Summary
Vi presenterer en protokoll for å eksponere hjernestammen til voksen mus fra ventralsiden. Ved å bruke en gradient-brytningsindekslinse med et miniatyrmikroskop, kan kalsiumavbildning brukes til å undersøke aktiviteten til dårligere oliven nevral somata in vivo.
Abstract
Dårligere oliven (IO), en kjerne i ventral medulla, er den eneste kilden til klatrefibre som danner en av de to inngangsveiene som kommer inn i cerebellum. IO har lenge blitt foreslått å være avgjørende for motorstyring, og aktiviteten anses for tiden å være i sentrum av mange hypoteser om både motoriske og kognitive funksjoner i cerebellum. Mens fysiologien og funksjonen har blitt relativt godt studert på encellet in vitro, er det for tiden ingen rapporter om organiseringen av IO-nettverksaktiviteten hos levende dyr. Dette skyldes i stor grad den ekstremt utfordrende anatomiske plasseringen av IO, noe som gjør det vanskelig å utsette konvensjonelle fluorescerende avbildningsmetoder, hvor en optisk bane må opprettes gjennom hele hjernen som ligger dorsalt til interesseområdet.
Her beskriver vi en alternativ metode for å innhente toppmoderne kalsiumavbildningsdata fra IO-nettverket. Metoden utnytter den ekstreme ventrale plasseringen av IO og innebærer en kirurgisk prosedyre for å sette inn en gradient-brytningsindeks (GRIN) linse gjennom nakkeviscera for å komme i kontakt med den ventrale overflaten av kalsiumsensoren GCaMP6s-uttrykkende IO i bedøvede mus. En representativ kalsiumavbildningsopptak vises for å demonstrere muligheten for å registrere IO-nevronaktivitet etter operasjonen. Selv om dette er en ikke-overlevelseskirurgi og opptakene må utføres under anestesi, unngår det skade på livskritiske hjernestammekjerner og gjør det mulig å gjennomføre et stort utvalg av eksperimenter som undersøker romlige aktivitetsmønstre og inngangsintegrasjon i IO. Denne prosedyren med modifikasjoner kan brukes til opptak i andre tilstøtende områder av ventral hjernestammen.
Introduction
Hovedmålet med system nevrovitenskap er å forstå hvordan romlige aktivitetsmønstre for nevronnettverk bidrar til generering av dyreadferd. Dermed har fluorescerende bildebehandlingsmetodikk ved hjelp av kalsiumfølsomme sonder det siste tiåret blitt et hovedverktøy for å undersøke nevronal nettverksaktivitet hos levende dyr1,2, da det tillater visualisering av slik dynamikk på tvers av romlige skalaer som spenner fra enkeltceller til mesoskala kretser. I de senere år er den vanlige tilnærmingen der nevrale kretser i overfladiske hjernestrukturer (som cerebral eller cerebellar cortices) avbildet gjennom et gjennomsiktig kranialvindu3 har blitt supplert med bruk av gradient-refraktiv indeks (GRIN) linser4 som tillater undersøkelse av nettverksdynamikk i dype hjernestrukturer. For tiden tilgjengelige GRIN linser tillater å nå inn i strukturer flere millimeter dyp, for eksempel musen amygdala, hippocampus og basal ganglia5. Imidlertid ligger mange regioner av interesse som ulike kjerner i ventral medulla betydelig dypere, og plasserer dem på det ekstreme av GRIN-linsen.
Her beskriver vi hvordan du kan overvinne denne vanskeligheten ved å dra nytte av den relativt enkle tilgjengeligheten av medulla gjennom det ventrale aspektet av hjernen. Ved hjelp av voksne mus der den dårligere oliven (IO), en kjerne i ventral medulla, har blitt viralt transfektert med en kalsiumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiske trinnene (modifisert fra metoden beskrevet opprinnelig i Khosrovani et al. 20076) for å plassere et GRIN-objektiv på den ventrale overflaten av hjernen til en bedøvet mus. Ved hjelp av et miniatyrmikroskop demonstrerer vi muligheten for å registrere nevronaktivitet i slike ekstremt ventrale hjerneregioner. Mens prosedyren nødvendigvis er en ikke-overlevelseskirurgi og ingen eksperimentering kan utføres hos våkne dyr, tillater metoden undersøkelse av intakt nettverksdynamikk i sammenheng med sensorisk eller annen afferent stimulering, noe som gir klare fordeler i forhold til eksvivo-tilnærminger som å bruke akutte skiver preparater.
Protocol
Alle gjeldende internasjonale, nasjonale og institusjonelle retningslinjer for omsorg og bruk av dyr ble fulgt. Aseptiske kirurgi teknikker ble brukt på stereotaxic virus vektor injeksjon.
1. Stereotaxic virus vektor injeksjon
MERK: Virus som bærer det genetiske materialet for å uttrykke GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) injiseres stereotaktisk som tidligere beskrevet7,8 med følgende modifikasjoner.
- Bruk kvartsglass (ekstern diameter: 1,14 mm, innvendig diameter: 0,53 mm) i stedet for borosilikatglass for å fremstille en pipette med lang og stiv kon for IO-injeksjon ved hjelp av en laserkapillærtrekker med parametere justert som i produkthåndboken. Etter å ha trukket, kutt av 1-2 mm fra tuppen av pipetten med en skalpell for å skaffe en 8-10 mm lang kon med en 15-20 μm innvendig spissdiameter (Figur 1a). Fullfør pipetten ved å skråstille spissen til en 30° nålform med en roterende mikropipettebeveler for enklere hjerneinntrengning og mindre pipettebøying (Figur 1a).
MERK: Den ofte brukte borosilikatglasspipetten vil være for fleksibel til å målrette mot dype områder riktig når den trekkes til denne lengden. En nanoliterinjektor ble brukt med glasspipetten for å levere viruset i denne studien. Alternativt kan en presisjonsglasssprøyte eller en trykkinjektor også brukes. - Pass på at musekisten ligger på termoputen slik at nakken ikke strekkes med nok kroppsstøtte, og vær ekstremt forsiktig med å utjevne skallen når du fester musen på den stereotaktiske rammen (Figur 1b).
MERK: Bregma-lambda-forskjellen skal være mindre enn 0,05 mm i vertikal dimensjon. - Bruk 6,2 mm kaudal, ±0,5 mm lateral og 6,6 mm ventral i forhold til bregma som koordinater for målretting av hoved-IO-kjernen (figur 1c).
MERK: Perfekt utjevning av hjernen vil dramatisk øke suksessraten for å injisere virus i IO. Koordinatene må bekreftes av eksperimentet da det forventes betydelige forskjeller mellom laboratorier, musestammer og individuelle forskere. For å forberede videomateriale for denne publikasjonen, brukte vi en mannlig C57Bl / 6J mus. - Følg relevante institusjonelle retningslinjer for postoperativ omsorg og boligprosedyrer for viral-transfected dyr i 3-4 uker.
Figur 1: Stereotoksisk virusvektorinjeksjon. (a) Den lasertrekkede kvartsglasspipetten har en 10-12 mm lang rett kon. Etter å ha trukket, kutt av 1-2 mm fra spissen. Pipetten er ferdigstilt ved å skråstille spissen til en 30 ° nålform. (b) Riktig injeksjon avhenger av riktig posisjon av musekroppen i den stereotaktiske rammen. Støtt musekisten for å forhindre at nakken strekkes. Utjevne musehodet ved å justere bregma og lambda horisontalt. (c) IO-koordinasjonen i forhold til bregma vises i dorsalvisning (venstre) av museskallen og koronalvisningen (høyre topp) av hjernen. Injeksjon når den laterale delen av rektor (IOPr) og dorsal (IOD) subnuclei av IO (høyre bunn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Utarbeidelse av verktøy og forbruksvarer for ventral tilnærming kirurgi
- Forbered et intubasjonsrør ved å kutte en 5 til 6 mm lang og 0,8 mm bred spalte fra spissen av et 20-gauge kateter slik at det intuberte dyret kan puste ut (Figur 2a).
MERK: Spalten er nødvendig for at dyr skal puste ut hvis en vanlig isofluran fordamper med konstant luftstrøm brukes. Hvis en ventilator brukes i tillegg til fordamperen, kan kateteret holdes intakt. - Forbered en stump nål for å støtte luftrøret under trakeotomien. Klipp av den skarpe spissen av en 25-gauge nål med tanger. Glatt ut bruddflaten med sandpapir. Bøy den stumpe nålen i midten til ca. 15° med tanger.
MERK: En buet nål løfter luftrøret forsiktig. Dette kan redusere deformasjonen av luftrøret. - Fortynn 50 mg/ml ketamin med saltvann til 15 %. Den endelige konsentrasjonen er 7,5 mg/ml.
- Monter de rene kirurgiverktøyene og forbruksdelene, inkludert lidokaingel, saltvann, gelatinsvamper, absorberende vattpinner, petroleumjell og rengjøringsvev.
- Slå på isoflurandamperen. Sett dyrevarmeputen til 38 °C.
- Vri nesekjeglen på stereotaxisk ramme 180° horisontalt, slik at musen kan festes inn i rammen ventral side opp. Juster nesekjeglehøyden slik at den er på nivået av ørestenger.
3. Administrering av anestesi og forberedelse av musen for operasjonen
- Vei dyret med en veievekt og beregn mengden fortynnet ketamin til injeksjon.
MERK: Den totale mengden ketamin som trengs er 56,25 mg per kg kroppsvekt. Derfor er volumet av fortynnet ketamin 7,5 ml per kg kroppsvekt. Ulempene ved å bruke ketamin alene inkluderer dårlig muskelavslapping, takykardi og forbedret muskelton9. I denne protokollen brukes imidlertid ketamin bare til å dekke 10-20-tiden der isofluran administrering avbrytes på grunn av trakeotomi. Ved å holde dette trinnet så kort som mulig, er bedøvelseseffekten av isofluran ikke betydelig redusert og ulempene ved bruk av ketamin minimeres. - Plasser musen i anestesiinduksjonskammeret forhåndsfylt med 5% isofluran. Når dyret er fullstendig bedøvet vist ved tap av høyre refleks og dypere og langsommere pustemønster, bytt isofluranstrømmen til nesekjeglen av stereotaxisk ramme og reduser isoflurankonsentrasjonen til 2,5%.
- Fest dyret i den stereotaktiske rammeventilsiden opp (Figur 2b). Juster høyden og tonehøyden på nesekjeglen for å sikre at dyret lett kan puste. Hold dyret varmt med den forvarmede varmeputen.
MERK: Å dekke den nedre delen av dyrekroppen med et stykke vevspapir eller aluminiumsfolie kan bidra til å opprettholde dyretemperaturen. - Fjern hudhåret i hals- og lårområder med en barbermaskin og hårfjerningskrem (Figur 2b). Påfør lidokaingelen på halshuden på en topisk måte.
MERK: Lårklemmen perifer oksygenmetning (SpO2) sensor, som vil bli brukt i prosedyre 6, fungerer best på hårløs hud. - Overvåk dyretemperaturen med et rektaltermometer (figur 2b).
- Injiser 1 ml varm (37 °C) saltvann intraperitonealt for å kompensere for væsketapet under operasjonen.
- Vurder dybden av anestesi ved sterk klemme på bakre lemmer. Ingen påviselig respons bør fremkalles.
Figur 2: Fremstilling av ventral tilnærmingskirurgi. (a) Forbered et intubasjonsrør ved å kutte en 5-6 mm lang og 0,8 mm bred spalte i spissen av 20-gauge kateter. (b) Monter dyrets ventrale side opp i en stereotaxisk ramme og juster nesekjeglevinkelen for å sikre at dyret puster lett. Barber huden rundt halsen og lårområdene. Fest SpO2-sensoren til låret for å overvåke muse vitale tegn. Sett inn rektal temperatursonden for overvåking av musens kroppstemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Trakeotomi og intubasjon (20-25 min)
- Utsetter luftrøret.
- Lag et vertikalt snitt i halshuden langs midtlinjen. Skill nakkehuden fra viscera under den ved hjelp av den stumpe disseksjonsmetoden og kutt av huden for å avsløre spyttkjertlene (Figur 3a-b, 4a).
- Frie spyttkjertler fra bindevevet og vend dem sidelengs for å eksponere sternothyroidmuskelen dekket luftrøret med tang (Figur 3b-c).
MERK: Petroleumsgeléen kan påføres det eksponerte vevet for å holde dem fuktige. Unngå luftrøret området for å holde det rent for følgende trinn.
- Trakeotomi
- Injiser den første dosen fortynnet ketamin (7,5 mg/ml) intraperitonealt, 5 ml per kg kroppsvekt (37,5 mg/kg).
MERK: Det tar 3-5 min for ketamin å fungere, og dermed bør den første dosen av ketamin injiseres før du skiller luftrøret fra omkringliggende muskler og blodårer. Ketamin administreres i to injeksjoner på grunn av forhøyet risiko for overdoseringseffekter når det kombineres med isofluranbedøvelse. - Del sternothyroidmuskelen forsiktig langs midtlinjen med spissen av fine tang for å eksponere luftrøret (figur 3c). Løsne luftrøret fra blodkarene og spiserøret med tang ved hjelp av den stumpe disseksjonsmetoden.
- Injiser intraperitoneally den andre dosen fortynnet ketamin (7,5 mg/ml), 2,5 ml per kg kroppsvekt (18,75 mg/kg).
- Sett inn en stump nål under luftrøret på tvers for å støtte den opp (Figur 3d). Hold denne nålen med fingrene for å støtte luftrøret. Før suturtråden rundt den tredje luftrørets ring caudal til skjoldbruskkjertelen med en halvsirkelnål (figur 3d). Lag fire instrumentbånd på denne trakealringen.
MERK: Tråden som er bundet til trakealringen brukes til å feste luftrøret til dyrebrystet. Ikke klipp av tråden fra halvsirkelnålen på dette trinnet. Trakealringer er laget av brusk som er fleksible, men mindre sterke enn bein. Ikke bind suturtråden for stramt, ellers kan ringen gå i stykker. - Klem brysthuden med et par tang. Pierce brysthuden med den samme halvsirkelnålen som ble brukt i det siste trinnet og led tråden gjennom huden, som forberedelse til å sikre luftrøret til brystet i neste trinn (Figur 3d).
- Løft luftrøret forsiktig ved å trekke tråden bundet til trakealringen og kutt luftrøret rostral til den bundet ringen og kaudale til skjoldbruskkjertlene. Trekk kaudal luftrøret mot brystet. Løft åpningen av luftrøret ved å legge til et lite stykke kirurgisk svamp under den.
MERK: Pass på at mer enn 5 minutter har gått etter den andre injeksjonen av ketamin før du kutter luftrøret for å sikre anestesinivået. - Fjern eventuell gjenværende væske inne i åpningsspissen av luftrøret med en tynn stripe med rengjøringsvev. Bytt isofluranstrømmen fra stereotaxisk nesekjegle til intubasjonsrøret. Sett intubasjonsrøret inn i luftrøret ca. 2 mm dypt og pass på at en del av spalten i røret forblir utenfor luftrøret for å tillate innånding (Figur 3e, 4b).
MERK: Juster forsiktig vinkelen på intubasjonsrøret og innsettingsdybden for å få musen til å puste jevnt og for å unngå å skade luftrøret. Petroleumjell kan påføres på utsiden av luftrøret for å forhindre at det blir tørt, slik at luftrøret ikke brister lett. - Fest luftrøret til brysthuden ved å lage 3-4 instrumentelle bånd. Fest luftrøret med suturgjengen for å feste intubasjonsrøret (Figur 3e, 4b).
- Injiser den første dosen fortynnet ketamin (7,5 mg/ml) intraperitonealt, 5 ml per kg kroppsvekt (37,5 mg/kg).
Figur 3: Trakeotomi og intubasjon av mus. (a-c) paneler viser prosessen med å eksponere luftrøret. (a) Fjern halshuden ved å skjære langs de stiplede linjene. (b) Vend spyttkjertlene (SG) sidelengs for å eksponere luftrøret som dekkes av brystpyttkjertelen (SM). (c) Slit åpen SM langs den stiplede linjen for å eksponere luftrøret. (d-e) paneler viser trakeotomi. (d) Støtt luftrøret med en stump og buet nål. Bind den tredje luftrøret ring kaudal til skjoldbruskkjertelen for å sikre luftrøret til brysthuden. (e) Påfør isofluran med et intubasjonsrør med en spalte i spissen. Fest luftrøret til brysthuden med suturtråden. Fest intubasjonsrøret til luftrøret ved å binde dem sammen. Skalastang i a= 5 mm, gjelder for alle paneler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk diagram over ventral tilnærmingskirurgi fra lateralvisning. (a) En skjematisk tegning med relevante anatomiske deler angitt på deres relative plassering når musen plasseres ventral side opp. Forkortelser: muskel dekker atlas (AM), langsgående muskel (LM), spyttkjertler (SG), sternothyroid muskel (SM), skjoldbruskkjertelen (TG). (b) Skjematisk for arrangement av intubasjonsrøret i forhold til luftrøret når trakeotomien er fullført. Luftrøret er sikret med båndene på brysthuden (T-luftrør). Intubasjonsrøret (IT) er sikret med båndene rundt luftrøretden (T-røret). (c) Fjern atlasrøret (AAT) for å fjerne synslinjen til IO. (d) Skjematisk som beskriver plasseringen av miniatyrmikroskopet (MM) og GRIN-objektivet over IO for bildebehandlingseksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Utsette hjernestammen (40-45 min)
- Slit sternothyroid muskelen langs muskelfiber med fine tang. Klipp av den isolerte delen med vårsaksen (Figur 3e).
- Forsiktig frigjøre venstre luftrør og strupehodet fra muskler for å minimere skaden på blodårene i musklene. Fjern venstre luftrør og strupehode. Frigjør spiserøret fra det vedlagte vevet med tang og kutt det av med vårsaks. (Figur 5a).
- Fjern muskelen som dekker ventralbuen og det fremre tuberkelet av atlas med fine tang og vårsaks (Figur 5b).
MERK: Når du fjerner muskelen, del en del av den med spissen av de fine tangene. Klipp den separerte delen av med et par vårsaks. Gjenta dette flere ganger for å eksponere atlas ventralbuen for å minimere risikoen for å rive blodkar. - Klipp ventralbuene til atlaset med en rongeur (Figur 4c, 5c). Fjern det fremre tuberkelet av atlas. Fjern blod og væske med kirurgisk svamp for å se foramen magnum og hjernestammen (Figur 4c, 5d).
- Utvid foramen magnum ved å fjerne occipital bein med en rongeur. (Figur 5d-e).
- Fjern den tynne brusk over foramen magnum med fine tang og vår saks. Skrell forsiktig det periosteale laget av dura mater med fine tang for å ha en klar utsikt over ventral hjernestamme (Figur 5f). Ikke bryt dura mater.
Figur 5: Eksponer hjernestammen til musen for kalsiumavbildning. (a-f) paneler viser prosessen med å eksponere hjernestamme. (a) Fjern sternothyroidmuskelen (SM) som er merket i figur 3e. Klipp av strupehodet og spiserøret. (b) Fjern langsgående muskel (LM) og muskeldekningsatlaset (AM). (c) Klipp atlasventilbuene (AVA) med en rongeur og fjern atlasets fremre tuberkel (AAT). (d) Klipp av occipitalbenet (OB) for å utvide foramen magnum (FM). (e) Utvidet FM. (f) Den tynne brusk over foramen magnum er fjernet. Det periosteale laget av dura mater skrelles av. Firkanten indikerer området som inneholder overfladiske IO-nevroner. (g) Bilde av I/U med GRIN-objektiv. Skalastang i a= 5 mm, gjelder for a-c. Vektstang i d=2 mm gjelder d-e. Skalastang i f = 2 mm. Skalastang i g = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Kalsiumavbildning
- Klem SpO2-sensoren på låret på musen for å overvåke vitale tegn som hjertefrekvens, oksygenmetning og pustefrekvens (figur 2b).
MERK: Hjertefrekvensen skal være mellom 500 bpm og 600 bpm, oksygenmetningen skal være høyere enn 90%, og pustehastigheten skal være 50-70 pust per minutt10,11. - Monter GRIN-linsesonden (9 mm lengde, 1 mm diameter) på implantasjonsstangen.
MERK: Rengjør GRIN-objektivet med 70 % etanol-gjennomvåt rengjøringsvev før bildebehandling for god bildekvalitet. - Fest implantasjonsstangen på den stereotaktiske rammen og monter miniatyrmikroskopet på implantasjonsstangen.
MERK: Klargjøring av miniatyrmikroskopet for avbildning bør fullføres i henhold til passende retningslinjer for produktbrukere. - Tilsett flere dråper varm saltvann i hjernestammeområdet for nedsenking av GRIN-linsen.
- Gå til hjernestammen med GRIN-objektivet (Figur 4d, 5g). Slå på den eksitasjonsblå LED-lampen (455 ± 8) i miniatyrmikroskopet. Finn GCaMP6s-transfekterte IO-nevroner ved å overvåke fluorescensbildet fra miniatyrmikroskopet. Se etter IO-nevroner i et rektangelformet område ~ 0,5-1,7 mm rostral til det gjenværende atlaset og ~ 0,6-1,1 mm lateral til midtlinjen i det overfladiske området ventral hjernestamme (figur 5f).
MERK: Når du ser etter et passende synsfelt for IO-avbildning, se etter stedet der den gjennomsnittlige diameteren på somata samsvarer med IO-nevron somata (ca. 15 μm12). De tilstøtende områdene i medullær retikulær formasjon består av betydelig større celler13,14. Vær forsiktig når du beveger GRIN-linsen vertikalt, da det å trykke det på hjernestammen for hardt kan drepe dyr.
7. Euthanizing dyr etter prosedyre
- På slutten av eksperimentet euthanize dyret med cervical dislokasjon eller annen metode godkjent av lokale laboratorie dyrepleie regulering.
- For videre histologiundersøkelse bedøver du først dyret med injiserbart legemiddel, for eksempel ketamin/xylazinkombinasjon (henholdsvis 100 mg/kg og 10 mg/kg)15 før hjerteperfusjon med Ringers løsning etterfulgt av fixativ løsning for å fikse hjernen.
8. Databehandling
- Forhåndsbehandle den innspilte kalsiumavbildningsvideoen før du analyserer data.
MERK: Den kommersielle databehandlingsprogramvaren ledsaget av miniatyrmikroskopet ble brukt til dette trinnet, og følgende protokolltrinn er relatert til det. Alternativt kan gratis programvare og åpen kildekode som CaImAn16, MINIPIPE17og MiniscoPy18 brukes til både forhåndsbehandling og analyse.- Last inn den innspilte kalsiumavbildningsvideoen i databehandlingsprogramvaren.
- Klikk Forhåndsbehandling -knappen. Definer et beskjæringsområde unntatt regioner uten fluorescerende nevroner, og beskjær videoen for å redusere filstørrelsen for raskere behandling.
- Klikk romlig filter . Sett den lave avskjæringen og den høye avskjæringen for romlig filter til henholdsvis 0,005 bildepunkt-1og 0,5 bildepunkt-1. Bruk det romlige filteret på hver ramme i videoen for å øke kontrasten og jevne ut bildet.
MERK: Romfilteret er et gaussisk bandpassfilter. Komponenter med lav romlig frekvens som stammer fra celler utenfor fokus, kan forvirre bevegelseskorrigering i neste trinn. Høy romlig frekvenskomponent kan føre til at videoen ser mindre jevn ut. - Klikk Bevegelseskorrigering - knappen. Påfør bevegelseskorrigeringen på videoen ved å bruke den første rammen som referanseramme for å redusere bevegelsesrelaterte gjenstander forårsaket av blodstrøm i hjernestammen.
MERK: Bevegelseskorrigeringen bruker en bilderegistreringsmetode utviklet av Thevenaz et al19. - Eksporter den bevegelseskorrigerte videoen som TIFF-format.
- Bruk CNMF-E20 på den bevegelseskorrigerte videoen i MATLAB for å identifisere enkle nevroner, ved å følge instruksjonene for CNMF-E MATLAB-koden i det elektroniske depotet21.
MERK: CNMF-E er en begrenset ikke-negativ matrisefaktoriseringstilnærming tilpasset for ett-foton bildebehandling. Demoskript i repositoriet kan endres og brukes til å behandle data.
Representative Results
Her presenterer vi et representativt opptak innhentet med metoden som beskrevet. Figur 6a viser plasseringen av I/U-celler som er sterkt merket under eksperimentet. De mørke diagonale stripene er blodkar. Legg merke til den variable lysstyrken til individuelle celler, som følge av variabel transfeksjonseffekt. I panel figur 6b viser vi gjennomsnittlig normalisert fluorescensintensitet (deltaF/F) spor hentet fra somataen som er angitt med farger og tall i panel a. Oppadgående avbøyninger representerer forbigående økninger i intracellulært kalsium. Legg merke til hvordan forskjellig nivå av GCaMP6s-uttrykk (reflektert i cellelysstyrke i panel a) fører til variable signal-til-støy-forhold (SNR).
Figur 6: Eksempelregistrering av aktivitet av IO-nevroner i bedøvet mus. (a) Representativ eksempelramme fra et opptak etter romlig filtrering. Lyse flekker er IO nevronal somata, hvorav flere har blitt indikert som interesseregioner (ROIer, fargede tall). Mørke striper er blodårer. (b) Eksempel på deltaF/F-spor hentet fra ROIene som er angitt i panel a. Oppadgående avbøyninger reflekterer økning i kalsiumsignal. Skalalinje i a= 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Ettersom den kirurgiske prosedyren involverer operasjoner utført i halsområdet med mange vitalt kritiske strukturer (arterier, nerver), er det viktig at den utføres av en forsker med høye kirurgiske ferdigheter. I det følgende fremhever og kommenterer vi flere viktige punkter i prosedyren; Det må imidlertid minnes om at ingen skriftlige råd kan erstatte forskerens erfaring, dyktighet og intuisjon.
Det mest kritiske trinnet i operasjonen er trakeotomi. Det innebærer å kutte luftrøret, bytte isofluran fra nesekjeglen til intubasjonsrøret, sikre luftrøret til brysthuden og binde luftrøret og intubasjonsrøret sammen. Alle disse operasjonene må fullføres på en jevn og rask måte for å unngå ulykker, for eksempel utilstrekkelig anestesi, tilstrømning av væske i luftrør eller intubasjonsrørsglidning. Man må ha protokollen klar i tankene før man kutter luftrøret.
Blødning er en av de viktigste årsakene til dyredød i denne operasjonen. Siden nakkeområdet er tett med blodkar, bør kutt bare utføres når siktlinjen er klar for å unngå å kutte usette årer og arterier. Derfor må muskler og bindevev som skjuler syn fjernes, og blod fra ødelagte kapillærer må rengjøres før du går videre.
Dyr kan holdes i live i lang tid (mer enn 8 timer) fra begynnelsen av operasjonen. Det er imidlertid viktig å fullføre den kirurgiske prosedyren raskt, slik at det er mer tid til å undersøke hjernestamme nevroner når dyrefysiologisk tilstand er god. En dyktig forsker kan fullføre hele prosedyren på 70 min.
Mens metoden gir et rent syn på ventrale hjerneoverflater, er det dessverre umulig å gjøre det uten å utføre trakeotomi, samt fjerne betydelig mengde vev i halsområdet. Derfor kan dyret ikke få lov til å våkne fra anestesi. Videre, selv om det er mulig å holde dyret i live i mange timer med nøye justering av bedøvelse, opprettholde kroppstemperatur og hydrering, er det uunngåelig at langvarig eksperimentering til slutt vil føre til svekkelse av dyretilstanden. Det overlates til forskerens kompetanse å vurdere maksimal varighet av stabile opptak.
En annen potensiell begrensning av metoden som beskrevet her er at siden GRIN-linsen ikke settes inn i hjernens parenchyma, kan bare relativt overfladiske nevroner (~ 150-200 μm) undersøkes. Mens kirurgisk implantasjon av GRIN linse er teknisk mulig, akutt kirurgi metode tillater ikke tilstrekkelig tid for nevroner å gjenopprette fra oksidativt stress og tilstedeværelse av blod etter implantasjon sannsynligvis vil forringe bildekvaliteten utover akseptabelt.
Til tross for de ovennevnte bekymringene, tror vi dette er første gang en metode for in vivo-avbildning av IO-nevroner presenteres. Det tillater undersøkelse av romlig aktivitet i IO-nevronene i konteksten in vivo i nærvær av intakte afferente innganger fra sensoriske systemer samt signalene fra cerebellar-kjernene og det mesodiencephalic krysset22, en prestasjon som ikke har vært mulig hittil. Med denne metoden kan funksjonen til IO nå undersøkes i større dybde med kombinasjon av sensorisk og optogenetisk stimulering. Spesielt med utviklingen av spenningsavbildning (for eksempel vår nylige metode for spenningsavbildning i IO 23), håper vi den presenterte kirurgiske metoden vil inspirere mange forskere til å ta utfordringen med å undersøke hvordan IO bidrar til generering av cerebellar komplekse pigger.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Andrew Scott fra mediesenteret til OIST for hans hjelp med videoopptak og redigering. Vi takker også Hugo Hoedemaker for hans hjelp med å utvikle operasjonen for å avsløre hjernestammen og Dr. Kevin Dorgans for hans hjelp med å tegne diagrammer for figurer. I tillegg, stor takk til Salvatore Lacava for hans voice-over fortelling, samt alle nRIM medlemmer og kjæledyr for fortsatt støtte for velvære i de tøffe tider med COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor.
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
