Vi presenterar ett protokoll för att avslöja hjärnstammen hos vuxna musen från ventrala sidan. Genom att använda en gradient-brytning index lins med ett miniatyrmikroskop, kalcium imaging kan användas för att undersöka aktiviteten av sämre oliv neurala somata in vivo.
Inferior olive (IO), en kärna i ventral medulla, är den enda källan till klätterfibrer som bildar en av de två ingångsvägarna som kommer in i lillhjärnan. IO har länge föreslagits vara avgörande för motorisk styrning och dess verksamhet anses för närvarande vara i centrum för många hypoteser om både motoriska och kognitiva funktioner i lillhjärnan. Medan dess fysiologi och funktion har studerats relativt väl på encellig nivå in vitro, finns det för närvarande inga rapporter om organisationen av IO-nätverksaktiviteten hos levande djur. Detta beror till stor del på IO: s extremt utmanande anatomiska läge, vilket gör det svårt att utsättas för konventionella fluorescerande avbildningsmetoder, där en optisk väg måste skapas genom hela hjärnan som ligger dorsalt till intresseområdet.
Här beskriver vi en alternativ metod för att erhålla toppmoderna kalciumavbildningsdata från IO-nätverket. Metoden drar nytta av IO: s extrema ventrala placering och innebär ett kirurgiskt ingrepp för att sätta in en gradient-brytningsindex (GRIN) lins genom nackvisceran för att komma i kontakt med kalciumsensorn GCaMP6s-uttryckande IO hos sövda möss. En representativ kalcium imaging inspelning visas för att visa möjligheten att registrera IO neuron verksamhet efter operationen. Även om detta är en icke-överlevnad kirurgi och inspelningarna måste utföras under anestesi, undviker det skador på livskritiska hjärnstammen atomkärnor och tillåter att genomföra stora variationer av experiment som undersöker spatiotemporal aktivitet mönster och input integration i IO. Detta förfarande med ändringar kan användas för inspelningar i andra, angränsande regioner i ventral hjärnstammen.
Huvudsyftet med systemneurovetenskap är att förstå hur spatiotemporala aktivitetsmönster hos neuronala nätverk bidrar till generering av djurbeteende. Således har fluorescerande bildmetodik med kalciumkänsliga sonder under det senaste decenniet blivit ett huvudverktyg för att undersöka neuronal nätverksaktivitet hos levande djur1,2 , eftersom det möjliggör visualisering av sådandynamiköver rumsliga skalor som sträcker sig från enstaka celler till mesoskala kretsar. Under de senaste åren, det gemensamma tillvägagångssättet där neurala kretsar i ytliga hjärnstrukturer (såsom cerebrala eller cerebellar cortices) avbildas genom ett transparent hjärnskålenfönster 3 har kompletterats med användning av gradient-brytning index (GRIN) linser4 tillåter undersökning av nätverksdynamik i djupa hjärnstrukturer. För närvarande tillgängliga GRIN-linser gör det möjligt att nå in i strukturer flera millimeter djupt, såsom mus amygdala, hippocampus och basala ganglier5. Men många regioner av intresse som olika atomkärnor i ventral medulla ligger betydligt djupare och placerar dem i den extrema GRIN-linsens räckvidd.
Här beskriver vi hur man kan övervinna denna svårighet genom att dra nytta av den relativt enkla tillgängligheten av medulla genom den ventrala aspekten av hjärnan. Med vuxna möss där den sämre oliven (IO), en kärna i ventrala medulla, har blivit viralt transfected med en kalciumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiska stegen (modifierade från den metod som ursprungligen beskrivs i Khosrovani et al. 20076) för att placera en GRIN-lins på den ventrala ytan av hjärnan hos en bedövad mus. Med hjälp av ett miniatyrmikroskop visar vi möjligheten att registrera neuronal aktivitet i sådana extremt ventrala hjärnregioner. Medan förfarandet nödvändigtvis är en icke-överlevnadskirurgi och inga experiment kan utföras på vakna djur, tillåter metoden undersökning av intakt nätverksdynamik i samband med sensorisk eller annan afferent pathway stimulering, vilket ger tydliga fördelar jämfört med ex vivo-metoder som att använda akuta skärpreparat.
Eftersom det kirurgiska ingreppet innebär operationer som utförs i halsregionen med många vitalt kritiska strukturer (artärer, nerver), är det viktigt att det utförs av en forskare med kirurgiska färdigheter på hög nivå. Nedan lyfter vi fram och kommenterar flera viktiga punkter i förfarandet. Det måste dock påminnas om att ingen mängd skriftliga råd kan ersätta forskarens erfarenhet, skicklighet och intuition.
Det mest kritiska steget i operationen är trakeotomi. Det innebär att man skär luftstrupen, byter isofluran från näskonen till intuberingsröret, säkrar luftstrupen till brösthuden och binder trakean och intuberingsröret tillsammans. Alla dessa åtgärder måste slutföras på ett smidigt och snabbt sätt för att undvika olyckor, såsom otillräcklig anestesi, inflöde av vätska till luftstrupe eller intuberingsrörssnedsteg. Man måste hålla protokollet klart i åtanke innan man skär luftstrupen.
Blödning är en av de främsta orsakerna till djurdöd i denna operation. Eftersom nackområdet är tätt med blodkärl, bör snittet endast utföras när siktlinjen är klar för att undvika att skära osynliga vener och artärer. Därför måste muskler och bindväv som skymtar synen avlägsnas, och blod från brutna kapillärer måste rengöras innan de avancerar.
Djur kan hållas vid liv under lång tid (mer än 8 timmar) från början av operationen. Det är dock viktigt att avsluta det kirurgiska ingreppet snabbt så att det finns mer tid att undersöka hjärnstammens nervceller när djurets fysiologiska tillstånd är bra. En skicklig forskare kan avsluta hela proceduren på 70 minuter.
Medan metoden ger en ren bild av ventrala hjärnytor, är det tyvärr omöjligt att göra det utan att utföra en trakeotomi samt ta bort betydande mängd vävnad i halsregionen. Därför kan djuret inte tillåtas vakna från anestesi. Dessutom, även om det är möjligt att hålla djuret vid liv i många timmar med noggrann justering av bedövningstillförseln, upprätthålla kroppstemperatur och hydrering, är det oundvikligt att långvariga experiment så småningom kommer att leda till försvagning av djurens tillstånd. Det övers överser till forskarens expertis att överväga den maximala varaktigheten av stabila inspelningar.
En annan potentiell begränsning av metoden som beskrivs här är att eftersom GRIN-linsen inte sätts in i hjärnans parenkym, kan endast relativt ytliga nervceller (~ 150-200 μm) undersökas. Medan kirurgisk implantation av GRIN-lins är tekniskt möjligt, tillåter akut kirurgimetod inte tillräckligt med tid för nervceller att återhämta sig från oxidativ stress och närvaro av blod efter implantation sannolikt kommer att försämra bildkvaliteten bortom acceptabelt.
Trots ovanstående farhågor tror vi att detta är första gången en metod för in vivo imaging av IO nervceller presenteras. Det möjliggör undersökning av spatiotemporal aktivitet i IO-nervcellerna i sammanhanget in vivo i närvaro av intakta afferenta ingångar från sensoriska system samt signalerna från cerebellarkärnorna och mesodiencefaliskakorsningen 22, en bedrift som hittills inte har varit möjlig. Med denna metod kan IO: s funktion nu undersökas mer ingående med kombination av sensorisk och optogenisk stimulering. Med utvecklingen av spänningsavbildning (som vår senaste metod för spänningsavbildning i IO 23)hoppas vi att den presenterade kirurgiska metoden kommer att inspirera många forskare att ta sig an utmaningen att undersöka hur IO bidrar till genereringen av cerebellarkomplexspikar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Andrew Scott från Media Center of OIST för hans hjälp med videoinspelning och redigering. Vi tackar också Hugo Hoedemaker för hans hjälp med att utveckla operationen för att exponera hjärnstammen och Dr. Kevin Dorgans för hans hjälp med att rita diagram för siffror. Dessutom stort tack till Salvatore Lacava för hans berättarröst, liksom alla nRIM-medlemmar och husdjur för fortsatt stöd för välbefinnande i de tuffa tiderna av COVID-19.
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |