Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

Abstract

Caenorhabditis elegans는 다양한 인간 질병의 메커니즘과 치료를 효율적으로 심문하는 번역 동물 모델로서 중앙 유틸리티로 널리 인정받고 있습니다. 벌레는 빠른 개발 주기, 큰 무리 크기, 짧은 수명, 현미경 투명성, 낮은 유지 보수 비용, 게놈 도구의 강력한 제품군, 돌연변이 리포지토리 및 생체 내 생물학모두에서 중재하는 실험 방법론을 활용하여 치료 목표와 치료에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 높은 처리량 유전 및 약물 화면에 특히 적합합니다. 웜 운동 활동은 미토콘드리아 질환에서 자주 손상되는 특히 관련 표현형을 나타내며, 이는 원인과 증상에서 매우 이질적이지만 세포 에너지를 생산하는 장애인 용량을 집단적으로 공유합니다. 다른 방법론의 제품군은 웜 동작을 심문하는 데 사용될 수 있지만, 이들은 게놈 또는 약물 고처리량 스크린을 위한 실험 비용, 복잡성 및 유용성에 크게 변화합니다. 여기서, 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 상대적인 처리량, 장점 및 한계는 다른 단계, 나이 및 실험 기간에 있는 C. elegans의 단 하나 벌레 또는 벌레 집단에서 선충제 운동, 분쇄, 인두 펌핑 및/또는 화학요법을 정량화하는 비교되었습니다. 상세한 프로토콜은 사용 가능한 소프트웨어 도구, 즉 ZebraLab (중간 처리량 접근 법)과 WormScan (높은 처리량 접근 법)의 새로운 응용 프로그램을 나타내는 선충제 운동 활동을 정량화하는 두 가지 반자동 방법을 입증했습니다. 이러한 방법을 적용한 데이터는 L4 애벌레 단계에서 유사한 정도의 감소된 동물 활성을 입증하고, 1일째 성인에서 진행되었으며, 미토콘드리아 복합 I질환(gas-1(fc21)) 돌연변이 벌레는 야생형(N2 Bristol) C. elegans에비해 있었다. 이 데이터는 ZebraLab 또는 WormScan 소프트웨어 도구를 사용하여 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 거동에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 지원하는 가변 용량으로 웜 운동 활동을 효율적이고 객관적으로 정량화하는 이러한 새로운 응용 분야에 대한 유용성을 검증합니다.

Introduction

Caenorhabiditis elegans는 결합, 먹이 주기, 계란 누워, 배변, 수영 및 고체 매체1에서운동을 포함한 모든 웜 행동을 조정하는 302 개의 뉴런을 가진 신경 과학에서 뛰어난 모델로 널리 인정받고 있습니다. 이러한 헤마필로디컬 선충은 또한 C. elegans와 인간 사이의 ~80% 유전자의 잘 특징적인 게놈 및 높은 homology에 의해 가능하게 된 다양한 인간 질병 메커니즘을 이해하는 데 널리 사용된다2,3,4. C. elegans는 오랫동안 인간 미토콘드리아 질환5,6,7,8,9,10을심문하는 데 사용되어 왔으며, 이는 세포 에너지를 생성하기 위해 손상된 용량을 공유하는 유전적 및 변종성 대사 장애의 유전적 및 현상전형 이질적인 그룹이며, 종종 실질적으로 손상된 신경 근육 기능, 운동 편협 및 피로 111로 임상적으로 존재하는 것으로 나타났습니다. ,12,13,14. 이를 위해 C. elegans 모델을 사용하면 미토콘드리아 질환의 다른 유전 적 특수형에서 동물 활동 및 신경 근육 기능의 양적 측면과 신경 근육 기능의 전임상 모델링뿐만 아니라 신경 근육 기능 및 전반적인 활동을 향상시킬 수있는 후보 치료에 대한 반응을 가능하게합니다.

C. elegans의 신경 근육 활동은 고체 또는 액체 매체에서 기능 분석을 허용하는 수동 및 반자동 접근법을 모두 포함하는 다양한 실험 방법론에 의해 객관적으로 측정할 수있습니다(표 1)1,15. C. elegans 활동의 정확한 양은 근육 및 신경계 의 기능 및 발달과 관련된 발견을 가능하게 하는 것이 중요하다는 것을 입증하였다16,17,18. 이 연구는 C. elegans 질병 모델의 4가지 주요 결과에 대한 신경 근육 기능 및 활동을 평가하기 위해 연구 실험실에서 수행 될 수있는 17 가지 분석술의 실험 요구 사항, 장점 및 한계뿐만 아니라 후보 치료에 대한 응답으로 요약하고 비교합니다(표 1 ). 실제로, 이 연구는 C. elegans 스래싱(분당 몸 굽힘), 운동 활동, 인두 펌핑 및 화학 요법의 비율을 특성화하기 위해 사용 가능한 실험 적 접근법의 범위에 대한 상세한 개요를 제공하여 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 장비 및 소프트웨어를 수행하고 분석하는 데 필요한 각 사례에 제공합니다. 및 각 방법의 처리량 용량은 고처리량 유전 또는 약물 스크리닝 목적으로의 사용을 지원합니다. 각 분석법의 처리량 용량은 웜 유지 관리, 처리 시간, 단일 또는 다중 웰 플레이트의 사용 및/또는 실험자 시간을 포함하여 실험 프로토콜 복잡성에 기초하여 저, 중간 또는 높은 것으로 설명되며, 실험 설정 및 데이터 분석을 완료하는 데 필요한 실험시간.

스래싱19,운동활성(20,인두 펌핑17,21,및 화학요법22,23)의 수동 분석은 스테레오현미경(24)이필요한 웜 활성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법론이다. 벌레의 스래싱 활성을 측정하는 동안 분당 신체 굴곡의 주파수를 결정하기 위해 액체 매체에서 분석이 필요하지만, 웜 운동 활동은 고체 매체 또는 액체 매체에서 측정될 수 있습니다. 그러나 개별 웜 활동에 대한 수동 분석은 본질적으로 시간이 많이 소요되며 피할 수 없는 사용자 생성 편향이 수반됩니다. 웜 활동 분석의 자동화는 사용자 생성 편향을 최소화하고 실험처리량(25)을크게 증가시킬 수 있다. 액체 미디어에서 웜 스래싱 활동의 비디오 녹화는 wrMTrck, ImageJ 플러그인(26)을사용하여 분석 할 수 있습니다. 그러나 wrMTrck을 위해 개발된 원래 실험 설정은 단일 액체 낙하에 너무 많은 웜이 웜이 겹쳐정확한 추적을 어렵게 만들었기 때문에 유틸리티를 제한했습니다. 이러한 실험적 한계가27로해결되었지만 wrMTrck 방법은 고처리량 스크리닝을 지원할 수 없습니다.

C. elegans 미토콘드리아 질병 모델의 후보 치료에 대한 반응으로 기준선에서 웜 운동 활성을 정량화하는 다양한 방법이 존재한다. 여기에는 ZebraLab(뷰포인트 생명 과학), 티어셉시 트래커28,넓은 시야 선충 추적 플랫폼(WF-NTP)29,웜모텔, 웜워워서30,웜랩31,인피니티 칩32,WMicrotracker One33(표 1)이포함됩니다. 이러한 방법은 다중 웜 균주 또는 조건에서 운동을 동시 분석할 수 있게 해주며, 일반적으로 다중 웰 플레이트에서 더 높은 처리량 약물 스크리닝 응용 프로그램을 지원합니다. 이러한 방법 중 일부는 고가의 장비와 오픈 액세스 소프트웨어의 필요성, 실험 프로토콜 수행의 다양한 용이성 등 일반 유틸리티를 제한하거나 향상시킬 수 있는 고유한 고려 사항이 있습니다. 전반적으로 단일 실험 시스템이나 프로토콜이 모든 C. 예르간 운동 활동 실험에 이상적으로 적합하지 않습니다. 오히려 특정 조사자의 실험 목표와 요구 사항에 가장 적합한 방법을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.

인두 펌핑은 C. elegans에서신경 근육 활동을 평가하는 또 다른 중요한 결과를 나타냅니다. C. 엘레간인인은 20개의 근육 세포, 20개의 뉴런 및 20개의 다른 세포로 구성되어 있어 벌레의 성우34,35,36의전방 끝에 에슈리치아 대장균(E. coli)을섭취할 수 있다. 인두 펌핑 비율 17,21,37,38을결정하기 위한 몇 가지 수동 방법이 수립되었다. 대부분의 방법은 실험관찰자(21)에의해 직접 계수하여 인두 펌핑 주파수를 시각화하고 기록하는 스테레오현미경 및 카메라를 사용하는 것을 기반으로 한다. 자동화된 인두 펌핑 속도 분석은 각펌프(39)의지속 기간에 대한 추가 정보를 제공하는 세포외 기록인 전기파린지오그램(EPG)을 수행함으로써 가능하다. 개별 웜이 챔버40,41에국한되는 미세유체 시스템인 WormSpa에서도 인두 펌핑 속도 분석이 가능하다. 인두 펌프 속도의 분석을 용이하게 하는 상용 방법은 맞춤형 칩에 고정된 단일 웜에서 공급 동작의 신경 근육 측면을 측정, 시각화 및 분석하는 ScreenChip System(InVivo Biosystems)입니다. 이러한 인두 펌핑 수량 접근법은약물, 노화 및 기타요인42,43,44,45에대한 뉴런 및 생리적 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

화학요법은 선충 성장 매체(NGM) 플레이트의 정의된 영역에서 벌레로부터 떨어진 악취에 대응하여 C. 엘레건의 움직임을 설명합니다. 화학요법 반응을 평가하는 것은 정의된기간(46)에서벌레가 악취를 향해 이동하는 물리적 거리를 관찰하고 측정함으로써 정량화가능한 벌레 뉴런 및 신경근육 활성의 통합측정을 제공한다. 멀티 웜 트래커는 웜이 유인제 또는격퇴제(47)를향해 이동하는 거리를 정량화하는 실험 효율을 향상시키는 데 사용할 수 있는 자동 방법입니다.

여기서, 웜 활성을 정량화하기 위해 확립된 두 개의 새로운 반자동 방법에 대한 상세한 프로토콜이 설명된다. 첫 번째 접근법은 원래 다리오 리리오 (제브라피쉬)의 수영 활동을 연구하기 위해 개발 된 상용 소프트웨어를 활용하며, 움직임 중 픽셀 변화에 따라 C. elegans의 액체 매체에서 전체 운동 활동을 정량화하는 새로운 중간 처리량 응용 프로그램을 사용합니다(표 1, 그림 1). 이 방법은 다중 웰 플레이트 형식에 적합하지 않지만 데이터 출력은 유리 슬라이드에서 분석된 많은 수의 동시 조건 및 샘플에서 빠르게 가져옵니다. 두 번째 접근법은 Flatbed 스캐너를 사용하여 오픈 소스 소프트웨어와 함께 다양하게 사용할 수 있는 두 가지 순차 적 스캔의 차분이미지를 생성하여 fecundity 및 생존과 같은 통합 생리적 결과의 반자동 정량분석을 가능하게 하는 WormScan 방법론48,49 (그림 2)의새로운 적응입니다. 여기서, 96-well의 우물 당 15 개의 애벌레 단계 4 (L4) 벌레의 인구에서 액체 미디어에서 웜 운동 활성을 정량화하는 WormScan 방법론의 새로운 높은 처리량 적응이 개발되었다. 이 반자동 및 저비용 WormScan 방법론은 고처리량 약물 스크린뿐만 아니라 다양한 동물 단계와48세,49세의 분석에 쉽게 적응 할 수 있습니다.

여기서, ZebraLab과 WormScan 반자동 방법을 모두 사용하여 C. elegans locomotor 활성을 분석하는 프로토콜 및 효능은 미토콘드리아 복합 I 질환, 가스-1(fc21)에 대한 잘 확립된 C. elegans 모델에서 입증된다. 가스-1(K09A9.5 유전자)은 인간 NDUFS2(NADH: 유비퀴논 옥시도레덕타제 코어(철황 단백질) 서브유닛 2)의 직통술이다(도3). C. elegans gas-1(fc21)돌연변이 균주는 NDUFS250의인간 정형소로에서 균질 p.R290K 잘못된 감지 돌연변이를 운반하고, 현저히 감소된 대변과 수명, 손상된 호흡기 사슬 산화 인산화(OXPHOS) 용량51,및 소균성 및 8의 증가미토콘증및 수막을 통해 증가된 미토콘드(8) 증액 . 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 지난 2년간 잘 확립된 사용에도 불구하고 가스-1(fc21)돌연변이의 운동 활성은 이전에 보고되지 않았다. 여기서 ZebraLab 및 WormScan 방법은 야생형(WT, N2 Bristol) 웜과 비교하여가스-1(fc21)의운동 활성을 독립적으로 정량화하기 위해 적용되었으며, 둘 다 방법을 검증하고 실험 프로토콜 및 정보학 분석의 비교 유틸리티 및 효율성을 입증하는 방법으로서. ZebraLab 소프트웨어는 표적 약물 선별 또는 유효성 검사 연구를 위한 잠재적인 응용 프로그램과 함께 C. elegans 미토콘드리아 질병 모델에서 여러 동시 질환의 여러 동시 상태를 신속하게 허용했습니다. 특히 WormScan 분석은 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크린을 쉽게 활성화하고 1차 미토콘드리아 질환의 전임상 C. elegans 모델에서 동물 신경 근육 기능 및 운동 활동을 향상시키는 리드의 우선 순위를 정하는 데 적합합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 유리 슬라이드에 액체 매체의 웜 운동 활동 분석

  1. 선충 성장 및 취급
    1. 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 플레이트에 C. elegans를 성장하고 음식 소스로 Escherichia 대장균 OP50으로 확산. 이전에 설명된바와같이 20°C에서 웜 배양을 유지한다.
    2. 시간 제달 을 수행하는 벌레를 동기화52 원하는 단계에서 벌레를 연구. 이 프로토콜에서 L4 단계 웜을 분석했습니다.
    3. 테스트 또는 버퍼 컨트롤을 테스트할 약물 치료 유무에 관계없이 NGM 플레이트에서 제어 및 돌연변이 웜 균주를 증가시보냅니다. 약물 치료 효과를 평가하기 위해, S. 기저 용액에서 원하는 약물 재고 농도를 준비; 계산된 특정 부피를 NGM 플레이트에 분산시키고 건조시다. 특정 애벌레 또는 성인 단계에서 벌레를 옮기고 분석 전에 원하는 기간 동안 약물 치료 플레이트에 유지하십시오.
  2. 운동 활동 비디오 녹화 및 ZebraLab 분석을 위한 웜의 실험 설정
    1. 웜 픽을 사용하여 변형 및 조건당 동기화된 L4 웜 5개를 선택합니다. 카메라에 연결된 스테레오현미경 아래에 위치한 유리 슬라이드에 S. 기저용 액의 단일 20 μL 방울을 파이펫으로 전송하여 5개의 웜을 전달합니다(그림1A,B). NGM 및 대장균 OP50이 함유된 페트리 접시에서 레코딩 전 순간에만 액체 낙하로 5개의 웜을 전송합니다.
      참고: 이전 비디오가 녹화될 때까지 페트리 접시의 다른 웜을 계속 유지합니다. 이것은 시술 도중 20 μl 방울의 건조로 인하여 그밖 벌레에 생기는 손상을 피할 것입니다 (건조 시간 ~15-20 분).
    2. 파이펫은 여러 개의 기술 복제를 얻기 위해 한 슬라이드에 여러 방울을 떨어뜨립니다(그림1A). 다른 NGM 플레이트(생물학적 복제)에서 웜을 선택합니다. 커버 슬립을 사용하지 마십시오.
    3. 현미경의 작업 거리를 조정하여 단일 낙하의 전체 영역을 시각화합니다. 소프트웨어에서 파일을 업로드하려면 낮은 비디오 해상도(<1024 x 768)를 설정하고 유지 관리합니다.
    4. 기록하기 전에 웜이 실온에서 슬라이드에 1 분 동안 적응하도록 허용합니다.
    5. 초당 15 프레임 (fps)에서 1 분 동안 1 방울로 웜 수영 활동을 기록합니다. 플레이트의 각 추가 드롭에 대한 이미징을 반복합니다.
  3. ZebraLab 소프트웨어의 C. 예레간 운동 활동 기록 분석
    1. ZEBRALAB AVI 옵션을 사용하여 소프트웨어에 동영상을 업로드합니다. AVI파일(그림 1C)을 사용하던 옵션 정량화를 클릭합니다.
    2. 새 프로토콜을 만들려면 파일 > 생성 프로토콜을선택한 다음 분석에 대해 선택한 영역 수를 추가합니다. 위치 수 선택: 1.
    3. 프로토콜 매개 변수를 열고 실험 기간 창에서 1분 을 선택합니다. 다른 실험 기간에 대해 다른 실험 기간을 선택합니다. 원하는 데이터 출력에 따라 시간 없음 창을 선택하거나 선택 해제하고 통합 기간을선택합니다. 본 연구에서는 시간빈이 선택되지않았다(도 1D).
      참고: 시간 저장소는 활동이 평균화되는 시간입니다.
    4. 프로토콜이 이미 생성된 경우 열기 프로토콜을 선택하고 저장된 프로토콜(.vte 형식으로)을 선택합니다.
    5. 파일을 선택하고 동영상을 열어 이전에 기록된 각 개별 비디오 파일을 업로드합니다.
    6. 그림 1E(검정 화살표)에 표시된 영역 아이콘을 선택하여 단일 감지 영역을 구축하고 웜이 있는 전체 액체 낙하 주위에 영역을 만듭니다. 선택,>클리어 마크를 빌드 > 영역 아래 녹색 원 아이콘 (회색 화살표)을 클릭합니다.
      참고: 정의된 낙하내의 모든 웜의 활성은 선택한영역(도 1E,F)에서검출됩니다.
    7. 보정 > 그리기 척도(그림1E)로이동하여 비디오 영역의 왼쪽에서 오른쪽으로 가로선을 그립니다. 보정할 실제 거리를 나타냅니다. 그런 다음 그룹에 적용을 선택합니다.
    8. 영역을 빌드하도록 선택한 아이콘을 선택 취소하고(그림 1E의화살표) 투명을선택하거나 선택 해제합니다.
      참고: 이 연구에서투명을 선택하여 더 나은 결과를 얻었습니다.
    9. 검출 감도 및 활동 임계값을 조정하여 분석된 모든 다른 C. elegans 웜 균주를 감지할 수 있습니다.
      참고: 이 실험에서 검출 감도는 각각 15 및 2의 버스트 및 동결 값으로 8로 설정되었습니다(그림1F).
    10. 활동 분석이 진행되는 동안 동물이 만든 트랙을 시각화하기 위해 디스플레이 스케일을 70으로 설정합니다. 그런 다음 그룹에 적용을 선택합니다(그림1F).
    11. 실험 > 실행 > 저장한다음 시작시 를 클릭합니다. 창이 열립니다. 비디오를 빠르게 분석하기 위해 비디오 미디어를 최대 컴퓨터 속도로 처리하시겠습니까(예: ZebraLab 소프트웨어에서 5초 만에 1분 비디오 녹화를 분석).
    12. 다른 창이 열립니다: 실험 실행; 실험을 진행하려면 시작 시작을 클릭합니다.
    13. 비디오 녹화가 완료되면 분석이 중지됩니다. 실험을 클릭> 중지. 이렇게 하면 스프레드시트에서 한 방울만 떨어뜨리면 분석된 활동이 저장됩니다.
    14. 개별 드롭의 각 비디오에 대한 분석을 반복합니다. 각 드롭은 하나의 기술적 복제입니다.
  4. ZebraLab 데이터의 출력 및 분석
    참고: 실험 후 각 비디오의 데이터는 선택한 폴더에 별도의 스프레드시트로 개별적으로 저장됩니다. 데이터 출력 파일에서 개별 드롭으로 이동하는 모든 웜의 통합 된 활동 수준은 actinteg에서 픽셀 변경으로 기록됩니다.
    1. 각 비디오의 분석에서 얻은 각 스프레드시트를 엽니다. 수동으로 단일 파일로 컴파일합니다.
      돌연변이 및 야생 형 데이터를 제어의 백분율로 정규화합니다. 여기서 통계 분석은 그룹 간의 평균 활동 수준을 비교하기 위해 수행되었습니다.

2. 웜스캔 소프트웨어 분석에 의한 96웰 플레이트 형식의 액체 매체의 웜 운동 활성 분석

  1. 선충 성장 및 취급
    1. 섹션 1.1.1에 설명된 대로 C. 예인단을 성장시보아.
    2. 섹션 1.1.2에 설명된 대로 웜을 동기화합니다.
    3. L4 스테이지 또는 1일성인이 될 때까지 섹션 1.1.3에 설명된 대로 특정 미디어에서 웜을 증가시다.
  2. WormScan 활동 분석을 위한 96웰 플레이트에 웜의 실험 설정
    1. 이전에설명된바와 같이, 96-well, 맑고, 평평한 바닥, 마이크로 플레이트의 각 웰에 S. 기저 배지에 E. 대장균 OP50의 부피당 2%의중량의50μL을 추가한다.
    2. 스테레오 현미경으로, 수동으로 선택 15 L4 단계 또는 일 1 성인에서 그들의 NGM 플레이트에서 액체 매체에 96 잘 마이크로 플레이트의 각 실험 우물 내에서. 벌레가 스캔하기 전에 20 분 동안 액체 미디어에 적응하도록 허용하십시오.
      참고: 다른 동물 단계와 나이는 연구를 위해 쉽게 대체 될 수 있습니다.
  3. 96웰 플레이트의 WormScan 활동 분석 및 데이터 내보내기스프레드시트.
    1. 표준 평판 스캐너를 사용하여 96웰, 투명하고 평평한 마이크로 플레이트를 각각 스캔하여 스캔 사이에 10초 미만이 됩니다.
      참고: 여기서 1,200개의 점/인 및 16비트 그레이스케일의 해상도가 있는 사진 스캐너가 jpeg 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 사진 스캐너를 사용하여 96웰 플레이트 4개를 스캔하는 데 필요한 시간은 10분 미만입니다.
    2. 오픈 소스소프트웨어(49)를사용하여 두 개의 순차스캔(그림 2A)을정렬합니다.
      참고: 이 소프트웨어는 관심영역(그림 2B)과상대 웜스캔 점수에대한 두 순차적 이미지 간의 픽셀 변화를 평가하기 위해 차이 이미지를 생성합니다. 이 웜스캔 점수는 스캐너가5(그림 2C)로설정할 때 스캐너에서 생성한 광 강도에 따라 운동 반응의 변화와 동일하다.
    3. WormScan에서 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 데이터가 포함된 스프레드시트를 로컬 컴퓨터에 저장합니다. 제어를 위한 백분율로 데이터를 정규화하고 다양한 돌연변이 또는 치료 조건에 대한 생물학적 복제 실험을 비교합니다. 통계 분석을 수행하여 학생 t-test를사용하여 돌연변이 및 제어 수단을 비교합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

액체 매체에서 C. elegans locomotor 활성의 분석은 고체 매체에서 쉽게 정량화되지 않을 수 있는 미토콘드리아 질병 웜 모델의 통합 표현형을 쉽게 포착할 수 있었다. ZebraLab은 L4 애벌레 단계에서 액체 매체에서 WTworms에 비해 잘 확립된 미토콘드리아 복합체 I 질환가스-1(fc21)의운동 활성을 정량화하는 데 사용되었습니다. 단일 액체 낙하에 5개의 벌레의 활성은 1분 이상 기록되었으며, 각 변형에 대해 총 19개의 비디오(기술 복제)가 기록되어 스트레인당 95개의 웜을 분석한 결과. 4개의 생물학적 복제 실험은 균주당 수득하였다. 웜 활동은 N2 Bristol WT제어(그림 3B)로정규화될 때 픽셀 변경(그림3A)및 제어(POC)의 백분율로 표시됩니다. 가스-1(fc21)웜(62% ± 16% 픽셀 변화, 평균 ± SD, n=19)는 WT 웜(100% ± 11.35%, 평균 ± sD, n=99)에 비해 L4 단계에서의 운동 활성에서 38%의 감소(p < 0.001, t-test)를가하였다.

웜스캔 분석은 또한 액체 매체에서 L4 단계가스-1(fc21)및 WT 웜의 운동 활성을 정량화하기 위해 수행되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제 실험에 대해 수집되었으며, 각 생물학적 복제 플레이트는 표준 평판 스캐너를 사용하여 스캔된 두 개의 순차적 이미지에 의해 평가되었다. 차동 이미지의 웜 활동은 픽셀 변경과 비교하여 동시에 N2 Bristol WT 제어로 정규화되었습니다. 마찬가지로, 제브라피쉬 행동 선별 방법에 의해 본 바와 같이, 웜스캔 기반 분석은 가스-1(fc21)벌레(65.9 ± 6.1, 평균 ± SD, n =13웰)가 N2 브리스톨 야생형 벌레(100% ± 4.8 ±%, sEM)에 비해 34%(p < 0.001, t-test)로큰 감소를 보였다. 1일째에 웜스캔을 이용한 분석 (50.1% ± 10.7%, 평균 ± SD, n =7 우물)은 WT 웜(100% ± 16.2%, 잘 ±SD) 및 3D)에비해 49%(p < 0.001, t-test)에비해 운동 활동이 감소하는 것을 보였다.

표 1: C. 신경 근육 활동을 평가할 수 있는 실험적인 약체의 비교 개요. 상세한 개요는 C. elegans에서스래싱, 운동, 인두 펌핑 및 /또는 화학 요법의 현상적 결과에 웜 신경 근육 활성을 정량화하는 데 사용할 수있는 16 가지 실험 기술의 넓은 배열을 제공한다. 읽기 형식, 방법론, 실험 처리량 용량, 소프트웨어 및/또는 장비 요구 사항뿐만 아니라 각 분석기의 장점과 제한사항이 자세히 설명되어 있습니다. 각 분석 및 소프트웨어 도구에 대한 참조 및 관련 웹 사이트도 제공됩니다. 각 분석의 처리량 용량은 실험적 복잡성, 단일 또는 다중 웰 플레이트의 사용 및/또는 실험자 시간을 실험 설정 및 데이터 분석을 완료하는 데 필요한 낮은, 중간 또는 높은 것으로 설명된다. * 방법론도 운동 평가에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 1
그림 1: ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 C. 예인선 운동 활동 분석. (A,B) 웜 비디오 녹화를 위한 실험 프로토콜입니다. S. 기저용액의 드롭당 5개의 벌레(20μL)가 도입되었으며, 스테레오현미경 아래 단일 유리 슬라이드에 4방울을 떨어뜨렸습니다. 5개의 웜을 한 방울씩 획득할 때마다 기술적 복제 실험을 나타내며 충전된 결합 장치(CCD) 카메라를 사용하여 별도의 동영상에서 1분 동안 기록되었습니다. (C-F) ZebraLab의 실험 설정은 C. elegans의운동 활동 평가에 적응합니다. (C)각 녹화 된 비디오의 웜 운동 활동을 정량화하기 위해 AVI 파일로 정량화의 선택. (D)프로토콜 매개 변수 설정, 실험 기간으로 1분 선택. (E)관심 영역을 선택하는 영역을 구축합니다. 이 지역은 5개의 웜이 배치된 1방울의 용액을 중심으로 선택되고 지어졌습니다. (F)검출은 각 웜(red)의 전신을 검출하기 위해 회색 스케일 임계값을 기반으로 결정되었다. 임계값 섹션에서는 픽셀 변경으로 웜 활동을 분석하기 위해 버스트 및 동결 값을 선택했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: C. elegans locomotor 활동 분석을 사용하여 WormScan 방법론. (A)엡손 v800 평판 스캐너를 사용하여 96 웰 플레이트의 두 개의 즉시 순차 스캔을 1,200 점 / 인 및 16 비트 그레이 스케일의 해상도로 캡처하여 jpeg 이미지를 생성했습니다. (B)96웰 플레이트의 이 두 가지 순차적 이미지는 WT 웜의 관심 영역(ROI)에 정렬되었다. (C)이미지 분석은 N2 브리스톨에 대해 15개의 웜/웰을 가진 각 ROI에 대해 계산된 차이 이미지 점수를 기반으로 합니다. 차이 이미지가 정규화되어 제어 비율(POC)으로 보고되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: M2 브리스톨 야생형 웜에 비해 가스-1(fc21)미토콘드리아 질환 웜에서 ZebraLab 및 WormScan 소프트웨어 분석에 의한 운동 활성의 비교 분석. (A, B)WT 및 가스-1(fc21)액체 방울(5웜/드롭)의 웜 활성은 1분 동안 영상으로 녹화되고(A) 픽셀 변경(A) 픽셀 변경(A) 및 정량화(A) B픽셀 변경(A) 및 정량화(A) 픽셀 변경(A) 및 정량화(A) 픽셀 변경(A화) ) ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 야생 식 제어의 비율. 전반적으로 ZebraLab 기반 웜 활성 분석은 야생형 대조군(***p < 0.001)에 비해가스-1(fc21)L4 단계 웜에서 38% 크게 감소한 것으로 나타났다. 그래프 표시는 모든 데이터의 ± SD를 의미하며, 각 점은 S. 기초 낙하당 5개의 웜의 전체 활성을 전달합니다. 각 방울은 기술 복제를 나타내며, 조건당 총 4개의 생물학적 복제가 연구됩니다. 총 19개의 동영상(5개의 벌레 한 방울당 1개의 비디오)이 조건당 연구된 총 95개의 개별 웜에 걸쳐 기록되었습니다. 통계 분석은 프리즘 -GraphPad v6에서 학생 t-테스트를사용하여 수행되었다. (C)WT 및 가스-1(fc21)웜은 L4 단계에서 플랫베드 스캐닝을 분석하여 WormScan 소프트웨어에서 분석된 두 개의 순차적 이미지를 생성하여 차이를 산출하였다. 3개의 생물학적 복제 실험은 96개의 우물 판에서 잘 당 15개의 벌레로 수행되었다. WT 웜의 활성은 제어 비율(POC)을 정규화하기 위한 기준선으로 사용되었다. 가스-1(fc21)활성은 야생식 대조군(*** p < 0.001)에 비해 34% 감소했다. Bar 그래프는 세 가지 생물학적 복제 실험에서 평균 및 표준 편차를 전달합니다. (D)N2 및 gas-1(fc21))은성인 1일째에 패널 C. gas-1(fc21)활성에 대해 자세히 설명된 바와 유사하게 분석되었으며, 야생식 대조군 웜(*** p < 0.001)에 비해 49.1% 감소하였다. Bar 그래프는 N2(15개의 웜/웰의 6개의 우물) 및 가스-1(fc21)(15개의 벌레/웰의 7개의 우물)을 비교하는 하나의 생물학적 복제에서 픽셀 변화의 평균 및 표준 편차를 전달합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에서, 연구 결과는 벌레 분쇄, 운동, 인두 펌핑 및 화학 요법을 포함하여 다양한 결과의 수준에서 C. elegans 신경 근육 활동을 공부하기 위한 상세한 정보 및 근거를 요약했습니다. 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 비교는 다른 연령 및 실험 기간에 단일 웜 또는 웜 집단에서 정량화선충 활동의 상대적 처리량, 장점 및 한계의 관점에서 수행되었다. 이 중, 반자동 분석의 두 가지 새로운 적응 및 응용 프로그램은 L4 애벌레 발달 단계에서 애벌레 단계 와 1 일째에 잘 확립 된 미토콘드리아 복합 I 질환 C. elegans 균주, 가스-1(fc21)WT 대조군에서 유의한 감소를 보여주기 위해 강조되었다.

특히, C. 신경근육 기능 및 운동 활동은 WT 웜 운동이 부비동파 패턴에서 매우 규칙적이기 때문에 고체 매체에서 광범위하게 연구되고 있다. 그들의 정규 이동 경로 및 속도의 이상은 종종 낮은 처리량과 지루한 assays에서 실험 관찰자에 의해 현미경으로 검출되고 수동으로 득점될 수 있습니다. 실험적 처리량을 높이려면 자동화된 처리량 과 높은 처리량 방법을 선택해야 합니다. 웜의 손상된 활동은 유리 슬라이드 또는 멀티 웰 플레이트의 작은 물방울에 있는 벌레의 전반적인 운동 활동이 다른 소프트웨어 도구를 사용하여 반자동 또는 자동화된 방식으로 비디오 녹화 및 정량화될 수 있는 액체 매체에서 정량화될 수 있습니다. 실제로, 우리의 데이터는 유리 슬라이드에 액체 방울에 벌레의 비디오에서 locomotor 활동을 정량화하는 ZebraLab 소프트웨어의 새로운 응용에 의해 모두 객관적이고 효율적으로 측정 선충 제 운동 활동의 유용성을 강조 (중간 처리량 선별 용량 접근), 뿐만 아니라 웜 스캔 소프트웨어를 활용하여 웜 의 차동 적재 스캔이미지에서웜 운동 활동을 정량화 하 여 96 액체 중간 펜션 에서 웜 운동 활성을 정량화하 여 96 55,56 (고처리량 스크리닝 용량 접근법). ZebraLab 소프트웨어 접근 방식은 다중 웰 플레이트 형식에 대한 현재 개발된 프로토콜 없이 연구된 각 조건에 대해 단일 플레이트를 사용해야 하기 때문에 중간 처리량 분석으로 간주됩니다. ZebraLab 소프트웨어 접근 방식을 사용하려면 몇 가지 조건에서 C. elegans 활동을 분석할 때 최소한의 시간이 필요하지만 여러 조건에 적용하면 실험 시간이 증가합니다. 여기서, 실험 시간은 각 조건에 대한 18개의 기술 복제를 고려하여 벌레를 액체 물방울로 옮기고 그들의 활동의 비디오를 기록하는 약 2 시간이었습니다. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 이러한 비디오를 분석하는 데 소요된 시간은 약 1시간이었습니다. 이에 비해 웜스캔 방법은 10분 이내에 4개의 96웰 플레이트의 동시 분석을 허용하고 COPAS Bisoter로 96웰 플레이트를 설정하는 다중 웰 플레이트 형식을 통합하여 10분 미만이기 때문에 높은 처리량이다.

두 방법론 모두 WT 웜에 비해 L4 애벌레 단계가스-1(fc21)미토콘드리아 질환 돌연변이 웜에서 유사하게 감소된 활성을 보였으며, 따라서 웜 동작의 차이를 정량화하기 위한 두 가지 뚜렷한 접근법을 검증하였다. 또한, WormScan 분석은 1일째 성인 단계까지 명백히 드러난 바와 같이 가스-1(fc21)웜에서 나이가 들면서 동물 운동 활동의 점진적 감소가 발생했다는 것을 용이하게 입증하는 데 사용되었다.

Zebrafish 수영 분석을 위해 개발된 ZebraLab 소프트웨어를 C. elegans 활동 분석에 적용한 주요 장점은 ZebraLab 소프트웨어에 업로드된 동영상 파일의 반자동 정량 분석을 통해 비디오에서 웜 움직임을 객관적으로 캡처하는 것이 실험적으로 간단하고 저렴하다는 것입니다. 또한, 실험실에서 이 하나의 소프트웨어 도구를 갖는 것은 두 동물 모델 종, 즉 제브라피시와 C. 엘레간에서운동 활동을 정량화하는 데 유용합니다. 단점은 업로드 프로세스가 간단하고 소프트웨어 분석 시간이 상대적으로 빠르지만 구매 및 웜 비디오를 소프트웨어에 수동으로 업로드해야 하는 상용 소프트웨어라는 단점이 있습니다. 전반적으로, 여기에 설명 된 새로운 응용 프로그램은 C. elegans locomotor 활동을 정량화하기 위해 여기에 설명 된 웜 동작에 약물 효과를 평가 할 수있는 직접적인 잠재력을 가지고 있지만, 그 처리량은 고해상도 요구 사항을 감안할 때 낮은 - 투 - 매체남아 있지만, 영화는 유리 슬라이드에 배치 미디어 드롭에서 이동 웜의 캡처 할 필요가.

또한 WormScan 소프트웨어를 적용하여 96웰 플레이트의 액체 미디어에서 웜의 웜 운동 용량을 효율적으로 정량화했습니다. 이 접근법은 표준 평판 스캐너를 사용하여 동물의 대변과 생존을 객관적으로 정량화하는 고처리량 및 저비용 실험 방법을 제공하며 이전에 C. elegans49의고처리량 스크린에 사용되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용편의성, 낮은 설치 비용 및49공개적으로사용할 수 있는 WormScan 소프트웨어에 의해 객관적인 방식으로 빠른 분석을 통해 모든 단계 또는 연령의 많은 조건의 병렬 비교를 가능하게 하는 높은 처리량 스크리닝에 매우 순종적이라는 것입니다. WormScan의 단점은 일부 돌연변이 또는 조건에서 약간의 현상 변화를 감지하기에 충분히 민감하지 않을 수 있는 순차적 검사 사이에 발생하는 변화를 심문할 수 있다는 것입니다. 또한 ZebraLab 및 WormScan 방법 모두 분석 동물 활동에 대한 이미지 픽셀 변경에만 의존하므로 시간이 지남에 따라 특정 치료에 반응하여 균주 간에 발생할 수 있는 웜 크기의 실질적인 차이를 고려 및/또는 두 방법 모두에 대한 정상화 계수로 사용해야 할 수 있으며, 보다 구체적으로 동물 운동 활동에 대한 돌연변이 및/또는 치료 효과의 평가 및 비교를 가능하게 할 수 있다.

전반적으로, 실험 방법의 넓은 배열은 스래싱의 통합 된 phenotypic 결과에 선충 신경 근육 활동을 평가하는 데 사용할 수 있습니다, 운동, 인두 펌핑, 및 / 또는 화학 요법. 이러한 방법 중 16개(표1)를비교하여 특정 실험 및 분석 요구 사항, 장점, 제한 및 처리량 용량을 강조표시했습니다. 이 중에서도 기존 소프트웨어 도구인 ZebraLab(중간 처리량 접근 법)과 WormScan(고처리량 접근 법)의 두 가지 새로운 응용 프로그램에 대한 자세한 실험 프로토콜을 제공했으며, 이는 액체 미디어에서 웜 운동 활동을 반자동, 객관적으로 신속하게 정량화하는 데 특히 유용합니다. 두 실험적 접근법 모두 L4 단계에서 WT C. 엘레간균에 비해 미토콘드리아 질환(gas-1(fc21)에서 발생하는 운동 활성의 정도를 유사하게 감소시켰으며, 가스-1(fc21)의젊은 성인 단계에 의한 운동 활동이 점진적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이 데이터는 내부적으로 일관된 데이터를 산출하는 이러한 실험 적 접근 방식의 유효성을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 다양한 방법은 다양한 질병 병문, 동물 단계 및 연령대에서 광범위한 웜 운동 활동 메트릭을 가능하게 하고, 인간 질환에 대한 납 표적의 전임상 평가에 유용한 지원자 치료 모델링 또는 고처리량 약물 스크린에 대응하여 매우 다재다능하다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.L., N.D.M. 관련 재무 공시가 없습니다. M.J.F.는 미토쿠레아, Inc.의 공동 창립자이며, 리보노바, Inc.에 대한 지분 지분을 가진 과학 자문 위원회 위원, 콘드리온과 라리마르 테라피의 유료 컨설턴트로 과학 이사회 위원입니다. M.J.F.는 이전에 또는 현재 유료 컨설턴트로 미토콘드리아 질환 치료 전임상 및 / 또는 임상 단계 개발에 관련된 여러 회사와 종사하고있다 (아스텔라스 [이전 미토 브리지] 제약 Inc., 사이클리온 치료제, 에피리움 바이오, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, NeuroVive, Reneo 치료제, 스텔스 바이오테라피, 조게닉스, Inc.) 및/또는 후원하는 연구 협력자(AADI 치료제, 카르데로 치료제, 사이클리온 치료제, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, 미션 테라피, NeuroVive, 랩터 치료제, REATA Inc., 리보노바, 스탠디그알 치료제 및 스텔스 바이오테라피(BioTherapeutics).

Acknowledgments

이 프로젝트의 초기 준비에 대한 조직적 지원과 프로토콜 분석에 기여한 에린 하우스(Erin Haus)에게 감사드립니다. 이 작품은 줄리엣의 치료 FBXL4 미토콘드리아 질병 연구 기금, Jaxson Flynt C12ORF65 연구 기금 및 국립 보건 원 (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863, 및 T2303-NS1307)에 의해 투자되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2013).
  2. Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
  3. van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
  4. Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
  5. Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
  6. Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
  7. McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
  8. McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
  9. Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
  10. Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
  11. Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
  12. Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
  13. Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
  14. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  15. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  16. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
  17. Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
  18. Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
  19. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
  20. Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
  21. Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
  22. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  23. Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
  24. Anne, C. H. Behavior. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. 2005-2018, (2006).
  25. Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
  26. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
  27. Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
  28. Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
  29. Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
  30. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  31. Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
  32. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  33. Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
  34. Albertson, D. G., Thomson, J. N. The pharynx of Caenorhabditis elegans. Philososophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 275 (938), 299-325 (1976).
  35. Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
  36. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook. , 1-23 (2012).
  37. Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
  38. Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
  39. Avery, L., Raizen, D., Lockery, S. Electrophysiological methods. Methods in Cell Biology. 48, 251-269 (1995).
  40. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  41. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
  42. Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
  43. Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
  44. Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
  45. Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
  46. Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
  47. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  48. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
  49. Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
  50. Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
  51. Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
  52. Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
  53. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  54. Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
  55. Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
  56. Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).

Tags

행동 문제 170 벌레 C. elegans,운동 활동 인두 펌핑 화학 요법 스래싱 얼룩진 얼룩말랩 웜스캔 높은 처리량 선별 용량 가스-1 (fc21)
미토콘드리아 질환의 <em>카노르하비티스 예르간</em> 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah,… More

Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter