Vi præsenterer en protokol til at afsløre hjernestammen af voksen mus fra ventralsiden. Ved at bruge en gradient-brydningsindeks linse med en miniature mikroskop, kan calcium imaging bruges til at undersøge aktiviteten af ringere oliven neurale somata in vivo.
Ringere oliven (IO), en kerne i ventral medulla, er den eneste kilde til klatring fibre, der udgør en af de to input veje ind i lillehjernen. IO har længe været foreslået at være afgørende for motorisk kontrol og dens aktivitet er i øjeblikket anses for at være i centrum for mange hypoteser af både motoriske og kognitive funktioner i lillehjernen. Mens dens fysiologi og funktion er blevet relativt godt undersøgt på enkeltcelleniveau in vitro, er der i øjeblikket ingen rapporter om organiseringen af IO-netværksaktiviteten hos levende dyr. Dette skyldes i høj grad IO’s ekstremt udfordrende anatomiske placering, hvilket gør det vanskeligt at underkaste sig konventionelle fluorescerende billeddannelsesmetoder, hvor der skal skabes en optisk sti gennem hele hjernen, der ligger dorsalt til interesseregionen.
Her beskriver vi en alternativ metode til at opnå state-of-the-art-niveau calcium imaging data fra IO-netværket. Metoden udnytter IO’s ekstreme ventrale placering og involverer en kirurgisk procedure for indsættelse af et gradient-refraktivt indeks (GRIN) linse gennem nakke indvolde for at komme i kontakt med calciumsensorens ventrale overflade GCaMP6s-udtryk IO i bedøvede mus. En repræsentativ calcium imaging optagelse er vist at demonstrere muligheden for at registrere IO neuron aktivitet efter operationen. Selv om dette er en ikke-overlevelse kirurgi og optagelserne skal udføres under anæstesi, det undgår skader på liv-kritiske hjernestammen kerner og giver mulighed for at gennemføre et stort udvalg af eksperimenter undersøge spatiotemporal aktivitetsmønstre og input integration i IO. Denne procedure med modifikationer kan bruges til optagelser i andre tilstødende områder af ventrale hjernestammen.
Hovedformålet med systemer neurovidenskab er at forstå, hvordan spatiotemporal aktivitetsmønstre af neuronale netværk bidrager til generation af dyrs adfærd. Således fluorescerende billeddannelse metode udnytte calcium-følsomme sonder er i det seneste årti blevet et hovedværktøj til at undersøge neuronale netværk aktivitet i levende dyr1,2, da det giver mulighed for visualisering af en sådan dynamik på tværs af rumlige skalaer lige fra enkelt celler til mesoscale kredsløb. I de senere år er den fælles tilgang, hvor neurale kredsløb i overfladiske hjernestrukturer (såsom cerebrale eller cerebellar cortices) er afbildet gennem et gennemsigtigt kranievindue3, blevet suppleret med brugen af gradient-refraktivt indeks (GRIN) linser4, der tillader undersøgelse af netværksdynamik i dybe hjernestrukturer. I øjeblikket tilgængelige GRIN linser tillader at nå ind i strukturer flere millimeter dyb, såsom musen amygdala, hippocampus og basal ganglier5. Men mange regioner af interesse såsom forskellige kerner i ventral medulla ligger betydeligt dybere, placere dem på det yderste af GRIN linse nå.
Her beskriver vi, hvordan man overvinder denne vanskelighed ved at drage fordel af den relativt lette tilgængelighed af medulla gennem hjernens ventrale aspekt. Ved hjælp af voksne mus, hvor den ringere oliven (IO), en kerne i ventral medulla, er blevet viralt transfected med en calciumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiske trin (modificeret fra den metode, der oprindeligt er beskrevet i Khosrovani et al. 20076) for at placere en GRIN-linse på den ventrale overflade af hjernen på en bedøvet mus. Ved hjælp af et miniaturemikroskop demonstrerer vi muligheden for at registrere neuronal aktivitet i sådanne ekstremt ventrale hjerneområder. Mens proceduren nødvendigvis er en ikke-overlevelseskirurgi, og der ikke kan udføres forsøg hos vågne dyr, tillader metoden undersøgelse af intakt netværksdynamik i forbindelse med sensorisk eller anden afferent stimulering, hvilket giver klare fordele i forhold til ex vivo-tilgange såsom brug af akutte skivepræparater.
Da den kirurgiske procedure involverer operationer udført i halsregionen med mange vitalt kritiske strukturer (arterier, nerver), er det vigtigt, at det udføres af en forsker med kirurgiske færdigheder på højt niveau. I den følgende forbindelse fremhæver og kommenterer vi flere centrale punkter i proceduren. Det skal dog erindres, at ingen mængde skriftlig rådgivning kan erstatte forskerens erfaring, dygtighed og intuition.
Det mest kritiske skridt i operationen er trakeotomi. Det indebærer at skære luftrøret, skifte isoflurane fra næsekeglerne til intubationsrøret, sikre luftrøret til brysthuden og binde luftrøret og intubationsrøret sammen. Alle disse operationer skal udføres på en smidig og hurtig måde for at undgå ulykker, såsom utilstrækkelig anæstesi, tilstrømning af væske til luftrør eller intubationsrør slip-off. Man skal holde protokollen klar i tankerne, før du skærer luftrøret.
Blødning er en af de vigtigste årsager til dyrs død i denne operation. Da nakkeområdet er tæt med blodkar, bør snit kun udføres, når synslinjen er klar for at undgå at skære usete vener og arterier. Derfor skal muskler og bindevæv, der slører synet, fjernes, og blod fra brudte kapillærer skal rengøres, før de går videre.
Dyr kan holdes i live i lang tid (mere end 8 timer) fra operationens start. Det er dog vigtigt at afslutte den kirurgiske procedure hurtigt, så der er mere tid til at undersøge hjernestamme neuroner, når dyrets fysiologiske tilstand er god. En dygtig forsker kan afslutte hele proceduren på 70 min.
Mens metoden giver et rent overblik over ventrale hjerneoverflader, er det desværre umuligt at gøre det uden at udføre en trakeotomi samt fjerne betydelig mængde væv i halsregionen. Derfor kan dyret ikke få lov til at vågne fra anæstesi. Selvom det er muligt at holde dyret i live i mange timer med omhyggelig justering af bedøvelseslevering, opretholdelse af kropstemperatur og hydrering, er det uundgåeligt, at langvarige forsøg i sidste ende vil føre til svækkelse af dyrets tilstand. Det er op til forskerens ekspertise at overveje den maksimale varighed af stabile optagelser.
En anden potentiel begrænsning af metoden som beskrevet her er, at da GRIN-linsen ikke indsættes i hjernen parenchyma, kan kun relativt overfladiske neuroner (~ 150-200 μm) undersøges. Mens kirurgisk implantation af GRIN linse er teknisk muligt, akut kirurgi metode ikke giver tilstrækkelig tid til neuroner at komme sig efter oxidativ stress og tilstedeværelse af blod efter implantation sandsynligvis vil forringe billedkvaliteten ud over acceptabelt.
På trods af ovenstående bekymringer mener vi, at det er første gang, at der præsenteres en metode til in vivo-billeddannelse af IO-neuroner. Det giver mulighed for undersøgelse af spatiotemporal aktivitet i IO neuroner i forbindelse in vivo i nærværelse af intakte afferente indgange fra sensoriske systemer samt signalerne fra cerebellarkernerne og mesodiencephalic junction22, en bedrift, der hidtil ikke har været mulig. Med denne metode kan IO’ens funktion nu undersøges mere dybtgående med en kombination af sensorisk og optogenetisk stimulation. Især med udviklingen af spændingsbilleddannelse (såsom vores seneste metode til spændingsbilleddannelse i IO 23), håber vi, at den præsenterede kirurgiske metode vil inspirere mange forskere til at tage udfordringen op med at undersøge, hvordan IO bidrager til generering af cerebellar komplekse pigge.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andrew Scott fra media center af OIST for hans hjælp med videooptagelse og redigering. Vi takker også Hugo Hoedemaker for hans hjælp med at udvikle operationen for at afsløre hjernestammen og Dr. Kevin Dorgans for hans hjælp med at tegne diagrammer til tal. Derudover en stor tak til Salvatore Lacava for hans voice-over fortælling, samt alle nRIM-medlemmer og kæledyr for fortsat støtte til velvære i de hårde tider med COVID-19.
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |