Vi presenterer en protokoll for å eksponere hjernestammen til voksen mus fra ventralsiden. Ved å bruke en gradient-brytningsindekslinse med et miniatyrmikroskop, kan kalsiumavbildning brukes til å undersøke aktiviteten til dårligere oliven nevral somata in vivo.
Dårligere oliven (IO), en kjerne i ventral medulla, er den eneste kilden til klatrefibre som danner en av de to inngangsveiene som kommer inn i cerebellum. IO har lenge blitt foreslått å være avgjørende for motorstyring, og aktiviteten anses for tiden å være i sentrum av mange hypoteser om både motoriske og kognitive funksjoner i cerebellum. Mens fysiologien og funksjonen har blitt relativt godt studert på encellet in vitro, er det for tiden ingen rapporter om organiseringen av IO-nettverksaktiviteten hos levende dyr. Dette skyldes i stor grad den ekstremt utfordrende anatomiske plasseringen av IO, noe som gjør det vanskelig å utsette konvensjonelle fluorescerende avbildningsmetoder, hvor en optisk bane må opprettes gjennom hele hjernen som ligger dorsalt til interesseområdet.
Her beskriver vi en alternativ metode for å innhente toppmoderne kalsiumavbildningsdata fra IO-nettverket. Metoden utnytter den ekstreme ventrale plasseringen av IO og innebærer en kirurgisk prosedyre for å sette inn en gradient-brytningsindeks (GRIN) linse gjennom nakkeviscera for å komme i kontakt med den ventrale overflaten av kalsiumsensoren GCaMP6s-uttrykkende IO i bedøvede mus. En representativ kalsiumavbildningsopptak vises for å demonstrere muligheten for å registrere IO-nevronaktivitet etter operasjonen. Selv om dette er en ikke-overlevelseskirurgi og opptakene må utføres under anestesi, unngår det skade på livskritiske hjernestammekjerner og gjør det mulig å gjennomføre et stort utvalg av eksperimenter som undersøker romlige aktivitetsmønstre og inngangsintegrasjon i IO. Denne prosedyren med modifikasjoner kan brukes til opptak i andre tilstøtende områder av ventral hjernestammen.
Hovedmålet med system nevrovitenskap er å forstå hvordan romlige aktivitetsmønstre for nevronnettverk bidrar til generering av dyreadferd. Dermed har fluorescerende bildebehandlingsmetodikk ved hjelp av kalsiumfølsomme sonder det siste tiåret blitt et hovedverktøy for å undersøke nevronal nettverksaktivitet hos levende dyr1,2, da det tillater visualisering av slik dynamikk på tvers av romlige skalaer som spenner fra enkeltceller til mesoskala kretser. I de senere år er den vanlige tilnærmingen der nevrale kretser i overfladiske hjernestrukturer (som cerebral eller cerebellar cortices) avbildet gjennom et gjennomsiktig kranialvindu3 har blitt supplert med bruk av gradient-refraktiv indeks (GRIN) linser4 som tillater undersøkelse av nettverksdynamikk i dype hjernestrukturer. For tiden tilgjengelige GRIN linser tillater å nå inn i strukturer flere millimeter dyp, for eksempel musen amygdala, hippocampus og basal ganglia5. Imidlertid ligger mange regioner av interesse som ulike kjerner i ventral medulla betydelig dypere, og plasserer dem på det ekstreme av GRIN-linsen.
Her beskriver vi hvordan du kan overvinne denne vanskeligheten ved å dra nytte av den relativt enkle tilgjengeligheten av medulla gjennom det ventrale aspektet av hjernen. Ved hjelp av voksne mus der den dårligere oliven (IO), en kjerne i ventral medulla, har blitt viralt transfektert med en kalsiumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiske trinnene (modifisert fra metoden beskrevet opprinnelig i Khosrovani et al. 20076) for å plassere et GRIN-objektiv på den ventrale overflaten av hjernen til en bedøvet mus. Ved hjelp av et miniatyrmikroskop demonstrerer vi muligheten for å registrere nevronaktivitet i slike ekstremt ventrale hjerneregioner. Mens prosedyren nødvendigvis er en ikke-overlevelseskirurgi og ingen eksperimentering kan utføres hos våkne dyr, tillater metoden undersøkelse av intakt nettverksdynamikk i sammenheng med sensorisk eller annen afferent stimulering, noe som gir klare fordeler i forhold til eksvivo-tilnærminger som å bruke akutte skiver preparater.
Ettersom den kirurgiske prosedyren involverer operasjoner utført i halsområdet med mange vitalt kritiske strukturer (arterier, nerver), er det viktig at den utføres av en forsker med høye kirurgiske ferdigheter. I det følgende fremhever og kommenterer vi flere viktige punkter i prosedyren; Det må imidlertid minnes om at ingen skriftlige råd kan erstatte forskerens erfaring, dyktighet og intuisjon.
Det mest kritiske trinnet i operasjonen er trakeotomi. Det innebærer å kutte luftrøret, bytte isofluran fra nesekjeglen til intubasjonsrøret, sikre luftrøret til brysthuden og binde luftrøret og intubasjonsrøret sammen. Alle disse operasjonene må fullføres på en jevn og rask måte for å unngå ulykker, for eksempel utilstrekkelig anestesi, tilstrømning av væske i luftrør eller intubasjonsrørsglidning. Man må ha protokollen klar i tankene før man kutter luftrøret.
Blødning er en av de viktigste årsakene til dyredød i denne operasjonen. Siden nakkeområdet er tett med blodkar, bør kutt bare utføres når siktlinjen er klar for å unngå å kutte usette årer og arterier. Derfor må muskler og bindevev som skjuler syn fjernes, og blod fra ødelagte kapillærer må rengjøres før du går videre.
Dyr kan holdes i live i lang tid (mer enn 8 timer) fra begynnelsen av operasjonen. Det er imidlertid viktig å fullføre den kirurgiske prosedyren raskt, slik at det er mer tid til å undersøke hjernestamme nevroner når dyrefysiologisk tilstand er god. En dyktig forsker kan fullføre hele prosedyren på 70 min.
Mens metoden gir et rent syn på ventrale hjerneoverflater, er det dessverre umulig å gjøre det uten å utføre trakeotomi, samt fjerne betydelig mengde vev i halsområdet. Derfor kan dyret ikke få lov til å våkne fra anestesi. Videre, selv om det er mulig å holde dyret i live i mange timer med nøye justering av bedøvelse, opprettholde kroppstemperatur og hydrering, er det uunngåelig at langvarig eksperimentering til slutt vil føre til svekkelse av dyretilstanden. Det overlates til forskerens kompetanse å vurdere maksimal varighet av stabile opptak.
En annen potensiell begrensning av metoden som beskrevet her er at siden GRIN-linsen ikke settes inn i hjernens parenchyma, kan bare relativt overfladiske nevroner (~ 150-200 μm) undersøkes. Mens kirurgisk implantasjon av GRIN linse er teknisk mulig, akutt kirurgi metode tillater ikke tilstrekkelig tid for nevroner å gjenopprette fra oksidativt stress og tilstedeværelse av blod etter implantasjon sannsynligvis vil forringe bildekvaliteten utover akseptabelt.
Til tross for de ovennevnte bekymringene, tror vi dette er første gang en metode for in vivo-avbildning av IO-nevroner presenteres. Det tillater undersøkelse av romlig aktivitet i IO-nevronene i konteksten in vivo i nærvær av intakte afferente innganger fra sensoriske systemer samt signalene fra cerebellar-kjernene og det mesodiencephalic krysset22, en prestasjon som ikke har vært mulig hittil. Med denne metoden kan funksjonen til IO nå undersøkes i større dybde med kombinasjon av sensorisk og optogenetisk stimulering. Spesielt med utviklingen av spenningsavbildning (for eksempel vår nylige metode for spenningsavbildning i IO 23), håper vi den presenterte kirurgiske metoden vil inspirere mange forskere til å ta utfordringen med å undersøke hvordan IO bidrar til generering av cerebellar komplekse pigger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andrew Scott fra mediesenteret til OIST for hans hjelp med videoopptak og redigering. Vi takker også Hugo Hoedemaker for hans hjelp med å utvikle operasjonen for å avsløre hjernestammen og Dr. Kevin Dorgans for hans hjelp med å tegne diagrammer for figurer. I tillegg, stor takk til Salvatore Lacava for hans voice-over fortelling, samt alle nRIM medlemmer og kjæledyr for fortsatt støtte for velvære i de tøffe tider med COVID-19.
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |