Summary
Centralnervesystemets metastase PDX-modeller repræsenterer de fænotypiske og molekylære egenskaber ved human metastase, hvilket gør dem til fremragende modeller til prækliniske undersøgelser. Her er beskrevet, hvordan man etablerer PDX-modeller og de podningsruter, der bedst anvendes til prækliniske undersøgelser.
Abstract
Udviklingen af nye terapier til metastaser i centralnervesystemet (CNS) er blevet hæmmet af manglen på prækliniske modeller, der nøjagtigt repræsenterer sygdommen. Patientafledte xenograft (PDX) modeller af CNS-metastaser har vist sig bedre at repræsentere de fænotypiske og molekylære egenskaber ved den menneskelige sygdom samt bedre afspejle heterogeniteten og klondynamikken i humane patienttumorer sammenlignet med historiske cellelinjemodeller. Der er flere steder, der kan bruges til at implantere patientafledt væv, når der oprettes prækliniske forsøg, hver med deres egne fordele og ulemper, og hver egnet til at studere forskellige aspekter af den metastatiske kaskade. Her beskriver protokollen, hvordan man etablerer PDX-modeller og præsenterer tre forskellige tilgange til udnyttelse af CNS-metastase PDX-modeller i prækliniske studier, der diskuterer hver af deres anvendelser og begrænsninger. Disse omfatter flankeimplantation, ortopisk injektion i hjernen og intrakardial injektion. Subkutan flankeimplantation er den nemmeste at overvåge og derfor mest bekvem til prækliniske undersøgelser. Derudover blev metastaser til hjerne og andet væv fra flankeimplantation observeret, hvilket indikerer, at tumoren har gennemgået flere trin af metastase, herunder intravasation, ekstravasation og kolonisering. Ortopisk injektion i hjernen er den bedste mulighed for at rekapitulere hjernetumormikromiljøet og er nyttig til bestemmelse af effektiviteten af biologiske lægemidler til at krydse blod-hjernebarrieren (BBB), men omgår de fleste trin i den metastatiske kaskade. Intrakardial injektion letter metastase til hjernen og er også nyttig til at studere organtropisme. Mens denne metode giver afkald på tidligere trin i den metastatiske kaskade, skal disse celler stadig overleve cirkulation, ekstravasere og kolonisere. Nytten af en PDX-model påvirkes derfor af tumorinokulationsvejen, og valget af, hvilken der skal bruges, bør dikteres af det videnskabelige spørgsmål og eksperimentets overordnede mål.
Introduction
Incidensen af metastaser til centralnervesystemet (CNS) er steget i de senere år 1,2,3. Traditionelle terapier til CNS-metastase, såsom tumorresektion, strålebehandling af hele hjernen og stereotaktisk strålekirurgi, har stort set været palliativ og sjældent helbredende og kan føre til svækkende bivirkninger, såsom kognitiv forringelse1. For nylig udvikles mange nye målrettede og immunologiske terapier til behandling af CNS-metastaser, der viser løfte om at være mere effektive behandlinger, samtidig med at de har færre bivirkninger4.
Oversættelse af prækliniske resultater til meningsfulde kliniske endepunkter kræver ofte effektive og prædiktive modelleringsstrategier. Historisk set var cellelinjexenograftmodeller standarden for præklinisk forskning i CNS-metastaseforskning. Disse cellelinjemodeller afspejler imidlertid ikke værtstumorens sande tumoradfærd eller repræsenterer sygdommens histologiske eller molekylære heterogenitet. Desuden er cellelinjemodeller i stand til at tilpasse sig in vitro vækstbetingelser og mister derfor værtstumorens oprindelige egenskaber. Patientafledte xenotransplantater (PDX'er), som indpoder en patients tumor i en immundefekt eller humaniseret mus, anvendes i stigende grad i translationel kræftforskning. Forskere har vist, at PDX-modeller normalt trofast kan rekapitulere tumorvækst, histologiske egenskaber, opretholde tumorheterogenitet, metastatisk potentiale og molekylære genetiske egenskaber. Derudover er PDX-modeller prognostiske, hvorved PDX-tumorlatensperioden korrelerer med patientens samlede overlevelse, og de har også vist sig nøjagtigt at forudsige terapeutisk respons i patientforsøg 5,6.
Der har været en fremkomst af CNS-metastase PDX'er. For det meste er disse blevet udviklet, der repræsenterer tumorer, der stammer fra en enkelt oprindelse, såsom ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)7, brystkræft8,9 og melanom10,11. For nylig er der udviklet og karakteriseret en stor og forskelligartet samling PDX-modeller, der repræsenterer otte forskellige histologiske undertyper12. Det er blevet påvist, at PDX-modeller for CNS-metastaser ligner deres oprindelige patienttumor, både histologisk og molekylært og har også vist histologiske unikke forskelle og ligheder10,12. Desuden, mens de fleste CNS-metastaser PDX-modeller opretholder den klonale heterogenitet af humane tumorer, viste nogle tegn på klonal succession12, hvilket gør dem også ideelle til at studere resistens over for terapier ved at overvåge klonale ændringer efter behandling.
De her beskrevne protokoller skitserer metoder til etablering af PDX og forskellige podningsveje, der anvendes i prækliniske undersøgelser af CNS-metastaser (figur 1). Disse implantationsmetoder varierer i deres evne til at efterligne vækst og metastase. Her fremhæver protokollen applikationerne for hver implantationsvej og demonstrerer, hvordan de kan bruges til undersøgelse af CNS-metastaser.
Protocol
Følgende er en række trinvise protokoller, der anvendes til både etablering af PDX-modeller ved subkutan flankeimplantation og til oprettelse af prækliniske undersøgelser, der muliggør test af behandlinger, som kan hjælpe med at vurdere biologiske ændringer og forskellige trin i den metastatiske kaskade. Alle undersøgelser og modeller brugte 3-8 uger gamle kvindelige NOG-mus. Alle vævsprøverne blev indsamlet med informeret samtykke i overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af Institutional Review Board (IRB). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendt protokol.
1. Etablering og udbredelse af PDX-modeller ved flankeimplantation
- Etablering af PDX modeller
- Efter kirurgisk resektion af tumoren fra patienten i operationsstuen opbevares det friske tumorvæv i en passende opløsning (såsom DMEM) og placeres straks på is. Brug en overskydende opbevaringsopløsning (>10 ml) for at sikre, at vævet er helt nedsænket.
- Overfør væv til vævskulturskål og skyl med 5 ml DPBS.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres i et biosikkerhedsskab ved hjælp af aseptiske teknikker. Der bør træffes forholdsregler ved at bære passende personlige værnemidler (PV) for at beskytte mod mulige infektiøse agenser hos mennesker. - Fjern nekrotiske regioner fra tumoren.
BEMÆRK: Dette kan genkendes som en hvid grødet region mod midten af vævet. - Skær det resterende væv i stykker på ca. 2 x 2 x 2 mm.
- Overfør vævene til et mikrocentrifugerør, der indeholder vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix, og opbevar dem på is. Sørg for, at der anvendes tilstrækkelig kældermembranmatrix (>200 μL) til at nedsænke hvert vævsstykke helt.
- Kryopræserver det resterende væv, der ikke implanteres i henhold til protokollen beskrevet i trin 1.3.
- Bedøv dyret i et induktionskammer med 2-5% isofluran og ilt. Når dyret er bedøvet, overføres det til en næsekegle for at opretholde anæstesi ved 1,5-2,5% isofluran med en kontinuerlig iltforsyning. Bekræft anæstesidybden via manglende pedalrefleks. Påfør den veterinære oftalmiske salve for at forhindre øjentørhed under operationen. Sørg for termisk støtte til dyret gennem hele proceduren, indtil dyret kommer sig.
- Identificer implantationsstedet på musen.
BEMÆRK: Dette skal være på højre eller venstre flanke af musen, generelt markeret sideværts på siden af abdominalområdet, kaudale til brystkassen. - For at forberede det kirurgiske område skal du barbere pelsen og desinficere med tre skiftevis skrubber af povidonjod og 70% ethanol.
- Brug tang til at løfte musens hud og lav et 0,5-1 cm snit på huden.
- Indsæt en kirurgisk saks langsomt under huden på snitstedet for at skabe en lomme (0,5-1 cm dyb) i det subkutane rum.
- Placer forsigtigt et tumorstykke i lommen og skub det, skub det til bunden af lommen for at forhindre, at tumoren glider ud.
- Luk snittet ved hjælp af 4-0 nylon kirurgiske suturer.
BEMÆRK: Andre sårlukningsmetoder såsom ikke-absorberbare eller absorberbare suturer og sårklemmer kan også anvendes. - Overfør musen tilbage til buret og overvåg dyrets genopretning fra anæstesi, indtil det er ambulant.
BEMÆRK: Analgetika er ikke påkrævet, men kan administreres, hvis der observeres smerter hos musene. - Overvåg tumorvæksten ugentligt. Der forventes en tumor pr. Mus.
BEMÆRK: Tumorens volumen ved transplantation synes oprindeligt at falde, men dette er ikke en grund til bekymring. En tumor anses for at have taget, når den bliver håndgribelig og går ind i en logaritmisk vækstfase. Denne første passage repræsenterer F0-generationen. - Når tumorerne begynder at vokse, måle tumorerne tre gange om ugen. Mål længden og bredden af tumorerne med en tykkelse. For at beregne tumorens volumen skal du bruge formlen: længde x bredde x bredde / 2.
- Aflive musene implanteret med PDX-tumorer, når tumorerne er større end 15 mm i diameter ved hjælp af den længste side af tumoren. Udfør eutanasi ved CO 2 indånding i et CO2 induktionskammer, efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær metode.
- Reekter tumoren fra dyrets flanke ved at lave et snit. Disseker den udskårne tumor forsigtigt med stump saks og tang. For at gøre dette skal du først afskære huden oven på tumoren og derefter skære tumoren væk fra muskellaget under den.
- Overfør tumorvævet til >10 ml af en egnet opbevaringsopløsning (såsom DMEM). Placer det straks på is. Denne tumor kan kryopræserveres eller overføres til et andet sæt mus. Overvej denne passage som F1.
BEMÆRK: Passaging igen ville gøre tumorpassagen F2 og så videre.
- Formering af PDX-modeller
- Begynd med den resekterede tumor, der opbevares i opbevaringsopløsning fra trin 1.1.19.
- Overfør vævet til en vævskulturskål og skyl med 5 ml DPBS.
- Fjern de nekrotiske regioner fra tumoren.
- Skær vævet i stykker på ca. 2 x 2 x 2 mm.
- Vævene overføres til et mikrocentrifugerør indeholdende vækstfaktorreduceret kældermembranmatrix (>200 μL) og opbevares på is.
- Kryopræserver det resterende væv, der ikke anvendes til formering i henhold til protokollen beskrevet i trin 1.3.
- Bedøv dyret i et induktionskammer med 2-5% isofluran og ilt. Når dyret er bedøvet, overføres det til en næsekegle for at opretholde anæstesi ved 1,5-2,5% isofluran med en kontinuerlig iltforsyning. Bekræft anæstesidybden via manglende pedalrefleks. Påfør den veterinære oftalmiske salve for at forhindre øjentørhed under operationen. Sørg for termisk støtte til dyret gennem hele proceduren, indtil dyret kommer sig.
- Identificer implantationsstedet på musen.
BEMÆRK: Dette skal være på højre eller venstre flanke af musen, generelt i abdominalområdet, kaudale til brystkassen. - For at forberede det kirurgiske område skal du barbere pelsen og desinficere med tre skiftevis skrubber af povidonjod og 70% ethanol.
- Lav et 0,5-1 cm snit på musens ene flanke.
- Indsæt en kirurgisk saks langsomt under huden ved snittet for at skabe en lomme (0,5-1 cm dyb) i det subkutane rum.
- Placer forsigtigt et tumorstykke i lommen og skub det til bunden af lommen for at forhindre, at tumoren glider ud.
- Luk snittet ved hjælp af 4-0 nylon kirurgiske suturer eller andre sårlukningsmetoder.
- Overfør musen tilbage til buret og overvåg dets genopretning fra anæstesi, indtil det er ambulant.
BEMÆRK: Analgetika er ikke påkrævet, men kan administreres, hvis der observeres smerter hos musene. - Under latens (ikke-vækstfase) skal du overvåge tumorvæksten ugentligt. Der forventes en tumor pr. Mus.
BEMÆRK: Tumorens volumen ved transplantation synes oprindeligt at falde, men dette er ikke en grund til bekymring. En tumor anses for at blive taget, når den bliver håndgribelig og begynder at vokse løbende. - Når tumorerne begynder at vokse, måle tumorerne tre gange om ugen. Mål længden og bredden af tumorerne med en tykkelse. Beregn tumorens volumen ved hjælp af formlen: længde x bredde x bredde / 2.
- Aflive musene implanteret med PDX-tumorer, når tumorerne er større end 15 mm i diameter ved hjælp af den længste side af tumoren. Udfør eutanasi ved CO2-indånding i et CO2-induktionskammer efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær metode.
- Resekter tumoren fra dyrets flanke ved at lave et snit og dissekere tumoren forsigtigt ud med stump saks og tang.
- Overfør tumorvævet til >10 ml af en passende opbevaringsopløsning (såsom DMEM) og læg derefter straks på is.
- Kryopræservering af PDX tumorer
- Aflive musene implanteret med PDX-tumorer, når tumorerne er større end 15 mm i diameter ved hjælp af den længste side af tumoren. Udfør eutanasi ved CO 2 indånding i et CO2 induktionskammer efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær metode.
- Resekter tumoren fra dyrets flanke ved at lave et snit og dissekere tumoren forsigtigt ud med stump saks og tang.
- Overfør tumorvævet til >10 ml af en passende opbevaringsopløsning (såsom DMEM) og læg derefter straks på is.
- Overfør vævet til en vævskulturskål og skyl med 5 ml DPBS.
- Fjern nekrotiske regioner fra tumoren.
- Skær vævet i stykker på ca. 2 x 2 x 2 mm.
- Overfør vævet til kryorør indeholdende 20% DMEM, 70% FBS og 10% DMSO.
- Kryotubeerne overføres til en kryopræserveringsbeholder og anbringes i en -80 °C fryser.
- Når kryorørene er nedkølet til -80 °C, overføres de til opbevaring af flydende nitrogen.
2. Podningsveje for prækliniske undersøgelser
- Subkutan flankeimplantation.
BEMÆRK: Subkutan flankeimplantation kan bruges til lethed og kan være nyttig til at studere alle trin i den metastatiske kaskade.- Brug voksende PDX-tumorer eller kryopræserverede PDX-tumorer til indledende flankeimplantation.
- Til dyrkning af PDX-tumorer skal du aflive musene ved hjælp af en IACUC-godkendt metode, når tumorerne er større end 15 mm lange; resekter tumoren og overfør tumorvævet til en passende opbevaringsopløsning (såsom DMEM) og læg straks på is.
- Ved kryopræserverede PDX-tumorer optøes det kryopræserverede PDX-væv hurtigt ved nedsænkning i 37 °C vandbad.
- Følg trin 1.2.2-1.2.19.
- Ortopisk implantation ved intrakraniel injektion i hjernen.
BEMÆRK: Denne model kan bruges til at teste effektiviteten af lægemidler til at krydse BBB og til at studere tumorkolonisering. Dette afsnit refererer primært til brugen af tumordissociationssættet (se Tabel over materialer). Forskellige vævstyper kræver forskellige dissociationsprotokoller. Det anbefales, at brugeren tester og optimerer protokollen for at maksimere dissociationseffektiviteten.- Aflive musene implanteret med PDX-tumorer ved hjælp af en IACUC-godkendt metode, når tumorerne er større end 15 mm lange.
- Under sterile forhold i et biosikkerhedsskab resekteres PDX-tumorerne kirurgisk og opbevares i DMEM på is.
- Dissociationsopløsningen fremstilles i det passende glas ved at tilsætte enzymblandingen i DMEM som angivet i fabrikantens protokol.
- Vask tumoren i 5 ml DPBS i en vævskulturskål.
- Fjern de nekrotiske regioner fra tumoren.
- Skær tumoren i små stykker på 2-4 mm i længden.
- Overfør tumorstykkerne til røret indeholdende enzymblandingen.
- Fastgør røret til vævsdissociatoren og kør det program, der passer til vævstypen. Se producentens protokol for at få oplysninger om, hvilket program der skal køres, og hvilken adskillelsestid der kræves.
- Efter afslutningen af programmet spændes cellerne gennem en 70 μm cellesi.
- Cellesien vaskes med 20 ml DMEM.
- De dissocierede celler centrifugeres ved 300 x g i 7 min.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne i DPBS opslæmmes igen.
- Tæl cellerne og fortynd til den krævede koncentration.
- Indstil den stereotaksiske ramme i henhold til producentens anvisninger, og forbered en varmepude til musene. Desinficer alle områder med 70% ethanol.
- Bedøv dyret i et induktionskammer med 2-5% isofluran og ilt. Når dyret er bedøvet, overføres det til en næsekegle for at opretholde anæstesi ved 1,5-2,5% isofluran med en kontinuerlig iltforsyning. Bekræft anæstesidybden via manglende pedalrefleks. Påfør den veterinære oftalmiske salve for at forhindre øjentørhed under operationen. Sørg for termisk støtte til dyret gennem hele proceduren, indtil dyret kommer sig.
- Forbered det kirurgiske område ved at barbere pelsen på musens hoved for at udsætte hovedbunden.
- Giv musen det relevante smertestillende middel, såsom en dosis på 1 mg/kg Buprenorphin sustained release (SR) administreret som subkutan injektion.
- Overfør musen til den stereotaksiske ramme. Sørg for, at musen bider på bideblokken. Brug ørestængerne til at fastgøre musens hoved fast.
BEMÆRK: Musen er ordentligt fastgjort, hvis hovedet ikke bevæger sig, når det skubbes forsigtigt med pincet. - Desinficer det barberede område med tre skiftevis skrubber af povidon-jod og 70% ethanol.
- Lav et 5-7 mm langsgående snit i hovedbunden for at udsætte kraniet og trække hovedbunden tilbage.
- Skrab periosteum af med et stump kirurgisk instrument som tang.
- Find bregma på kraniet.
- Placer nålen på den stereotaktiske ramme oven på bregmaen, og nulstil koordinaterne til 0, eller noter koordinaten på armen.
- Flyt armen 1 mm bageste (kausalt) og 1 mm lateralt til højre for midterlinjen.
- Marker denne placering med en permanent markør. Hvis armen indeholder en åbning til sprøjten, skal du sætte en markør på sprøjtespalten for at markere placeringen.
- Bor et lille burrhul i kraniet på dette sted. Anvend ikke for meget pres for at forhindre boring i hjernen.
- Læg en 5 μL, 26 G Hamilton sprøjte med 5-10 x 104 celler i et volumen på 1-2 μL, og fastgør til stereotaksarmen.
- Sæt langsomt Hamilton kanylen 2 mm ind i hjernen.
- Begynd at injicere celler med den ønskede hastighed, normalt 0,2-0,5 μL / min.
- Når injektionen er færdig, trækkes nålen langsomt ud af hjernen.
- Fyld burrhullet med knoglevoks.
- Luk snittet med kirurgiske suturer eller kirurgisk lim.
- Overfør musen tilbage til buret og overvåg dets genopretning fra anæstesi.
- Overvåg dyrenes tilstand regelmæssigt og aflive dem, når de humane effektparameterkriterier er nået i den godkendte protokol.
BEMÆRK: Vellykket tumorvækst i hjernen resulterer i forværret tilstand af dyret, som ofte manifesterer sig med hovedhældning, ru hårfrakke, bøjet krop, skæve øjne, nedsat aktivitet og lav kropstilstandsscore (BCS < 2). - Udfør en obduktion på de euthaniserede dyr, efterfulgt af histologisk analyse for at bekræfte tilstedeværelsen af tumorer i hjernen. Registrer hvor lang tid det tager fra implantation til eutanasi.
- Implantation af PDX-modeller ved intrakardiel injektion
BEMÆRK: Denne model kan bruges til at studere organtropisme, når tumorceller er i omløb. Dette afsnit bruger også Tumor Dissociation Kit og kræver optimering efter vævstype.- Følg trin 2.2.1-2.2.13.
- Bedøv dyret i et induktionskammer med 2-5% isofluran og ilt. Når dyret er bedøvet, overføres det til en næsekegle for at opretholde anæstesi ved 1,5-2,5% isofluran med en kontinuerlig iltforsyning. Bekræft anæstesidybden via manglende pedalrefleks. Påfør den veterinære oftalmiske salve for at forhindre øjentørhed under operationen. Sørg for termisk støtte til dyret gennem hele proceduren, indtil dyret kommer sig.
- Placer derefter musen i liggende stilling.
- For at forberede det kirurgiske område på brystet skal du barbere pelsen og desinficere den med tre skiftevis skrubber povidon-jod og 70% ethanol.
- Træk 0,5-10 x 105 celler i en sprøjte på en 28 G kanyle, op til et volumen på 100 μL.
BEMÆRK: Antallet af celler, der kræves, varierer afhængigt af modellens aggressivitet, og det optimale antal celler skal bestemmes empirisk for hver model. - Find injektionsstedet (lidt til venstre for musens brystben og halvvejs mellem brysthakket og xyphoid-processen).
- Stik kanylen lodret ind i musen på injektionsstedet.
- Overhold den vellykkede indtræden i venstre ventrikel gennem en tilbagestrømning af blod, der kommer ind i sprøjten. Dispenser langsomt cellerne i venstre ventrikel uden at flytte nålen.
- Træk langsomt nålen lodret ud af musen.
- Påfør et stykke sterilt gaze over injektionsstedet og tryk i ca. 1 minut, indtil blødningen stopper, mens du stadig tillader brystbevægelse for åndedræt.
- Fjern musen fra anæstesi, og lad den komme sig på en opvarmet pude.
BEMÆRK: Vellykket tumorvækst resulterer i forværret tilstand af dyret, som ofte manifesterer sig med ruffled hårfrakke, bøjet krop, skæve øjne, nedsat aktivitet og lav kropstilstandsscore (BCS < 2). - Overvåg dyrenes tilstand regelmæssigt og aflive dem, når de humane effektparameterkriterier er nået i den godkendte protokol.
- Udfør en obduktion for at identificere metastaser på de euthaniserede dyr, efterfulgt af histologisk analyse for at bekræfte tilstedeværelsen af tumorer i målorganet. Optag hvor lang tid det tager fra intrakardial injektion til eutanasi.
Representative Results
Flankeformerede PDX-tumorer er de nemmeste at implantere, overvåge og resektere og anbefales generelt til indledende etablering og udbredelse af PDX-tumorer (figur 1). Ved etablering eller formering af PDX-tumorer er det klogt at implantere tumorer i flere dyr, da tumorens optagelseshastighed kan variere, og ikke hvert stykke tumor altid vil tage mus ind. Der er udviklet metoder til etablering og udbredelse af CNS-metastaser PDX'er direkte i hjernen13. Imidlertid er disse metoder stadig mere udfordrende med lavere optagelseshastigheder, og tumorerne er signifikant vanskeligere at formere og overvåge end flankeimplantation.
Hvis patient tumorer ikke er let tilgængelige, CNS metastase PDX tumorer kan også fås fra en række forskellige kilder, herunder repositorier af akademiske laboratorier eller kommercielle virksomheder. Efter erhvervelse af tumorerne ville den første prioritet være at formere og kryopræservere så meget materiale som muligt, hvilket sikrer, at et stort antal tumorer med lav passage bevares. Dette sikrer, at der er tilstrækkeligt materiale til rådighed til et ubestemt antal efterfølgende undersøgelser med PDX-modellerne. Ligesom udødeliggjorte cellelinjer bør PDX-tumorer kryopræserveres og anvendes ved lave passagenumre, da genetisk drift resulterer i ændringer i fænotypen og genotypen af PDX'erne over tid12,14,15. Uanset kilden til PDX-tumorer er det vigtigt at udføre hyppig screening af PDX- og musekolonier for både humane og musepatogener, såsom HIV og hepatitis for mennesker og Corynebacterium bovis for mus. Dette vil begrænse spredningen af uønskede patogener fra PDX til både den person, der håndterer dem og andre mus i undersøgelsen og vivarium.
De implantationsmetoder, der er beskrevet her, kan bruges til at studere tumorbiologi, evaluere flere aspekter af den metastatiske kaskade og til prækliniske undersøgelser. Den største fordel ved flankeimplantation er den lette tumorovervågning over tid, da tumorer er synlige, og dens vækst let kan måles ved hjælp af en tykkelse. Denne metode kan være et godt sted at starte for at fastslå gennemførligheden af et lægemiddelmål. Intrakraniel implantation foretrækkes, hvis tilstedeværelsen af hjernens mikromiljø er vigtig og kan ændre tumorens vækst eller molekylære profil. Derudover placerer intrakraniel implantation tumoren bag blodhjernebarrieren (BBB), hvilket gør det vigtigt for prækliniske undersøgelser, der undersøger effektiviteten af lægemidler, der kræves for at krydse BBB. Det er imidlertid vanskeligt at overvåge væksten af PDX-tumorer og kræver radiologisk billeddannelse eller bioluminescerende billeddannelse, hvis cellerne er mærket. At vide, hvornår man skal starte lægemiddelbehandlingen præklinisk, ville kræve enten billeddata for at overvåge væksten eller viden om gennemsnitlig overlevelse af mus, der bærer en bestemt PDX-tumor. Desuden omgår intrakraniel implantation alle de væsentlige trin i den metastatiske kaskade, hvilket gør den kun egnet til at studere lægemiddeleffektivitet og tumormikromiljø i hjernen. På trods af forskellene i tumormikromiljøet er morfologien af PDX-tumorer ens uanset implantationsstedet, som det kan ses i denne PDX-tumor (CM04) afledt af en hjernemetastase, der stammer fra en primær tumor med småcellet lungekræft (figur 2). Den småcellede lungekræftmorfologi af tumorceller med små kerner og ringe cytoplasma kan observeres i flanketumoren, intrakraniel tumor og abdominal metastase som følge af intrakardial injektion. Desuden er spontan metastase fra tumorer implanteret i flanken tidligere blevet observeret12, hvilket tyder på, at de metastatiske processer såsom intravasation, ekstravasation og kolonisering kan rekapituleres og studeres i flanketumorer, som ellers ikke ville være mulige med ortopiske tumorer i hjernen. Generelt observeres det, at flankeimplantation er en egnet metode til at studere CNS-metastasebiologi og gennemføre prækliniske undersøgelser.
Intrakardial injektion bruges oftest til at studere organtropisme og metastatisk potentiale af tumorer. Injicerede tumorceller skulle gennemgå flere trin i den metastatiske kaskade, herunder overlevende cirkulation, ekstravasation og kolonisering af det metastatiske sted. Ligesom ortotopisk injektion i hjernen kan det være svært at spore udviklingen af tumormetastaser uden radiologisk billeddannelse eller cellemærkning. Som med ortopisk implantation resulterer vellykket podning imidlertid i forringelse af dyrenes tilstand over tid, når tumoren spredes. Figur 3A viser metastase til hjernen efter intrakardiel injektion i CNS-metastase PDX-model, M2, der stammer fra et melanom. Intrakardial injektion af PDX-tumor (CM04) resulterede i metastase til bughulen og leveren (figur 3B). Andre organer, der blev vurderet, såsom lunge, nyre og æggestokke, havde ingen synlige metastaser.
Figur 1: Rutediagram, der viser den generelle arbejdsgang for etablering, formering og brug af PDX til prækliniske undersøgelser. For hver podningsmetode er trin i den involverede metastatiske kaskade anført under hver metode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Histologi af PDX-tumorer efter forskellige podningsmetoder. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning af en CNS-metastase PDX-tumor, der stammer fra småcellet lungekræft (CM04) implanteret i immunkompromitterede mus ved de tre metoder, har lignende tumorpatohistologiske og morfologiske træk ved småcellet lungekræft med små kerner og ringe cytoplasma. Det intrakardiale injektionspanel viser en abdominal metastase. Reder af små celler og højt nukleart til cytoplasmatisk forhold er tydeligt i alle de tre billeder. Billeder blev taget på en diasscanner og forstørret til 10x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Metastaser observeret efter intrakardiel injektion. H&E-farvning af væv med synlig metastase under vurdering ved obduktion efter intrakardial injektion af (A) M2 og (B) CM04. Billeder blev taget (A) på en diasscanner og forstørret til 1x (venstre) eller 20x (højre) eller (B) på et almindeligt mikroskop ved 10x forstørrelse. Dette tal er ændret i forhold til vores tidligere publikation12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
I det nuværende manuskript er metoder til etablering og formering af PDX blevet detaljeret. Tre forskellige podningsmetoder, der kan bruges til at oprette prækliniske undersøgelser ved evaluering af CNS-metastase, er også blevet demonstreret. Den valgte metode bør afhænge af eksperimentets mål. I nogle tilfælde vil det være en fordel at anvende mere end én podningsvej. For eksempel giver subkutan flankeimplantation en enkel tilgang til at studere effektiviteten af et lægemiddel på tumorvækst og vurdere lægemidlet på dets mål, og det giver også en visuel for tumorstørrelse, der let overvåges og måles. Men når målet gennemførlighed og antitumor vækstegenskaber er etableret, kunne man oprette en ortopisk undersøgelse for at vurdere effektiviteten af det biologiske middel til at krydse BBB og studere dets virkning inden for hjernetumormikromiljøet. Overlevelse vurderes også bedre i ortopiske og intrakardiale injektionsstudier.
Intrakraniel injektion af hjernemetastase PDX-modeller er ofte den prækliniske model, der vælges på grund af tilstedeværelsen af hjernens mikromiljø og BBB. Undersøgelser har imidlertid vist, at hjernemetastaser har evnen til at ændre BBB, hvilket påvirker molekylernes permeabilitet til tumoren16. Disse ændringer i BBB ville ikke blive afspejlet af intrakranielt implanterede tumorer, og på grund af dette afspejler prækliniske lægemiddelundersøgelser muligvis ikke fuldt ud responsen fra patienttumorer. Selv med denne advarsel forbliver intrakraniel injektion den bedste metode til at teste permeabiliteten og effektiviteten af lægemidler til at krydse BBB i prækliniske modeller. En anden udfordring med intrakranielle modeller er, at de er vanskelige at overvåge tumorvækst og kræver brug af billeddannelsesteknikker. Viral transduktion af PDX'er med fluorescerende eller bioluminescerende markører har traditionelt været anvendt, men kan være udfordrende at udføre. Imidlertid udvikles flere billeddannelsesteknikker til brug hos mus, der ikke kræver introduktion af markører, hvilket kan forbedre den lette overvågning af disse ortopiske hjernetumorer til prækliniske undersøgelser. Disse omfatter billeddannelsesteknologier såsom magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og positronemissionstomografi (PET) billeddannelse og mikrocomputertomografi (mikro-CT). Endelig kan intrakraniel injektion ikke nøjagtigt afspejle mikromiljøet af CNS-metastaser uden for hjernen, såsom i leptomeningeal metastase. I dette tilfælde kunne injektion i cisterna magna udføres for mere præcist at repræsentere leptomeningeale metastaser17.
Karakterisering af både de fænotypiske og molekylære egenskaber ved PDX-modellen er vigtig for at vælge de bedste modeller til prækliniske studier. Tumor latens kan variere fra 7-140 dage og tage satser kan også være meget variabel12. Det optimale antal dyr, der skal implanteres, og tidspunktet for påbegyndelse af behandlingen skal baseres på egenskaberne ved hver PDX-model og skal bestemmes empirisk. Desuden er PDX-tumorers molekylære profil også vigtig for udvælgelsen af de mest repræsentative PDX-modeller til prækliniske studier. Jo tættere modellen molekylært repræsenterer donorvævet, jo mere prædiktiv for klinisk respons vil det sandsynligvis være. Det er også afgørende at sikre, at de mål, der vælges ud fra humane data, er til stede i PDX'erne, der vælges til undersøgelser, og opretholdes gennem et par generationer, da påvist klonal succession er forbundet med en anden genomisk profil af den etablerede dominerende klon. I lyset af dette er de fænotypiske og molekylære profiler af CNS-metastasen PDX-tumorer blevet grundigt karakteriseret over flere generationer12.
På trods af de mange fordele ved at bruge CNS-metastase PDX-modeller er der flere begrænsninger relateret til deres anvendelse. For det første er et alternativt tumormikromiljø og især mangel på et immunsystem veldokumenterede begrænsninger ved PDX-modeller18. Xenograft af en human tumor i mus resulterer i udskiftning af human stroma med musestroma med hver efterfølgende passage, og den menneskelige stroma erstattes generelt fuldstændigt efter flere passager19. Forskellene i tumormikromiljøet resulterer imidlertid ikke i store forskelle i den molekylære profil af flankeimplanterede PDX-tumorer sammenlignet med den oprindelige patienttumor12, hvilket tyder på, at flankemodeller stadig repræsenterer gode eksperimentelle modeller til undersøgelse af CNS-metastase. For det andet resulterer brugen af immunkompromitterede dyr i mangel på immuncelleinfiltration i tumoren og et generelt immunrespons fra værten, hvilket begrænser en grundlæggende måde, hvorpå værten forsøger at bekæmpe kræftvækst12. Mens humaniserede mus indpodet med humane immunceller er tilgængelige for at studere interaktionerne mellem specifikke immunceller med tumoren, er der stadig mange spørgsmål og kontroverser om tilgange, metoder og fortolkning af disse resultater20.
Mens størstedelen af PDX'er har vist sig at være genetisk stabile, har vi og andre vist, at der i sjældne tilfælde, selv i mangel af behandlinger eller andet eksternt selektivt pres, kan være ændringer i tumorernes kloner, såsom mindre klonovertagelse12,14,15. Dette kunne resultere i dramatiske ændringer i den molekylære profil, hvilket i sidste ende ville gøre tumoren ikke afspejler de dominerende kloner i patientens tumor12. Mens PDX'er, der viser klonal succession, kan have brug i prækliniske undersøgelser, kan mange gener, der er beregnet til målretning (f.eks. Her2), gå tabt med klonal succession. Derfor opfordres der til hyppig screening af PDX-modeller for at afgøre, om de stadig opretholder den ønskede klons molekylære profil.
Sammenfattende repræsenterer PDX-modeller et fremragende modelsystem til undersøgelse af ikke kun CNS-metastase, men også andre tumortyper. Udviklingen af disse modeller har vist, at de stort set afspejler den fænotypic, molekylære profil og heterogenitet af human CNS-metastase 8,9,10,12. De tjener som effektive modeller til at studere både CNS-metastasebiologi og fungerer også godt som fysiologisk relevante prækliniske modeller, der erstatter overbrugte cellelinjemodeller, der historisk er brugt til in vivo-undersøgelser af CNS-metastase. Uden tvivl eksisterer forskelle mellem PDX og donorpatienttumor12,18. At vide, hvad disse forskelle er, er vigtigt for korrekt planlægning og udførelse af prækliniske undersøgelser. Endelig er PDX-modeller ved at vælge mellem flere podningsruter alsidige i deres anvendelse, hvilket gør det muligt at studere flere aspekter af sygdommen. PDX'er modeller vil uden tvivl spille en vigtig rolle i at fremme vores forståelse af CNS metastase og udviklingen af nye terapier.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Figur 3A blev taget fra vores tidligere publikation12 og blev genereret i Dr. Jann Sarkarias laboratorium på Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
