우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
열등한 올리브 (IO), 복부 수질의 핵은 소뇌에 들어가는 두 개의 입력 경로 중 하나를 형성하는 등반 섬유의 유일한 소스입니다. IO는 오랫동안 모터 제어에 매우 중요하도록 제안되었으며 그 활동은 현재 소뇌의 모터 및 인지 기능 모두의 많은 가설의 중심에 있는 것으로 간주됩니다. 그것의 생리학 및 기능은 시험관내에 있는단 세포 수준에 상대적으로 잘 공부된 동안, 현재 살아있는 동물에 있는 IO 네트워크 활동의 조직에 아무 보고도 없습니다. 이것은 IO의 극단적인 도전적인 해부학 적 위치 때문에, 관심의 지역에 등대적으로 위치한 전체 두뇌를 통해 광학 경로를 만들어야 하는 전통적인 형광 화상 진찰 방법의 적용을 어렵게 만듭니다.
여기에서 는 IO 네트워크에서 최첨단 -level 칼슘 이미징 데이터를 얻기위한 대체 방법을 설명합니다. 이 방법은 IO의 극단적인 복부 위치를 활용하고 마취 마우스에서 칼슘 센서 GCaMP6s-expressing IO의 복부 표면과 접촉하기 위해 목 내장을 통해 그라데이션 굴절 지수(GRIN) 렌즈를 삽입하는 수술 절차를 포함한다. 대표적인 칼슘 이미징 기록은 수술 후 IO 뉴런 활성을 기록할 수 있는 타당성을 입증하는 것으로 나타났다. 이것은 비 생존 수술이고 기록은 마취의 밑에 수행되어야 하는 동안, 생명을 중요한 뇌간 핵에 손상을 피하고 IO에 있는 현면 활동 패턴 및 입력 통합을 조사하는 실험의 큰 다양성을 수행할 수 있습니다. 수정이 절차는 복부 뇌간의 다른 인접 한 영역에서 녹음에 사용할 수 있습니다.
시스템 신경 과학의 주요 목표는 신경 네트워크의 현면 활동 패턴이 동물 행동의 생성에 기여하는 방법을 이해하는 것입니다. 따라서, 칼슘에 민감한 프로브를 이용한 형광 화상 진찰 방법론은 지난 10년 동안 살아있는동물의신경망 활동을 검사하기 위한 주요 도구가 되었으며,이는단일 세포에서 메소스케일 회로에 이르는 공간 저울을 통해 이러한 역학의 시각화를 가능하게 한다. 최근 몇 년 동안, 표면적인 뇌 구조(예: 뇌 또는 소뇌 코르티체)의 신경 회로가 투명한 두개골 창3을 통해 이미지화되는 일반적인 접근법은 그라데이션 굴절률(GRIN) 렌즈4를 사용하여 깊은 뇌 구조에서 네트워크 역학을 검사할 수 있도록 보완되고 있다. 현재 사용 가능한 GRIN 렌즈는 마우스 편도체, 해마 및 기저 신경질5와같은 수밀리미터 깊이의 구조물에 도달할 수 있습니다. 그러나, 복부 수질에 있는 각종 핵과 같은 관심의 많은 지구는 GRIN 렌즈 도달의 극단에 그(것)들을 두는 현저하게 더 깊은 거짓말합니다.
여기에서, 우리는 두뇌의 복부 측면을 통해 medulla의 상대적으로 쉬운 접근성을 이용하여 이 어려움을 극복하는 방법을 설명합니다. 복부 수질계의 핵인 열등한 올리브(IO)가 칼슘 센서 GCaMP6s에 바이러스적으로 감염된 성인 마우스를 사용하여 수술 단계(원래 코스트로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) (20076년6일코스로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) 뇌의 복부 표면에 GRIN 렌즈를 배치한다. 소형 현미경을 사용하여, 우리는 극단적으로 복부 두뇌 지구에 있는 신경 활동을 기록의 타당성을 보여줍니다. 절차는 반드시 생존수술이 아니고 깨어있는 동물에서는 실험이 수행될 수 없지만, 감각 또는 기타 흡성 경로 자극의 맥락에서 온전한 네트워크 역학을 검사할 수 있게 하여 급성 슬라이스 제제를 사용하는 것과 같은 전 생체 접근법에 비해 명확한 이점을 제공한다.
외과 적 절차는 수많은 매우 중요한 구조 (동맥, 신경)와 인후 지역에서 수행 수술을 포함하기 때문에, 그것은 높은 수준의 수술 능력을 가진 연구원에 의해 수행되는 것이 필수적이다. 다음에서 절차의 몇 가지 핵심 사항을 강조하고 주석을 달았습니다. 그러나, 그것은 서면 조언의 양이 경험, 기술, 연구원의 직관을 대체할 수 없다는 것을 상기시켜야합니다.
수술에서 가장 중요한 단계는 기관 절제술입니다. 그것은 기관절단을 절단하고, 코 콘에서 관관으로 이소플루란을 바꾸고, 기관체를 가슴 피부에 고정하고 기관체와 관관을 함께 묶는 것을 포함합니다. 이러한 모든 작업은 부적절한 마취, 기관체로의 유체 유입 또는 관관 미끄러짐과 같은 사고를 피하기 위해 원활하고 빠른 방식으로 완료되어야 합니다. 하나는 기관을 절단하기 전에 염두에 명확하게 프로토콜을 유지해야합니다.
출혈은이 수술에서 동물 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 목 부위는 혈관으로 조밀하기 때문에 보이지 않는 정맥과 동맥을 자르지 않도록 시야가 명확할 때만 절단해야합니다. 따라서 시력을 가리는 근육과 결합 조직은 제거되어야하며, 부러진 모세 혈관에서 혈액은 발전하기 전에 청소해야합니다.
동물은 수술 시작부터 오랜 시간 (8 시간 이상) 살아 있을 수 있습니다. 그러나, 외과 적 절차를 신속 하 게 완료 하는 것이 중요 하다 그래서 동물 생리 조건이 좋은 때 뇌간 신경을 검사 하는 더 많은 시간이 있다. 숙련 된 연구원은 70 분 안에 전체 절차를 완료 할 수 있습니다.
이 방법은 복부 뇌 표면의 깨끗한 전망을 제공하지만, 기관 절제술을 수행하고 목 부위에서 상당한 양의 조직을 제거하지 않고는 불행히도 그렇게하는 것은 불가능합니다. 따라서 동물은 마취에서 깨어 날 수 없습니다. 더욱이, 마취 전달의 주의 깊게 조정하여 체온과 수분을 유지함으로써 동물을 몇 시간 동안 살릴 수 있지만, 장기간 실험하면 결국 동물 상태의 약화로 이어질 수밖에 없다. 그것은 안정적인 기록의 최대 기간을 고려하는 연구원의 전문 지식에 남아있다.
여기에 설명된 바와 같이 방법의 또 다른 잠재적 한계는 GRIN 렌즈가 뇌 빈혈종에 삽입되지 않기 때문에 상대적으로 피상적인 뉴런(~150-200 μm)만 검사할 수 있다는 것입니다. GRIN 렌즈의 외과 이식은 기술적으로 가능하지만, 급성 수술 방법은 이식 후 산화 스트레스와 혈액의 존재로부터 뉴런이 회복하기에 충분한 시간을 허용하지 않을 가능성이 허용 이상으로 이미지 품질을 저하시킬 가능성이 높습니다.
위의 우려에도 불구 하 고, 우리는 이것이 IO 뉴런의 생체 내 이미징에 대 한 방법이 제시 되는 처음 믿습니다. 지금까지 가능하지 않은 위업인 소뇌핵및 메소디온스접합22로부터의 신호뿐만 아니라 감각 시스템에서 온전한 포신입력이 있는 생체내 의 맥락에서 IO 뉴런내의 현소측활성을 검사할 수 있다. 이 방법을 사용하면 IO의 기능은 이제 감각 및 광유전학 자극의 조합으로 더 심층으로 조사 될 수 있습니다. 특히, 전압 이미징의 진화와 함께 (IO 23에서전압 이미징에 대한 우리의 최근 방법과 같은), 우리는 제시 된 수술 방법이 IO가 소뇌 복잡한 스파이크의 생성에 기여하는 방법을 조사하는 도전을 취할 많은 연구자 영감을 희망.
The authors have nothing to disclose.
우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 그의 도움에 대한 OIST의 미디어 센터에서 앤드류 스콧 감사합니다. 또한, 우리는 뇌간을 노출하는 수술을 개발하는 그의 도움휴고 Hoedemaker와 인물에 대한 도표를 그리는 그의 도움에 대한 케빈 다이스 박사에게 감사드립니다. 또한, 그의 음성 해설에 대한 살바토레 라카바뿐만 아니라 COVID-19의 힘든 시기에 웰빙에 대한 지속적인 지원을위한 모든 nRIM 회원과 애완 동물에 큰 감사를 드립니다.
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |