Summary
Модели PDX метастазов в центральную нервную систему представляют фенотипические и молекулярные характеристики метастазов человека, что делает их отличными моделями для доклинических исследований. Здесь описано, как установить модели PDX и пути инокуляции, которые лучше всего использовать для доклинических исследований.
Abstract
Разработка новых методов лечения метастазов в центральную нервную систему (ЦНС) была затруднена из-за отсутствия доклинических моделей, которые точно представляли бы заболевание. Было показано, что модели метастазов в ЦНС с помощью ксенотрансплантата пациента (PDX) лучше отражают фенотипические и молекулярные характеристики заболевания человека, а также лучше отражают гетерогенность и клональную динамику опухолей пациентов у человека по сравнению с историческими моделями клеточных линий. Существует несколько сайтов, которые можно использовать для имплантации тканей, полученных от пациента, при проведении доклинических испытаний, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, и каждый из них подходит для изучения различных аспектов метастатического каскада. Здесь в протоколе описывается, как создавать модели PDX, и представлены три различных подхода к использованию моделей PDX метастазов в ЦНС в доклинических исследованиях, обсуждаются каждое из их применений и ограничений. К ним относятся фланговая имплантация, ортотопическая инъекция в мозг и внутрисердечная инъекция. Подкожная боковая имплантация является самой простой для мониторинга и, следовательно, наиболее удобной для доклинических исследований. Кроме того, наблюдались метастазы в мозг и другие ткани от боковой имплантации, что указывает на то, что опухоль подверглась нескольким стадиям метастазирования, включая интравазацию, экстравазацию и колонизацию. Ортотопическая инъекция в головной мозг является лучшим вариантом для рекапитуляции микроокружения опухоли головного мозга и полезна для определения эффективности биологических препаратов для преодоления гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), но обходит большинство этапов метастатического каскада. Внутрисердечная инъекция облегчает метастазирование в мозг, а также полезна для изучения тропизма органов. Хотя этот метод отказывается от более ранних этапов метастатического каскада, этим клеткам все равно придется выживать в кровообращении, экстравазировать и колонизировать. Таким образом, полезность модели PDX зависит от пути инокуляции опухоли, и выбор того, какой из них использовать, должен быть продиктован научным вопросом и общими целями эксперимента.
Introduction
Частота метастазирования в центральную нервную систему (ЦНС) за последние годы увеличилась 1,2,3. Традиционные методы лечения метастазов в ЦНС, такие как резекция опухоли, лучевая терапия всего мозга и стереотаксическая радиохирургия, были в основном паллиативными и редко излечивающими и могут приводить к изнурительным побочным эффектам, таким как ухудшение когнитивных функций1. В последнее время для лечения метастазов в ЦНС разрабатывается много новых таргетных и иммунологических методов лечения, которые обещают быть более эффективными методами лечения, имея при этом меньше побочных эффектов4.
Преобразование доклинических результатов в значимые клинические конечные точки часто требует эффективных и прогностических стратегий моделирования. Исторически сложилось так, что модели ксенотрансплантатов клеточных линий были стандартом для доклинических исследований метастазов в ЦНС. Однако эти модели клеточных линий не отражают истинное опухолевое поведение опухоли-хозяина и не представляют гистологическую или молекулярную гетерогенность заболевания. Кроме того, модели клеточных линий способны адаптироваться к условиям роста in vitro и, следовательно, терять первоначальные свойства опухоли-хозяина. Ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), которые приживают опухоль пациента к иммунодефицитной или гуманизированной мыши, все чаще используются в трансляционных исследованиях рака. Исследователи показали, что модели PDX обычно могут точно повторять рост опухоли, гистологические характеристики, поддерживать гетерогенность опухоли, метастатический потенциал и молекулярно-генетические особенности. Кроме того, модели PDX являются прогностическими, в соответствии с которыми латентный период опухоли PDX коррелирует с общей выживаемостью пациентов, и они также показали, что они точно предсказывают терапевтический ответ в исследованиях пациентов 5,6.
Наблюдается появление PDX метастазов в ЦНС. В основном они были разработаны, представляя опухоли, происходящие из одного происхождения, такие как немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ)7, рак молочной железы8,9 и меланома10,11. Совсем недавно была разработана и охарактеризована большая и разнообразная коллекция моделей PDX, представляющих восемь различных гистологических подтипов12. Было продемонстрировано, что модели PDX для метастазирования в ЦНС очень похожи на исходную опухоль пациента как гистологически, так и молекулярно, а также продемонстрировали гистологические уникальные различия и сходства10,12. Кроме того, в то время как большинство моделей PDX метастазов в ЦНС поддерживают клональную гетерогенность опухолей человека, некоторые из них продемонстрировали признаки клональной сукцессии12, что делает их также идеальными для изучения резистентности к терапии путем мониторинга клональных изменений после лечения.
Описанные здесь протоколы описывают методы установления PDX и различные пути инокуляции, используемые в доклинических исследованиях метастазов в ЦНС (рис. 1). Эти методы имплантации различаются по своей способности имитировать рост и метастазирование. Здесь протокол выделяет приложения для каждого пути имплантации и демонстрирует, как их можно использовать для изучения метастазов в ЦНС.
Protocol
Ниже приведен ряд пошаговых протоколов, используемых как для создания моделей PDX путем подкожной боковой имплантации, так и для организации доклинических исследований, которые позволяют тестировать методы лечения, которые могут помочь в оценке биологических изменений и различных этапов метастатического каскада. Во всех исследованиях и моделях использовались самки мышей NOG в возрасте 3-8 недель. Все образцы тканей были собраны с информированного согласия в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом (IRB). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Создание и распространение моделей PDX путем фланговой имплантации
- Создание моделей PDX
- После хирургической резекции опухоли у пациента в операционной храните свежие опухолевые ткани в подходящем растворе (например, DMEM) и немедленно поместите его на лед. Используйте избыток раствора для хранения (>10 мл), чтобы убедиться, что ткань полностью погружена в воду.
- Переложите ткань в чашку для культивирования тканей и промойте 5 мл DPBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует проводить в шкафу биобезопасности с использованием асептических методов. Следует соблюдать меры предосторожности, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) для защиты от возможных инфекционных агентов человека. - Удаляют некротические участки из опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно распознать как белую кашеобразную область по направлению к центру ткани. - Разрежьте оставшуюся ткань примерно на кусочки размером примерно 2 х 2 х 2 мм.
- Перенесите ткани в микроцентрифужную пробирку, содержащую фактор роста пониженного базального мембранного матрикса, и храните их на льду. Убедитесь, что для полного погружения каждого кусочка ткани используется достаточное количество матрицы базальной мембраны (>200 мкл).
- Криоконсервировать оставшиеся ткани, которые не будут имплантированы в соответствии с протоколом, описанным на шаге 1.3.
- Обезболивают животное в индукционной камере с 2-5% изофлураном и кислородом. После анестезии переведите животное в носовой конус для поддержания анестезии на уровне 1,5-2,5% изофлурана с непрерывной подачей кислорода. Подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Обеспечьте тепловую поддержку животному на протяжении всей процедуры, пока животное не выздоровеет.
- Определите место имплантации на мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть на правом или левом боку мыши, обычно с боковой стороны брюшной области, каудально к грудной клетке. - Чтобы подготовить операционную зону, сбрейте мех и продезинфицируйте его тремя чередующимися скрабами из повидон-йода и 70% этанола.
- С помощью щипцов приподнимите кожу мыши и сделайте разрез на коже 0,5-1 см.
- Медленно вставьте хирургические ножницы под кожу в месте разреза, чтобы создать карман (глубиной 0,5-1 см) в подкожном пространстве.
- Осторожно поместите один кусочек опухоли в карман и надавите на него, прижмите его к дну кармана, чтобы опухоль не выскользнула.
- Закройте разрез нейлоновыми хирургическими швами 4-0.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать другие методы закрытия раны, такие как нерассасывающиеся или рассасывающиеся швы и зажимы для раны. - Перенесите мышь обратно в клетку и следите за восстановлением животного после анестезии, пока оно не станет амбулаторным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгетики не требуются, но могут вводиться, если у мышей наблюдается боль. - Еженедельно следите за ростом опухоли. На мышь ожидается одна опухоль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем опухоли при трансплантации, по-видимому, первоначально уменьшится, но это не повод для беспокойства. Считается, что опухоль прошла, как только она становится пальпируемой и вступает в логарифмическую фазу роста. Этот первый отрывок представляет поколение F0. - Как только опухоли начнут расти, измеряйте опухоли три раза в неделю. Измерьте длину и ширину новообразований штангенциркулем. Чтобы рассчитать объем опухоли, воспользуйтесь формулой: длина х ширина х ширина / 2.
- Усыпляйте мышей, которым имплантировали опухоли PDX, когда опухоли превышают 15 мм в диаметре, используя самую длинную сторону опухоли. Выполните эвтаназию путем ингаляции CO2 в индукционной камере CO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода.
- Резецируют опухоль с бока животного, сделав надрез. Аккуратно рассеките иссеченную опухоль тупыми ножницами и щипцами. Для этого сначала срезают кожу поверх опухоли, затем срезают опухоль от мышечного слоя под ней.
- Перенесите опухолевую ткань в >10 мл подходящего раствора для хранения (например, DMEM). Сразу же положите его на лед. Эта опухоль может быть криоконсервирована или передана другому набору мышей. Считайте этот отрывок F1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное пассирование приведет к тому, что опухоль пройдет F2 и так далее.
- Распространение моделей PDX
- Начните с резецированной опухоли, хранящейся в растворе для хранения с шага 1.1.19.
- Переложите ткань в чашку для культивирования тканей и промойте 5 мл DPBS.
- Удаляют некротические участки из опухоли.
- Разрежьте ткань примерно на кусочки размером примерно 2 х 2 х 2 мм.
- Переносят ткани в микроцентрифужную пробирку, содержащую матрикс базальной мембраны с пониженным фактором роста (>200 мкл) и хранят на льду.
- Криоконсервируйте оставшуюся ткань, которая не используется для размножения, в соответствии с протоколом, описанным на шаге 1.3.
- Обезболивают животное в индукционной камере с 2-5% изофлураном и кислородом. После анестезии переведите животное в носовой конус для поддержания анестезии на уровне 1,5-2,5% изофлурана с непрерывной подачей кислорода. Подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Обеспечьте тепловую поддержку животному на протяжении всей процедуры, пока животное не выздоровеет.
- Определите место имплантации на мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть на правом или левом боку мыши, как правило, в брюшной области, каудально к грудной клетке. - Чтобы подготовить операционную зону, сбрейте мех и продезинфицируйте его тремя чередующимися скрабами из повидон-йода и 70% этанола.
- Сделайте надрез 0,5-1 см на одном боку мыши.
- Медленно вставьте хирургические ножницы под кожу в месте разреза, чтобы создать карман (глубиной 0,5-1 см) в подкожном пространстве.
- Осторожно поместите один кусочек опухоли в карман и прижмите его к дну кармана, чтобы опухоль не выскользнула.
- Закройте разрез нейлоновыми хирургическими швами 4-0 или другими методами закрытия раны.
- Перенесите мышь обратно в клетку и следите за ее восстановлением после анестезии, пока она не станет амбулаторной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анальгетики не требуются, но могут вводиться, если у мышей наблюдается боль. - Во время латентности (фазы без роста) еженедельно контролируйте рост опухоли. На мышь ожидается одна опухоль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем опухоли при трансплантации, по-видимому, первоначально уменьшится, но это не повод для беспокойства. Считается, что опухоль берется, как только она становится пальпируемой и начинает постоянно расти. - Как только опухоли начнут расти, измеряйте опухоли три раза в неделю. Измерьте длину и ширину новообразований штангенциркулем. Рассчитайте объем опухоли по формуле: длина х ширина х ширина / 2.
- Усыпляйте мышей, которым имплантировали опухоли PDX, когда опухоли превышают 15 мм в диаметре, используя самую длинную сторону опухоли. Выполняйте эвтаназию путем вдыхания CO2 в индукционной камере CO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода.
- Резецируйте опухоль с бока животного, сделав разрез и аккуратно рассекая опухоль тупыми ножницами и щипцами.
- Перенесите опухолевую ткань в >10 мл подходящего раствора для хранения (например, DMEM), а затем немедленно поместите на лед.
- Криоконсервация опухолей PDX
- Усыпляйте мышей, которым имплантировали опухоли PDX, когда опухоли превышают 15 мм в диаметре, используя самую длинную сторону опухоли. Выполните эвтаназию путем ингаляции CO2 в индукционной камере CO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода.
- Резецируйте опухоль с бока животного, сделав разрез и аккуратно рассекая опухоль тупыми ножницами и щипцами.
- Перенесите опухолевую ткань в >10 мл подходящего раствора для хранения (например, DMEM), а затем немедленно поместите на лед.
- Переложите ткань в чашку для культивирования тканей и промойте 5 мл DPBS.
- Удаляют некротические участки из опухоли.
- Разрежьте ткань примерно на кусочки размером примерно 2 х 2 х 2 мм.
- Перенесите ткань в криотрубки, содержащие 20% DMEM, 70% FBS и 10% DMSO.
- Переложите криотрубки в контейнер для криоконсервации и поместите в морозильную камеру с температурой -80 °C.
- Когда криотрубы охладятся до -80 °C, перенесите их в хранилище жидкого азота.
2. Пути инокуляции для доклинических исследований
- Подкожная боковая имплантация.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подкожная боковая имплантация может быть использована для легкости и может быть полезна для изучения всех этапов метастатического каскада.- Используйте растущие опухоли PDX или криоконсервированные опухоли PDX для первоначальной имплантации по бокам.
- Для выращивания опухолей PDX усыпляйте мышей, используя метод, одобренный IACUC, когда опухоли превышают 15 мм в длину; резецировать опухоль и перенести опухолевую ткань в подходящий раствор для хранения (например, DMEM) и немедленно поместить на лед.
- При криоконсервированных опухолях PDX быстро разморозьте криоконсервированную ткань PDX, погрузив ее в водяную баню с температурой 37 °C.
- Выполните шаги 1.2.2-1.2.19.
- Ортотопическая имплантация путем внутричерепной инъекции в головной мозг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель может быть использована для проверки эффективности лекарств для пересечения ГЭБ и для изучения колонизации опухоли. В этом разделе в первую очередь упоминается использование набора для диссоциации опухоли (см. Таблица материалов). Разные типы тканей требуют разных протоколов диссоциации. Рекомендуется, чтобы пользователь протестировал и оптимизировал протокол, чтобы максимизировать эффективность диссоциации.- Усыпьте мышей, имплантированных с опухолями PDX, используя метод, одобренный IACUC, когда опухоли превышают 15 мм в длину.
- В стерильных условиях в шкафу биобезопасности хирургическим путем резецируют опухоли PDX и хранят в DMEM на льду.
- Приготовьте диссоциационный раствор в соответствующей пробирке, добавив смесь ферментов в DMEM, как указано в протоколе производителя.
- Промойте опухоль в 5 мл DPBS в чашке для культивирования тканей.
- Удаляют некротические участки из опухоли.
- Разрежьте опухоль на небольшие кусочки длиной 2-4 мм.
- Перенесите кусочки опухоли в пробирку, содержащую смесь ферментов.
- Прикрепите трубку к тканевому диссоциатору и запустите программу, подходящую для типа ткани. Обратитесь к протоколу производителя, чтобы узнать, какую программу нужно запустить, а также необходимое время диссоциации.
- После завершения программы процедите клетки через клеточный сетчатый фильтр размером 70 мкм.
- Промойте клеточный фильтр 20 мл DMEM.
- Центрифугируют диссоциированные клетки в дозе 300 x g в течение 7 мин.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в DPBS.
- Посчитайте клетки и разбавьте до необходимой концентрации.
- Настройте стереотаксическую рамку в соответствии с инструкциями производителя и подготовьте грелку для мышей. Продезинфицируйте все помещения 70% этанолом.
- Обезболивают животное в индукционной камере с 2-5% изофлураном и кислородом. После анестезии переведите животное в носовой конус для поддержания анестезии на уровне 1,5-2,5% изофлурана с непрерывной подачей кислорода. Подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Обеспечьте тепловую поддержку животному на протяжении всей процедуры, пока животное не выздоровеет.
- Подготовьте операционную область, сбрив шерсть на голове мыши, чтобы обнажить кожу головы.
- Обеспечьте мышь соответствующим анальгетиком, таким как одна доза 1 мг / кг бупренорфина с замедленным высвобождением (SR), вводимая путем подкожной инъекции.
- Переведите мышь в стереотаксическую рамку. Убедитесь, что мышь кусает блок укусов. Используйте ушные планки, чтобы надежно закрепить головку мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь надежно закреплена, если голова не двигается при мягком нажатии щипцами. - Продезинфицируйте бритый участок тремя чередующимися скрабами из повидон-йода и 70% этанола.
- Сделайте продольный разрез 5-7 мм на волосистой части головы, чтобы обнажить череп и втянуть кожу головы.
- Соскребите надкостницу тупым хирургическим инструментом, таким как щипцы.
- Найдите брегму на черепе.
- Поместите иглу стереотаксической рамки поверх брегмы и сбросьте координаты до 0 или запишите координату на руке.
- Переместите руку на 1 мм назад (каудально) и на 1 мм сбоку, справа от средней линии.
- Отметьте это место перманентным маркером. Если на руке есть прорезь для шприца, прикрепите маркер к прорези шприца, чтобы отметить это место.
- Просверлите небольшое отверстие в черепе в этом месте. Не прикладывайте слишком большое давление, чтобы предотвратить сверление мозга.
- Загрузите шприц Гамильтона весом 5 мкл 26 г с 5-10 x 104 клетками объемом 1-2 мкл и прикрепите к стереотаксической руке.
- Медленно введите иглу шприца Гамильтона на 2 мм в мозг.
- Начинают вводить клетки с желаемой скоростью, обычно 0,2-0,5 мкл / мин.
- После того, как инъекция будет завершена, медленно вытяните иглу из мозга.
- Заполните отверстие для жернова костным воском.
- Закройте разрез хирургическими швами или хирургическим клеем.
- Перенесите мышь обратно в клетку и следите за ее восстановлением после наркоза.
- Регулярно контролируйте состояние животных и усыпляйте их, когда в утвержденном протоколе будут достигнуты гуманные критерии конечной точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешный рост опухоли в головном мозге приводит к ухудшению состояния животного, что часто проявляется наклоном головы, грубой шерстью, сгорбленным телом, прищуренными глазами, сниженной активностью и низким показателем состояния тела (BCS < 2). - Проводят вскрытие усыпленных животных с последующим гистологическим анализом для подтверждения наличия опухолей в головном мозге. Запишите время, прошедшее от имплантации до эвтаназии.
- Имплантация моделей PDX путем внутрисердечной инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель может быть использована для изучения тропизма органов после того, как опухолевые клетки находятся в кровообращении. В этом разделе также используется набор для диссоциации опухоли, который требует оптимизации по типу ткани.- Выполните шаги 2.2.1-2.2.13.
- Обезболивают животное в индукционной камере с 2-5% изофлураном и кислородом. После анестезии переведите животное в носовой конус для поддержания анестезии на уровне 1,5-2,5% изофлурана с непрерывной подачей кислорода. Подтвердите глубину анестезии с помощью отсутствия педального рефлекса. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Обеспечьте тепловую поддержку животному на протяжении всей процедуры, пока животное не выздоровеет.
- Затем поместите мышь в положение лежа на спине.
- Чтобы подготовить операционную область на груди, сбрейте мех и продезинфицируйте его тремя чередующимися скрабами из повидона-йода и 70% этанола.
- Наберите 0,5-10 х 105 клеток в шприц на игле 28 г, объемом до 100 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое количество ячеек варьируется в зависимости от агрессивности модели, и оптимальное количество ячеек должно быть эмпирически определено для каждой модели. - Найдите место инъекции (немного левее грудины мыши и на полпути между стернальной выемкой и ксифоидным отростком).
- Введите иглу вертикально в мышь в месте инъекции.
- Наблюдайте за успешным поступлением в левый желудочек через обратный ток крови, поступающей в шприц. Медленно дозируйте клетки в левый желудочек, не перемещая иглу.
- Медленно вытащите иглу вертикально из мыши.
- Наложите кусок стерильной марли на место инъекции и надавливайте примерно на 1 минуту, пока кровотечение не остановится, сохраняя при этом движение грудной клетки для дыхания.
- Извлеките мышь из наркоза и дайте ей восстановиться на гретой подушечке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешный рост опухоли приводит к ухудшению состояния животного, что часто проявляется взъерошенным волосяным покровом, сгорбленным телом, прищуренными глазами, сниженной активностью и низким показателем состояния тела (BCS < 2). - Регулярно контролируйте состояние животных и усыпляйте их, когда в утвержденном протоколе будут достигнуты гуманные критерии конечной точки.
- Проводят вскрытие для выявления метастазов на усыпленных животных с последующим гистологическим анализом для подтверждения наличия опухолей в органе-мишени. Запишите время, которое проходит от внутрисердечной инъекции до эвтаназии.
Representative Results
Опухоли PDX, размножаемые с боковой стороны, легче всего имплантировать, контролировать и резецировать, и, как правило, рекомендуются для первоначального установления и распространения опухолей PDX (рис. 1). При создании или распространении опухолей PDX целесообразно имплантировать опухоли нескольким животным, так как скорость захвата опухоли может варьироваться, и не каждый кусочек опухоли всегда будет захватывать мышей. Разработаны методы установления и распространения PDX метастазов в ЦНС непосредственно в головном мозге13. Тем не менее, эти методы по-прежнему более сложны с более низкими показателями взятия, и опухоли значительно труднее размножать и контролировать, чем боковую имплантацию.
Если опухоли пациента недоступны, опухоли PDX метастазирования в ЦНС также могут быть получены из различных источников, включая хранилища академических лабораторий или коммерческих компаний. После приобретения опухолей первоочередной задачей будет размножение и криоконсервация как можно большего количества материала, что обеспечит сохранение большого количества опухолей с низким пассажем. Это обеспечивает наличие достаточного материала для неопределенного числа последующих исследований с моделями PDX. Подобно иммортализированным клеточным линиям, опухоли PDX должны быть криоконсервированы и использоваться при низком количестве пассажа, поскольку генетический дрейф приводит к изменениям фенотипа и генотипа PDX с течением времени12,14,15. Независимо от источника опухолей PDX, важно проводить частый скрининг PDX и мышиных колоний как на патогены человека, так и на мыши, такие как ВИЧ и гепатит для людей и Corynebacterium bovis для мышей. Это ограничит распространение нежелательных патогенов из PDX как на человека, работающего с ними, так и на других мышей в исследовании и виварии.
Описанные здесь методы имплантации могут быть использованы для изучения биологии опухоли, оценки нескольких аспектов метастатического каскада и для доклинических исследований. Основным преимуществом боковой имплантации является простота мониторинга опухоли с течением времени, так как опухоли видны, а их рост можно легко измерить с помощью штангенциркуля. Этот метод может быть хорошей отправной точкой для установления осуществимости лекарственной мишени. Внутричерепная имплантация предпочтительна, если наличие микроокружения мозга важно и может изменить рост или молекулярный профиль опухоли. Кроме того, внутричерепная имплантация помещает опухоль за гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что делает ее необходимой для доклинических исследований, изучающих эффективность лекарств, необходимых для прохождения ГЭБ. Тем не менее, трудно контролировать рост опухолей PDX и требует рентгенологической визуализации или биолюминесцентной визуализации, если клетки помечены. Знание того, когда начинать медикаментозное лечение доклинически, потребует либо данных визуализации для мониторинга роста, либо знания средней выживаемости мышей, несущих конкретную опухоль PDX. Кроме того, внутричерепная имплантация обходит все основные этапы метастатического каскада, что делает ее пригодной только для изучения эффективности лекарств и микроокружения опухоли в головном мозге. Несмотря на различия в микроокружении опухоли, морфология опухолей PDX одинакова независимо от места имплантации, что можно увидеть в этой опухоли PDX (CM04), полученной из метастазов в головной мозг, возникших из первичной опухоли мелкоклеточного рака легкого (рис. 2). Морфология мелкоклеточного рака легкого опухолевых клеток с мелкими ядрами и скудной цитоплазмой может наблюдаться при опухоли в боку, внутричерепной опухоли и метастазировании в брюшную полость, возникающей в результате внутрисердечной инъекции. Кроме того, ранее наблюдались спонтанные метастазы из опухолей, имплантированных в бок12, что позволяет предположить, что метастатические процессы, такие как интравазация, экстравазация и колонизация, могут быть повторены и изучены в опухолях бока, которые в противном случае были бы невозможны при ортотопических опухолях в головном мозге. В целом, замечено, что боковая имплантация является подходящим методом для изучения биологии метастазов в ЦНС и проведения доклинических исследований.
Внутрисердечная инъекция чаще всего используется для изучения органного тропизма и метастатического потенциала опухолей. Инъецированные опухолевые клетки должны будут пройти несколько этапов метастатического каскада, включая выживание в кровообращении, экстравазацию и колонизацию метастатического участка. Как и при ортотопической инъекции в мозг, может быть трудно отследить прогресс метастазирования опухоли без радиологической визуализации или маркировки клеток. Однако, как и в случае с ортотопической имплантацией, успешная инокуляция приводит к ухудшению состояния животных с течением времени по мере распространения опухоли. На рисунке 3A показано метастазирование в мозг после внутрисердечной инъекции в модель метастазирования в ЦНС PDX, M2, которая возникла из меланомы. Внутрисердечная инъекция опухоли PDX (CM04) привела к метастазированию в брюшную полость и печень (рис. 3B). Другие оцениваемые органы, такие как легкие, почки и яичники, не имели видимых метастазов.
Рисунок 1: Блок-схема, показывающая общий рабочий процесс создания, распространения и использования PDX для доклинических исследований. Для каждого метода инокуляции под каждым методом перечислены этапы вовлеченного метастатического каскада. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гистология опухолей PDX после различных методов инокуляции. Окрашивание гематоксилином и эозином (H & E) метастазирующей опухоли PDX в ЦНС, возникшей из мелкоклеточного рака легкого (CM04), имплантированного мышам с ослабленным иммунитетом тремя методами, имеет сходные патогистологические и морфологические особенности мелкоклеточного рака легкого с небольшими ядрами и скудной цитоплазмой. Панель внутрисердечных инъекций показывает метастазы в брюшную полость. Гнезда клеток небольшого размера и высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение очевидны на всех трех изображениях. Изображения были сделаны на слайд-сканере и увеличены до 10 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Метастазы, наблюдаемые после внутрисердечной инъекции. H&E окрашивание тканей с видимыми метастазами во время оценки методом вскрытия после внутрисердечной инъекции (A) M2 и (B) CM04. Изображения были сделаны (A) на слайд-сканере и увеличены до 1x (слева) или 20x (справа) или (B) на обычном микроскопе при 10-кратном увеличении. Эта цифра была изменена по сравнению с нашей предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
В настоящей рукописи подробно описаны методы создания и распространения PDX. Также были продемонстрированы три различных метода инокуляции, которые могут быть использованы для организации доклинических исследований при оценке метастазов в ЦНС. Способ выбора должен зависеть от целей эксперимента. В некоторых случаях было бы полезно использовать более одного пути прививки. Например, подкожная боковая имплантация обеспечивает простой подход к изучению эффективности лекарственного средства на рост опухоли и оценке лекарственного средства на его мишени, а также обеспечивает визуальный размер опухоли, который легко контролировать и измерять. Однако, как только будет установлена осуществимость мишени и противоопухолевые свойства роста, можно организовать ортотопическое исследование для оценки эффективности биологического препарата для пересечения ГЭБ и изучения его влияния в микроокружении опухоли головного мозга. Кроме того, выживаемость лучше оценивается в ортотопических и внутрисердечных инъекционных исследованиях.
Внутричерепная инъекция моделей PDX метастазов в головной мозг часто является доклинической моделью выбора из-за наличия микроокружения мозга и ГЭБ. Однако исследования показали, что метастазы в головной мозг обладают способностью модифицировать ГЭБ, что влияет на проницаемость молекул к опухоли16. Эти изменения в ГЭБ не будут отражаться внутричерепно-имплантированными опухолями, и из-за этого доклинические исследования лекарств могут не полностью отражать реакцию опухолей пациентов. Даже с этой оговоркой внутричерепная инъекция остается лучшим методом проверки проницаемости и эффективности лекарств для пересечения ГЭБ в доклинических моделях. Еще одна проблема с внутричерепными моделями заключается в том, что они сложны для мониторинга роста опухоли и требуют использования методов визуализации. Вирусная трансдукция PDX с флуоресцентными или биолюминесцентными маркерами традиционно используется, но может быть сложной для выполнения. Тем не менее, несколько методов визуализации разрабатываются для использования на мышах, которые не требуют введения маркеров, что может облегчить мониторинг этих ортотопических опухолей головного мозга для доклинических исследований. К ним относятся такие технологии визуализации, как магнитно-резонансная томография (МРТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), а также микрокомпьютерная томография (микро-КТ). Наконец, внутричерепная инъекция может неточно отражать микроокружение метастазов ЦНС вне мозга, например, при лептоменингеальных метастазах. В этом случае инъекция в большой цистерну может быть выполнена для более точного представления лептоменингеальных метастазов17.
Характеристика как фенотипических, так и молекулярных особенностей модели PDX важна для выбора лучших моделей для доклинических исследований. Латентность опухоли может варьироваться от 7 до 140 дней, а частота приема также может сильно варьироваться12. Оптимальное количество животных для имплантации и сроки начала лечения должны основываться на характеристиках каждой модели PDX и должны быть определены эмпирически. Кроме того, молекулярный профиль опухолей PDX также важен для выбора наиболее репрезентативных моделей PDX для доклинических исследований. Чем ближе модель молекулярно представляет донорскую ткань, тем более прогностической она может быть клинического ответа. Кроме того, крайне важно обеспечить, чтобы мишени, выбранные на основе данных о человеке, присутствовали в PDX, выбранных для исследований, и поддерживались в течение нескольких поколений, поскольку показано, что клональная сукцессия связана с другим геномным профилем действующего доминантного клона. В свете этого фенотипические и молекулярные профили опухолей PDX метастазов в ЦНС были широко охарактеризованы на протяжении нескольких поколений12.
Несмотря на множество преимуществ использования моделей PDX метастазов в ЦНС, существует ряд ограничений, связанных с их использованием. Во-первых, альтернативное микроокружение опухоли и особенно отсутствие иммунной системы являются хорошо задокументированными ограничениями моделей PDX18. Ксенотрансплантат опухоли человека мышам приводит к замене стромы человека стромой мыши с каждым последующим прохождением, и строма человека, как правило, полностью заменяется после нескольких проходов19. Тем не менее, различия в микроокружении опухоли не приводят к большим различиям в молекулярном профиле опухолей PDX, имплантированных с фланга, по сравнению с исходной опухольюпациента 12, что позволяет предположить, что фланговые модели по-прежнему представляют собой хорошие экспериментальные модели для изучения метастазов в ЦНС. Во-вторых, использование животных с ослабленным иммунитетом приводит к отсутствию инфильтрации иммунных клеток в опухоли и общему иммунному ответу хозяина, что ограничивает фундаментальный способ, которым хозяин пытается бороться с ростом рака12. В то время как гуманизированные мыши, привитые иммунными клетками человека, доступны для изучения взаимодействия специфических иммунных клеток с опухолью, все еще остается много вопросов и противоречий о подходах, методах и интерпретации этих результатов20.
В то время как было показано, что большинство PDX генетически стабильны, мы и другие показали, что в редких случаях, даже при отсутствии лечения или другого внешнего селективного давления, могут быть изменения в клонах опухолей, такие как незначительный захват клонов12,14,15. Это может привести к резким изменениям в молекулярном профиле, что в конечном итоге приведет к тому, что опухоль не будет отражать доминантные клоны в опухолипациента 12. В то время как PDX, демонстрирующие клональную сукцессию, могут использоваться в доклинических исследованиях, многие гены, предназначенные для нацеливания (например, Her2), могут быть потеряны при клональной сукцессии. Поэтому рекомендуется частый скрининг моделей PDX, чтобы определить, сохраняют ли они молекулярный профиль желаемого клона.
Таким образом, модели PDX представляют собой отличную модельную систему для изучения не только метастазов в ЦНС, но и других типов опухолей. Разработка этих моделей показала, что они в значительной степени отражают фенотипический, молекулярный профиль и гетерогенность метастазов в ЦНС человека 8,9,10,12. Они служат эффективными моделями для изучения биологии метастазов в ЦНС, а также физиологически значимыми доклиническими моделями, заменяя чрезмерно используемые модели клеточных линий, исторически использовавшиеся для исследований метастазов в ЦНС in vivo. Несомненно, существуют различия между PDX и опухолью донорского пациента 12,18. Знание этих различий важно для правильного планирования и проведения доклинических исследований. Наконец, выбирая между несколькими путями прививки, модели PDX универсальны в своем использовании, позволяя изучать различные аспекты заболевания. Модели PDX, несомненно, будут играть важную роль в продвижении нашего понимания метастазов в ЦНС и разработке новых методов лечения.
Disclosures
Авторы не раскрывают информацию.
Acknowledgments
Рисунок 3A был взят из нашей предыдущей публикации12 и был создан в лаборатории доктора Дженна Саркариа в клинике Майо.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
