运动和认知功能的许多假设的中心。虽然其生理和功能 在体外单细胞水平上得到了较好的研究,但目前还没有关于活体动物IO网络活动的组织报告。这主要是因为 IO 的解剖位置极具挑战性,因此很难采用传统的荧光成像方法,即必须通过整个大脑在感兴趣的区域内创建一条光学路径。
在这里,我们描述了从 IO 网络获取最新水平的钙成像数据的替代方法。该方法利用 IO 的极端腹腔位置,并涉及通过颈部内脏插入梯度折射指数 (GRIN) 透镜的外科手术,以接触麻醉小鼠中钙传感器 GCaMP6s 表达 IO 的腹腔表面。显示具有代表性的钙成像记录,以证明在手术后记录 IO 神经元活动的可行性。虽然这是一个非生存手术,录音必须在麻醉下进行,它避免了对生命临界脑系统核的损害,并允许进行各种各样的实验,调查空间活动模式和输入集成在IO。此程序具有修改可用于在心室脑系统的其他相邻区域进行记录。
系统神经科学的主要目标是了解神经元网络的空间活动模式如何促进动物行为的生成。因此,利用钙敏感探针的荧光成像方法在过去十年中已成为研究活体动物神经元网络活动的主要工具,因为它允许在从单个细胞到中尺度电路等空间尺度上可视化这些动态。近年来,通过透明颅窗3对表面大脑结构(如大脑或脑皮质)中的神经回路进行成像的常见方法,辅之以梯度折射索引(GRIN)镜头4,允许检查深层大脑结构中的网络动力学。目前可用的GLEN镜片允许进入几毫米深的结构,如小鼠杏仁核,海马和基底黑猩猩5。然而,许多感兴趣的区域,如心室中的各种核,都位于显著更深的位置,将它们置于GRN镜头到达的极致。
在这里,我们描述了如何克服这一困难,利用通过大脑的腹腔方面相对容易获得的美杜拉。我们使用成年小鼠,其中低劣的橄榄(IO),在心室中核,已被病毒性地通过钙传感器GCaMP6s传播,我们描述了手术步骤(修改从最初在Khosrovani等人描述的方法2007年6),把一个GIRN镜头放在麻醉小鼠的大脑的腹腔表面。我们使用微型显微镜演示了记录这种极端心室大脑区域神经元活动的可行性。虽然该程序必然是非生存手术,不能在清醒动物身上进行实验,但该方法允许在感官或其他无动于衷的通路刺激的背景下检查完整的网络动力学,比使用急性切片制剂等前活体方法具有明显的优势。
由于外科手术涉及在喉咙区域进行,具有许多至关重要的结构(动脉、神经),因此必须由具有高级外科技能的研究人员进行。在以下过程中,我们重点介绍和评论程序的几个要点:然而,必须提醒的是,任何书面建议都不能取代研究人员的经验、技能和直觉。
手术中最关键的一步是气管切除术。它包括切割气管,将异氟烃从鼻锥切换到插管,将气管固定在胸皮上,并将气管和插管绑在一起。所有这些操作必须平稳快速地完成,以避免意外事故,如麻醉不足、液体流入气管或管内脱落。在切割气管之前,必须牢记协议。
出血是这次手术中动物死亡的主要原因之一。由于颈部区域与血管密密麻麻,切口应仅在视线清晰时执行,以避免切割看不见的静脉和动脉。因此,必须切除遮挡视力的肌肉和结缔组织,并且必须在推进前清洗破裂毛细血管中的血液。
从手术开始,动物可以存活很长时间(超过8小时)。然而,快速完成外科手术很重要,所以当动物生理状况良好时,有更多的时间检查脑干神经元。熟练的研究人员可以在70分钟内完成整个过程。
虽然该方法提供了心室大脑表面的干净视图,但不幸的是,如果不进行气管切除术以及去除咽喉区域的大量组织,就不可能做到这一点。因此,不能允许动物从麻醉中醒来。此外,即使通过仔细调整麻醉剂的分娩、保持体温和水化,可以使动物存活数小时,但长期实验最终会导致动物状况的恶化,这是不可避免的。由研究人员的专业知识来考虑稳定录音的最大持续时间。
此处描述的方法的另一个潜在限制是,由于 GRIN 镜头未插入大脑帕奇马,因此只能检查相对肤浅的神经元(+150-200μm)。虽然在技术上可以植入G GRIN镜片,但急性手术方法不允许神经元有足够的时间从氧化应激中恢复,植入后血液的存在可能会降低图像质量,超出可接受性。
尽管有上述担忧,但我们相信这是首次提出 IO 神经元的 体内 成像方法。它允许在 体内 环境中检查IO神经元的空间显微活动,在感觉系统以及来自脑核和中脑结22的信号的情况下,这是迄今为止不可能实现的壮举。有了这种方法,现在可以通过感官和光遗传刺激的结合更深入地研究IO的功能。值得注意的是,随着电压成像(例如我们最近采用的 IO 23电压成像方法),我们希望采用的手术方法将激励众多研究人员接受挑战,研究 IO 如何有助于产生小脑复合尖峰。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢来自OIST媒体中心的安德鲁·斯科特在视频录制和编辑方面所做的帮助。此外,我们感谢雨果·霍德梅克帮助开发手术,以暴露脑干和凯文·多根斯博士的帮助绘制图表的数字。此外,非常感谢萨尔瓦托雷·拉卡瓦的画外音旁白,以及所有NRIM成员和宠物在COVID-19的艰难时期继续支持福祉。
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |