Summary
Metastase van het centrale zenuwstelsel PDX-modellen vertegenwoordigen de fenotypische en moleculaire kenmerken van menselijke metastase, waardoor ze uitstekende modellen zijn voor preklinische studies. Hier wordt beschreven hoe PDX-modellen en de inentingsroutes kunnen worden vastgesteld die het beste kunnen worden gebruikt voor preklinische studies.
Abstract
De ontwikkeling van nieuwe therapieën voor metastasen van het centrale zenuwstelsel (CZS) is belemmerd door het ontbreken van preklinische modellen die de ziekte nauwkeurig weergeven. Patiënt afgeleide xenograft (PDX) modellen van CZS metastase hebben aangetoond dat ze de fenotypische en moleculaire kenmerken van de menselijke ziekte beter weergeven, evenals een betere weerspiegeling van de heterogeniteit en klonale dynamiek van menselijke patiënttumoren in vergelijking met historische cellijnmodellen. Er zijn meerdere locaties die kunnen worden gebruikt om van de patiënt afgeleid weefsel te implanteren bij het opzetten van preklinische onderzoeken, elk met hun eigen voor- en nadelen, en elk geschikt voor het bestuderen van verschillende aspecten van de metastatische cascade. Hier beschrijft het protocol hoe PDX-modellen kunnen worden vastgesteld en drie verschillende benaderingen kunnen worden gepresenteerd voor het gebruik van PDX-modellen met CZS-metastase in preklinische studies, waarbij elk van hun toepassingen en beperkingen wordt besproken. Deze omvatten flankimplantatie, orthotopische injectie in de hersenen en intracardiale injectie. Subcutane flankimplantatie is het gemakkelijkst te controleren en daarom het handigst voor preklinische studies. Bovendien werden metastasen naar de hersenen en andere weefsels van flankimplantatie waargenomen, wat aangeeft dat de tumor meerdere stappen van metastase heeft ondergaan, waaronder intravasatie, extravasatie en kolonisatie. Orthotopische injectie in de hersenen is de beste optie voor het samenvatten van de micro-omgeving van de hersentumor en is nuttig voor het bepalen van de werkzaamheid van biologische geneesmiddelen om de bloed-hersenbarrière (BBB) te passeren, maar omzeilt de meeste stappen van de metastatische cascade. Intracardiale injectie vergemakkelijkt metastase naar de hersenen en is ook nuttig voor het bestuderen van orgaantropisme. Hoewel deze methode eerdere stappen van de metastatische cascade achterwege laat, zullen deze cellen nog steeds de circulatie moeten overleven, extravaseren en koloniseren. Het nut van een PDX-model wordt daarom beïnvloed door de route van tumorinenting en de keuze welke te gebruiken moet worden bepaald door de wetenschappelijke vraag en algemene doelen van het experiment.
Introduction
De incidentie van metastase naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is de afgelopen jaren toegenomen 1,2,3. Traditionele therapieën voor CZS-metastase, zoals tumorresectie, radiotherapie van de hele hersenen en stereotactische radiochirurgie, zijn grotendeels palliatief en zelden curatief geweest en kunnen leiden tot slopende bijwerkingen, zoals cognitieve achteruitgang1. Onlangs zijn er veel nieuwe gerichte en immunologische therapieën ontwikkeld voor de behandeling van CZS-metastase die veelbelovend zijn in effectievere behandelingen, terwijl ze minder bijwerkingen hebben4.
Het vertalen van preklinische resultaten naar betekenisvolle klinische eindpunten vereist vaak effectieve en voorspellende modelleringsstrategieën. Historisch gezien waren cellijn xenograftmodellen de standaard voor preklinisch onderzoek in CZS-metastaseonderzoek. Deze cellijnmodellen weerspiegelen echter niet het ware tumorgedrag van de gastheertumor of vertegenwoordigen de histologische of moleculaire heterogeniteit van de ziekte. Bovendien zijn cellijnmodellen in staat zich aan te passen aan in vitro groeiomstandigheden en verliezen daardoor de oorspronkelijke eigenschappen van de gastheertumor. Patiënt-afgeleide xenografts (PDX's), die de tumor van een patiënt enten in een immunodeficiënte of gehumaniseerde muis, worden steeds vaker gebruikt in translationeel kankeronderzoek. Onderzoekers hebben aangetoond dat PDX-modellen meestal getrouw tumorgroei, histologische kenmerken kunnen samenvatten, tumorheterogeniteit, metastatisch potentieel en moleculaire genetische kenmerken kunnen behouden. Bovendien zijn PDX-modellen prognostisch waarbij de latentieperiode van de PDX-tumor correleert met de algehele overleving van de patiënt en er is ook aangetoond dat ze de therapeutische respons nauwkeurig voorspellen in patiëntenonderzoeken 5,6.
Er is een opkomst van CNS-metastase PDX's. Meestal zijn deze ontwikkeld die tumoren vertegenwoordigen die afkomstig zijn van een enkele oorsprong, zoals niet-kleincellige longkanker (NSCLC)7, borstkanker8,9 en melanoom10,11. Meer recent is een grote en diverse verzameling PDX-modellen ontwikkeld en gekarakteriseerd, die acht verschillende histologische subtypen12 vertegenwoordigen. Het is aangetoond dat PDX-modellen voor CZS-metastase sterk lijken op hun oorspronkelijke patiënttumor, zowel histologisch als moleculair en hebben ook histologische unieke verschillen en overeenkomsten aangetoond10,12. Bovendien, terwijl de meeste PDX-modellen voor CZS-metastase de klonale heterogeniteit van menselijke tumoren behouden, vertoonden sommige bewijs van klonale successie12, waardoor ze ook ideaal waren voor het bestuderen van resistentie tegen therapieën door klonale veranderingen na behandeling te volgen.
De hier beschreven protocollen beschrijven methoden voor PDX-vestiging en verschillende inentingsroutes die worden gebruikt in preklinische onderzoeken naar CZS-metastase (figuur 1). Deze implantatiemethoden variëren in hun vermogen om groei en metastase na te bootsen. Hier belicht het protocol de toepassingen voor elke route van implantatie en laat het zien hoe ze kunnen worden gebruikt voor de studie van CZS-metastase.
Protocol
Hieronder volgt een reeks stapsgewijze protocollen die worden gebruikt voor zowel het vaststellen van PDX-modellen door subcutane flankimplantatie als voor het opzetten van preklinische studies die het testen van behandelingen mogelijk maken, wat kan helpen bij het beoordelen van biologische veranderingen en verschillende stappen van de metastatische cascade. Alle studies en modellen gebruikten 3-8 weken oude vrouwelijke NOG-muizen. Alle weefselmonsters werden verzameld met geïnformeerde toestemming in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Review Board (IRB). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met een door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurd protocol.
1. Vaststelling en vermeerdering van PDX-modellen door flankimplantatie
- Vaststelling van PDX-modellen
- Na chirurgische resectie van de tumor van de patiënt in de operatiekamer, bewaar de verse tumorweefsels in een geschikte oplossing (zoals DMEM) en plaats deze onmiddellijk op ijs. Gebruik een teveel aan opslagoplossing (>10 ml) om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt ondergedompeld.
- Breng weefsel over in de weefselkweekschaal en spoel af met 5 ml DPBS.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische technieken. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen door het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) ter bescherming tegen mogelijke infectieuze agentia voor de mens. - Verwijder necrotische gebieden uit de tumor.
OPMERKING: Dit kan worden herkend als een wit papperig gebied in de richting van het midden van het weefsel. - Snijd het resterende weefsel in stukjes van ongeveer 2 x 2 x 2 mm.
- Breng de weefsels over in een microcentrifugebuis met de groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix en bewaar ze op ijs. Zorg ervoor dat er voldoende keldermembraanmatrix (>200 μL) wordt gebruikt om elk weefselstuk volledig onder te dompelen.
- Cryopreserveer de resterende weefsels die niet zullen worden geïmplanteerd volgens het protocol beschreven in stap 1.3.
- Verdoof het dier in een inductiekamer met 2-5% isofluraan en zuurstof. Eenmaal verdoofd, breng het dier over naar een neuskegel om de anesthesie te behouden op 1,5-2,5% isofluraan met een continue zuurstoftoevoer. Bevestig de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex. Breng de veterinaire oogheelkundige zalf aan om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Zorg voor thermische ondersteuning voor het dier gedurende de hele procedure totdat het dier herstelt.
- Identificeer de implantatieplaats op de muis.
OPMERKING: Dit moet op de rechter- of linkerflank van de muis zijn, over het algemeen zijdelings gemarkeerd aan de zijkant van het abdominale gebied, caudaal aan de ribbenkast. - Om het operatiegebied voor te bereiden, scheer je de vacht en desinfecteer je met drie afwisselende scrubs van povidonjodium en 70% ethanol.
- Til met een tang de huid van de muis op en maak een incisie van 0,5-1 cm op de huid.
- Steek een chirurgische schaar langzaam onder de huid op de incisieplaats om een zak (0,5-1 cm diep) in de onderhuidse ruimte te creëren.
- Plaats voorzichtig een tumorstuk in de zak en duw het naar de onderkant van de zak om te voorkomen dat de tumor eruit glijdt.
- Sluit de incisie met behulp van 4-0 nylon chirurgische hechtingen.
OPMERKING: Andere wondsluitingsmethoden zoals niet-absorbeerbare of absorbeerbare hechtingen en wondclips kunnen ook worden gebruikt. - Breng de muis terug naar de kooi en controleer het herstel van het dier van anesthesie, totdat het ambulant is.
OPMERKING: Analgetica zijn niet vereist, maar kunnen worden toegediend als pijn wordt waargenomen bij de muizen. - Controleer de tumorgroei wekelijks. Per muis wordt één tumor verwacht.
OPMERKING: Het volume van de tumor bij transplantatie lijkt in eerste instantie af te nemen, maar dit is geen reden tot bezorgdheid. Een tumor wordt geacht te zijn ingenomen zodra deze voelbaar wordt en een logaritmische groeifase ingaat. Deze eerste passage vertegenwoordigt de F0-generatie. - Zodra de tumoren beginnen te groeien, meet u de tumoren drie keer per week. Meet de lengte en breedte van de tumoren met een remklauw. Om het volume van de tumor te berekenen, gebruikt u de formule: lengte x breedte x breedte / 2.
- Euthanaseer de muizen geïmplanteerd met PDX-tumoren wanneer de tumoren groter zijn dan 15 mm in diameter met behulp van de langste kant van de tumor. Voer de euthanasie uit door CO 2-inhalatie in een CO2-inductiekamer, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode.
- Reseceer de tumor vanaf de flank van het dier door een incisie te maken. Ontleed de weggesneden tumor voorzichtig met een stompe schaar en tang. Om dit te doen, snijdt u eerst de huid bovenop de tumor af en snijdt u vervolgens de tumor weg van de spierlaag eronder.
- Breng het tumorweefsel over naar >10 ml van een geschikte opslagoplossing (zoals DMEM). Plaats het onmiddellijk op ijs. Deze tumor kan worden gecryopreserveerd of doorgegeven aan een andere set muizen. Beschouw deze passage als F1.
OPMERKING: Het opnieuw passeren zou de tumorpassage F2 enzovoort opleveren.
- Propagatie van PDX-modellen
- Begin met de gereseceerde tumor die in een opslagoplossing wordt bewaard vanaf stap 1.1.19.
- Breng het weefsel over in een weefselkweekschaal en spoel af met 5 ml DPBS.
- Verwijder de necrotische gebieden uit de tumor.
- Snijd het weefsel in stukjes van ongeveer 2 x 2 x 2 mm.
- Breng de weefsels over in een microcentrifugebuis met groeifactor gereduceerde keldermembraanmatrix (>200 μL) en bewaar op ijs.
- Cryopreserveer het resterende weefsel dat niet wordt gebruikt voor voortplanting volgens het protocol beschreven in stap 1.3.
- Verdoof het dier in een inductiekamer met 2-5% isofluraan en zuurstof. Eenmaal verdoofd, breng het dier over naar een neuskegel om de anesthesie te behouden op 1,5-2,5% isofluraan met een continue zuurstoftoevoer. Bevestig de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex. Breng de veterinaire oogheelkundige zalf aan om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Zorg voor thermische ondersteuning voor het dier gedurende de hele procedure totdat het dier herstelt.
- Identificeer de implantatieplaats op de muis.
OPMERKING: Dit moet op de rechter- of linkerflank van de muis zijn, meestal in de buikstreek, caudaal tot aan de ribbenkast. - Om het operatiegebied voor te bereiden, scheer je de vacht en desinfecteer je met drie afwisselende scrubs van povidonjodium en 70% ethanol.
- Maak een incisie van 0,5-1 cm op één flank van de muis.
- Steek een chirurgische schaar langzaam onder de huid bij de incisie om een zak (0,5-1 cm diep) in de onderhuidse ruimte te creëren.
- Plaats voorzichtig een tumorstuk in de zak en duw het naar de onderkant van de zak om te voorkomen dat de tumor uitglijdt.
- Sluit de incisie met behulp van 4-0 nylon chirurgische hechtingen of andere wondsluitingsmethoden.
- Breng de muis terug naar de kooi en controleer het herstel van de anesthesie, totdat deze ambulant is.
OPMERKING: Analgetica zijn niet vereist, maar kunnen worden toegediend als pijn wordt waargenomen bij de muizen. - Tijdens latentie (niet-groeifase), controleer de tumorgroei wekelijks. Per muis wordt één tumor verwacht.
OPMERKING: Het volume van de tumor bij transplantatie lijkt in eerste instantie af te nemen, maar dit is geen reden tot bezorgdheid. Een tumor wordt beschouwd als genomen zodra deze voelbaar wordt en voortdurend begint te groeien. - Zodra de tumoren beginnen te groeien, meet u de tumoren drie keer per week. Meet de lengte en breedte van de tumoren met een remklauw. Bereken het volume van de tumor met behulp van de formule: lengte x breedte x breedte / 2.
- Euthanaseer de muizen geïmplanteerd met PDX-tumoren wanneer de tumoren groter zijn dan 15 mm in diameter met behulp van de langste kant van de tumor. Voer euthanasie uit door CO2-inademing in een CO2-inductiekamer, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode.
- Reseceer de tumor vanaf de flank van het dier door een incisie te maken en de tumor voorzichtig te ontleden met een stompe schaar en een tang.
- Breng het tumorweefsel over naar >10 ml van een geschikte opslagoplossing (zoals DMEM) en plaats het vervolgens onmiddellijk op ijs.
- Cryopreservatie van PDX-tumoren
- Euthanaseer de muizen geïmplanteerd met PDX-tumoren wanneer de tumoren groter zijn dan 15 mm in diameter met behulp van de langste kant van de tumor. Voer euthanasie uit door CO 2-inhalatie in een CO2-inductiekamer, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode.
- Reseceer de tumor vanaf de flank van het dier door een incisie te maken en de tumor voorzichtig te ontleden met een stompe schaar en een tang.
- Breng het tumorweefsel over naar >10 ml van een geschikte opslagoplossing (zoals DMEM) en plaats het vervolgens onmiddellijk op ijs.
- Breng het weefsel over in een weefselkweekschaal en spoel af met 5 ml DPBS.
- Verwijder necrotische gebieden uit de tumor.
- Snijd het weefsel in stukjes van ongeveer 2 x 2 x 2 mm.
- Breng het weefsel over in cryobuizen met 20% DMEM, 70% FBS en 10% DMSO.
- Breng de cryobuizen over in een cryopreservatiecontainer en plaats ze in een vriezer van -80 °C.
- Wanneer de cryobuizen zijn gekoeld tot -80 °C, breng ze dan over naar opslag van vloeibare stikstof.
2. Inentingsroutes voor preklinisch onderzoek
- Subcutane flankimplantatie.
OPMERKING: Subcutane flankimplantatie kan gemakkelijk worden gebruikt en kan nuttig zijn voor het bestuderen van alle stappen van de gemetastaseerde cascade.- Gebruik groeiende PDX-tumoren of gecryopreserveerde PDX-tumoren voor initiële flankimplantatie.
- Voor het kweken van PDX-tumoren, euthanaseer de muizen met behulp van een IACUC-goedgekeurde methode wanneer de tumoren langer zijn dan 15 mm; reseceer de tumor en breng het tumorweefsel over naar een geschikte opslagoplossing (zoals DMEM) en plaats het onmiddellijk op ijs.
- Voor gecryopreserveerde PDX-tumoren ontdooit u het gecryopreserveerde PDX-weefsel snel door het onder te dompelen in een waterbad van 37 °C.
- Volg de stappen 1.2.2-1.2.19.
- Orthotopische implantatie door intracraniële injectie in de hersenen.
OPMERKING: Dit model kan worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen om de BBB te passeren en om tumorkolonisatie te bestuderen. Deze sectie verwijst voornamelijk naar het gebruik van de tumordissociatiekit (zie Materiaalopgave). Verschillende weefseltypen vereisen verschillende dissociatieprotocollen. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker het protocol test en optimaliseert om de dissociatie-efficiëntie te maximaliseren.- Euthanaseer de muizen geïmplanteerd met PDX-tumoren met behulp van een IACUC-goedgekeurde methode wanneer de tumoren langer zijn dan 15 mm.
- Onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast, de PDX-tumoren chirurgisch reseceren en opslaan in DMEM op ijs.
- Bereid de dissociatieoplossing in de juiste buis door het enzymmengsel toe te voegen aan DMEM zoals aangegeven in het protocol van de fabrikant.
- Was de tumor in 5 ml DPBS in een weefselkweekschaal.
- Verwijder de necrotische gebieden uit de tumor.
- Snijd de tumor in kleine stukjes van 2-4 mm lang.
- Breng de tumorstukjes over in de buis met het enzymmengsel.
- Bevestig de buis aan de weefseldissociator en voer het programma uit dat geschikt is voor het weefseltype. Raadpleeg het protocol van de fabrikant voor het juiste programma dat moet worden uitgevoerd en de benodigde dissociatietijd.
- Na voltooiing van het programma zeeft u de cellen door een 70 μm celzeef.
- Was de celzeef met 20 ml DMEM.
- Centrifugeer de gedissocieerde cellen op 300 x g gedurende 7 minuten.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in DPBS.
- Tel de cellen en verdun tot de vereiste concentratie.
- Stel het stereotaxische frame in volgens de instructies van de fabrikant en bereid een verwarmingspad voor de muizen voor. Ontsmet alle ruimtes met 70% ethanol.
- Verdoof het dier in een inductiekamer met 2-5% isofluraan en zuurstof. Eenmaal verdoofd, breng het dier over naar een neuskegel om de anesthesie te behouden op 1,5-2,5% isofluraan met een continue zuurstoftoevoer. Bevestig de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex. Breng de veterinaire oogheelkundige zalf aan om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Zorg voor thermische ondersteuning voor het dier gedurende de hele procedure totdat het dier herstelt.
- Bereid het chirurgische gebied voor door de vacht op het hoofd van de muis te scheren om de hoofdhuid bloot te leggen.
- Geef de muis de juiste pijnstiller, zoals één dosis van 1 mg/kg Buprenorfine sustained release (SR) toegediend via subcutane injectie.
- Breng de muis over naar het stereotaxische frame. Zorg ervoor dat de muis op het bijtblok bijt. Gebruik de oorbalken om de kop van de muis stevig vast te zetten.
OPMERKING: De muis is goed vastgezet als het hoofd niet beweegt wanneer het zachtjes wordt ingedrukt met een tang. - Desinfecteer het geschoren gebied met drie afwisselende scrubs van povidon-jodium en 70% ethanol.
- Maak een 5-7 mm longitudinale incisie op de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen en de hoofdhuid in te trekken.
- Schraap het botvlies eraf met een stomp chirurgisch instrument zoals een tang.
- Lokaliseer de bregma op de schedel.
- Plaats de naald van het stereotactische frame bovenop de bregma en zet de coördinaten op 0 of noteer de coördinaat op de arm.
- Beweeg de arm 1 mm naar achteren (caudaal) en 1 mm lateraal, rechts van de middellijn.
- Markeer deze locatie met een permanente markering. Als de arm een sleuf voor de spuit bevat, bevestigt u een marker aan de spuitsleuf om de locatie te markeren.
- Boor op deze plek een klein braamgat in de schedel. Oefen niet te veel druk uit om te voorkomen dat u zich in de hersenen boort.
- Laad een Hamilton-spuit van 5 μl van 26 g met 5-10 x 104 cellen, in een volume van 1-2 μl, en bevestig deze aan de stereotaxische arm.
- Steek de Hamilton spuitnaald langzaam 2 mm in de hersenen.
- Begin met het injecteren van cellen met de gewenste snelheid, meestal 0,2-0,5 μl / min.
- Nadat de injectie is voltooid, trekt u de naald langzaam uit de hersenen terug.
- Vul het braamgat met botwas.
- Sluit de incisie met chirurgische hechtingen of chirurgische lijm.
- Breng de muis terug naar de kooi en controleer het herstel van de anesthesie.
- Controleer de toestand van de dieren regelmatig en euthanaseer ze wanneer de humane eindpuntcriteria in het goedgekeurde protocol zijn bereikt.
OPMERKING: Succesvolle tumorgroei in de hersenen resulteert in een verslechterende toestand van het dier, die zich vaak manifesteert met hoofdkanteling, ruwe haarvacht, gebogen lichaam, dichtgeknepen ogen, verminderde activiteit en lage lichaamsconditiescore (BCS < 2). - Voer een obductie uit op de geëuthanaseerde dieren, gevolgd door histologische analyse om de aanwezigheid van tumoren in de hersenen te bevestigen. Noteer de tijd die nodig is tussen implantatie en euthanasie.
- Implantatie van PDX-modellen door intracardiale injectie
OPMERKING: Dit model kan worden gebruikt om orgaantropisme te bestuderen zodra tumorcellen in omloop zijn. Deze sectie maakt ook gebruik van de Tumor Dissociation Kit en vereist optimalisatie per weefseltype.- Volg de stappen 2.2.1-2.2.13.
- Verdoof het dier in een inductiekamer met 2-5% isofluraan en zuurstof. Eenmaal verdoofd, breng het dier over naar een neuskegel om de anesthesie te behouden op 1,5-2,5% isofluraan met een continue zuurstoftoevoer. Bevestig de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex. Breng de veterinaire oogheelkundige zalf aan om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen. Zorg voor thermische ondersteuning voor het dier gedurende de hele procedure totdat het dier herstelt.
- Plaats vervolgens de muis in rugligging.
- Om het chirurgische gebied op de borst voor te bereiden, scheer je de vacht en desinfecteer je deze met drie afwisselende scrubs van povidon-jodium en 70% ethanol.
- Trek 0,5-10 x 105 cellen in een spuit op een naald van 28 G, tot een volume van 100 μL.
OPMERKING: Het aantal benodigde cellen varieert afhankelijk van de agressiviteit van het model en het optimale aantal cellen moet empirisch worden bepaald voor elk model. - Lokaliseer de injectieplaats (iets links van het borstbeen van de muis en halverwege tussen de sternale inkeping en het xyfudproces).
- Steek de naald verticaal in de muis op de injectieplaats.
- Observeer de succesvolle binnenkomst in de linker ventrikel via een terugstroom van bloed dat de spuit binnenkomt. Doseer de cellen langzaam in de linker ventrikel zonder de naald te bewegen.
- Trek de naald langzaam verticaal uit de muis.
- Breng een stuk steriel gaas aan op de injectieplaats en oefen gedurende ongeveer 1 minuut druk uit totdat het bloeden stopt, terwijl u nog steeds borstbeweging toestaat voor ademhaling.
- Verwijder de muis uit de anesthesie en laat hem herstellen op een verwarmde pad.
OPMERKING: Succesvolle tumorgroei resulteert in een verslechterende toestand van het dier, die zich vaak manifesteert met gegolfde haarvacht, gebogen lichaam, dichtgeknepen ogen, verminderde activiteit en lage lichaamsconditiescore (BCS < 2). - Controleer de toestand van de dieren regelmatig en euthanaseer ze wanneer de humane eindpuntcriteria in het goedgekeurde protocol zijn bereikt.
- Voer een obductie uit om metastasen op de geëuthanaseerde dieren te identificeren, gevolgd door histologische analyse om de aanwezigheid van tumoren in het doelorgaan te bevestigen. Noteer de tijd die nodig is van intracardiale injectie tot euthanasie.
Representative Results
Flank-gepropageerde PDX-tumoren zijn het gemakkelijkst te implanteren, te controleren en te reseceren, en worden over het algemeen aanbevolen voor de initiële vaststelling en verspreiding van PDX-tumoren (figuur 1). Bij het vaststellen of verspreiden van PDX-tumoren is het verstandig om tumoren bij meerdere dieren te implanteren, omdat de tumoropnamesnelheid kan variëren en niet elk stukje tumor altijd muizen zal opnemen. Er zijn methoden ontwikkeld voor de oprichting en verspreiding van CZS-metastase PDX's direct in de hersenen13. Deze methoden zijn echter nog steeds uitdagender met lagere opnamesnelheden en de tumoren zijn aanzienlijk moeilijker te verspreiden en te controleren dan flankimplantatie.
Als patiënttumoren niet direct beschikbaar zijn, kunnen PDX-tumoren met CZS-metastase ook worden verkregen uit verschillende bronnen, waaronder opslagplaatsen van academische laboratoria of commerciële bedrijven. Na het verwerven van de tumoren zou de eerste prioriteit zijn om zoveel mogelijk materiaal te verspreiden en te cryopreserveren, zodat een groot aantal tumoren met een lage doorgang behouden blijft. Dit zorgt ervoor dat er voldoende materiaal beschikbaar is voor een onbeperkt aantal vervolgstudies met de PDX-modellen. Net als vereeuwigde cellijnen moeten PDX-tumoren worden gecryopreserveerd en gebruikt bij lage passagenummers, omdat genetische drifting resulteert in veranderingen in het fenotype en genotype van de PDX's in de loop van de tijd12,14,15. Ongeacht de bron van PDX-tumoren, is het belangrijk om frequente screening van PDX- en muizenkolonies uit te voeren op zowel menselijke als muispathogenen, zoals HIV en hepatitis voor mensen en Corynebacterium bovis voor muizen. Dit beperkt de verspreiding van ongewenste pathogenen van de PDX naar zowel het individu dat ermee omgaat als andere muizen in het onderzoek en vivarium.
De hier beschreven implantatiemethoden kunnen worden gebruikt om tumorbiologie te bestuderen, meerdere aspecten van de gemetastaseerde cascade te evalueren en voor preklinische studies. Het belangrijkste voordeel van flankimplantatie is het gemak van tumormonitoring in de loop van de tijd, omdat tumoren zichtbaar zijn en de groei ervan gemakkelijk kan worden gemeten met behulp van een remklauw. Deze methode kan een goede plek zijn om te beginnen voor het vaststellen van de haalbaarheid van een medicijndoel. Intracraniale implantatie heeft de voorkeur als de aanwezigheid van de micro-omgeving van de hersenen belangrijk is en de groei of het moleculaire profiel van de tumor kan veranderen. Bovendien plaatst intracraniale implantatie de tumor achter de bloed-hersenbarrière (BBB), waardoor het essentieel is voor preklinische studies die de werkzaamheid onderzoeken van geneesmiddelen die nodig zijn om de BBB te doorkruisen. Het is echter moeilijk om de groei van PDX-tumoren te volgen en vereist radiologische beeldvorming of bioluminescente beeldvorming als de cellen zijn gelabeld. Weten wanneer de medicamenteuze behandeling preklinisch moet worden gestart, zou beeldvormingsgegevens vereisen om de groei te volgen of kennis van de gemiddelde overleving van muizen met een bepaalde PDX-tumor. Bovendien omzeilt intracraniale implantatie alle essentiële stappen van de gemetastaseerde cascade, waardoor het alleen geschikt is voor het bestuderen van de werkzaamheid van geneesmiddelen en de micro-omgeving van tumoren in de hersenen. Ondanks de verschillen in de micro-omgeving van de tumor, is de morfologie van PDX-tumoren vergelijkbaar, ongeacht de plaats van implantatie, zoals te zien is in deze PDX-tumor (CM04) afgeleid van een hersenmetastase die afkomstig is van een primaire tumor van kleincellige longkanker (figuur 2). De morfologie van kleincellige longkanker van tumorcellen met kleine kernen en schaars cytoplasma kan worden waargenomen in de flanktumor, intracraniale tumor en abdominale metastase als gevolg van intracardiale injectie. Bovendien zijn spontane metastasen van tumoren geïmplanteerd in de flank eerderwaargenomen 12, wat suggereert dat de metastatische processen zoals intravasatie, extravasatie en kolonisatie kunnen worden samengevat en bestudeerd in flanktumoren die anders niet mogelijk zouden zijn met orthotopische tumoren in de hersenen. In het algemeen wordt waargenomen dat flankimplantatie een geschikte methode is voor het bestuderen van CZS-metastasebiologie en het uitvoeren van preklinische studies.
Intracardiale injectie wordt meestal gebruikt om orgaantropisme en metastasisch potentieel van tumoren te bestuderen. Geïnjecteerde tumorcellen zouden verschillende stappen van de metastatische cascade moeten ondergaan, waaronder overlevende circulatie, extravasatie en kolonisatie van de gemetastaseerde site. Net als orthotopische injectie in de hersenen, kan het moeilijk zijn om de voortgang van tumormetastase te volgen zonder radiologische beeldvorming of cellabeling. Net als bij orthotopische implantatie resulteert succesvolle inenting echter in verslechtering van de toestand van de dieren in de loop van de tijd naarmate de tumor zich verspreidt. Figuur 3A toont metastase naar de hersenen na intracardiale injectie in CZS-metastase PDX-model, M2, dat is ontstaan uit een melanoom. Intracardiale injectie van PDX-tumor (CM04) resulteerde in metastase naar de buikholte en lever (figuur 3B). Andere beoordeelde organen, zoals de longen, nieren en eierstokken, hadden geen zichtbare uitzaaiingen.
Figuur 1: Stroomdiagram met de algemene workflow van het opzetten, vermeerderen en gebruiken van PDX voor preklinische studies. Voor elke inentingsmethode worden onder elke methode de stappen van de betrokken metastatische cascade vermeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologie van PDX-tumoren volgens verschillende inentingsmethoden. Hematoxyline en eosine (H &E) kleuring van een CNS-metastase PDX-tumor die afkomstig is van kleincellige longkanker (CM04) geïmplanteerd in immuungecompromitteerde muizen door de drie methoden hebben vergelijkbare tumorpathohistologische en morfologische kenmerken van kleincellige longkankers, met kleine kernen en schaars cytoplasma. Het intracardiale injectiepaneel toont een abdominale metastase. Nesten van kleine cellen en een hoge nucleaire tot cytoplasmatische verhouding zijn duidelijk in alle drie de afbeeldingen. Beelden werden gemaakt met een diascanner en vergroot tot 10x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Metastasen waargenomen na intracardiale injectie. H&E-kleuring van weefsels met zichtbare metastase tijdens beoordeling door obductie na intracardiale injectie van (A) M2 en (B) CM04. Foto's werden gemaakt (A) op een diascanner en vergroot tot 1x (links) of 20x (rechts) of (B) op een gewone microscoop bij 10x vergroting. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van onze vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
In het huidige manuscript zijn methoden voor PDX-vestiging en -vermeerdering gedetailleerd beschreven. Drie verschillende inentingsmethoden die kunnen worden gebruikt voor het opzetten van preklinische studies bij het evalueren van CZS-metastase zijn ook aangetoond. De methode van keuze moet afhangen van de doelen van het experiment. In sommige gevallen zou het nuttig zijn om meer dan één inentingsroute te gebruiken. Subcutane flankimplantatie biedt bijvoorbeeld een eenvoudige benadering om de effectiviteit van een medicijn op tumorgroei te bestuderen en het medicijn op zijn doel te beoordelen en het biedt ook een visual voor tumorgrootte die gemakkelijk kan worden gecontroleerd en gemeten. Zodra echter de haalbaarheid van het doelwit en de antitumorgroei-eigenschappen zijn vastgesteld, kan men een orthotopische studie opzetten om de werkzaamheid van het biologische middel om de BBB te kruisen te beoordelen en het effect ervan in de micro-omgeving van de hersentumor te bestuderen. Ook wordt de overleving beter beoordeeld in orthotopische en intracardiale injectiestudies.
Intracraniële injectie van hersenmetastase PDX-modellen is vaak het preklinische model van keuze vanwege de aanwezigheid van de micro-omgeving van de hersenen en BBB. Studies hebben echter aangetoond dat hersenmetastasen het vermogen hebben om de BBB te wijzigen, wat de permeabiliteit van moleculen voor de tumorbeïnvloedt 16. Deze veranderingen in de BBB zouden niet worden weerspiegeld door intracraniaal geïmplanteerde tumoren, en daarom weerspiegelen preklinische geneesmiddelenstudies mogelijk niet volledig de respons van patiënttumoren. Zelfs met dit voorbehoud blijft intracraniële injectie de beste methode om de permeabiliteit en werkzaamheid van geneesmiddelen te testen om de BBB in preklinische modellen te passeren. Een andere uitdaging met intracraniale modellen is dat ze moeilijk zijn voor het monitoren van tumorgroei en het gebruik van beeldvormingstechnieken vereisen. Virale transductie van PDX's met fluorescerende of bioluminescente markers wordt traditioneel gebruikt, maar kan een uitdaging zijn om uit te voeren. Er worden echter verschillende beeldvormingstechnieken ontwikkeld voor gebruik bij muizen waarvoor geen introductie van markers nodig is, wat het gemak van het monitoren van deze orthotopische hersentumoren voor preklinische studies zou kunnen verbeteren. Deze omvatten beeldvormingstechnologieën zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en positron emissie tomografie (PET) beeldvorming en micro computertomografie (micro-CT). Ten slotte weerspiegelt intracraniële injectie mogelijk niet nauwkeurig de micro-omgeving van CZS-metastasen buiten de hersenen, zoals bij leptomeningeale metastase. In dit geval kan injectie in de cisterna magna worden uitgevoerd om leptomeningeale metastasen nauwkeuriger weer te geven17.
Karakterisering van zowel de fenotypische als moleculaire kenmerken van het PDX-model is belangrijk voor het selecteren van de beste modellen voor preklinische studies. Tumorlatentie kan variëren van 7-140 dagen en de opnamesnelheden kunnen ook zeer variabel zijn12. Het optimale aantal te implanteren dieren en de timing om de behandeling te starten, moeten gebaseerd zijn op de kenmerken van elk PDX-model en moeten empirisch worden bepaald. Verder is het moleculaire profiel van PDX-tumoren ook belangrijk voor de selectie van de meest representatieve PDX-modellen voor preklinische studies. Hoe dichter het model moleculair het donorweefsel weergeeft, hoe voorspellender de klinische respons waarschijnlijk is. Het is ook van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de doelen die zijn geselecteerd uit menselijke gegevens aanwezig zijn in de PDX's die worden gekozen voor studies en gedurende een paar generaties worden gehandhaafd, omdat is aangetoond dat klonale successie geassocieerd is met een ander genomisch profiel van de zittende dominante kloon. In het licht hiervan zijn de fenotypische en moleculaire profielen van de PDX-tumoren met CZS-metastase uitgebreid gekarakteriseerd gedurende meerdere generaties12.
Ondanks de vele voordelen van het gebruik van CNS-metastase PDX-modellen, zijn er verschillende beperkingen met betrekking tot het gebruik ervan. Ten eerste zijn een alternatieve tumormicro-omgeving en vooral het ontbreken van een immuunsysteem goed gedocumenteerde beperkingen van PDX-modellen18. De xenograft van een menselijke tumor in muizen resulteert in de vervanging van menselijk stroma door muizenstroma bij elke volgende passage en het menselijke stroma wordt over het algemeen volledig vervangen na verschillende passages19. De verschillen in de micro-omgeving van de tumor resulteren echter niet in grote verschillen in het moleculaire profiel van flank-geïmplanteerde PDX-tumoren in vergelijking met de oorspronkelijke patiënttumor12, wat suggereert dat flankmodellen nog steeds goede experimentele modellen vertegenwoordigen om CZS-metastase te bestuderen. Ten tweede resulteert het gebruik van immuungecompromitteerde dieren in een gebrek aan immuuncelinfiltratie in de tumor en een algemene immuunrespons door de gastheer, waardoor een fundamentele manier waarop de gastheer probeert de groei van kanker te bestrijdenwordt beperkt 12. Hoewel gehumaniseerde muizen geënt met menselijke immuuncellen beschikbaar zijn voor het bestuderen van de interacties van specifieke immuuncellen met de tumor, zijn er nog steeds veel vragen en controverses over de benaderingen, methoden en interpretatie van die resultaten20.
Hoewel van de meerderheid van de PDX's is aangetoond dat ze genetisch stabiel zijn, hebben wij en anderen aangetoond dat in zeldzame gevallen, zelfs bij afwezigheid van behandelingen of andere externe selectieve druk, er veranderingen kunnen optreden in de klonen van de tumoren, zoals kleine kloonovername12,14,15. Dit zou kunnen resulteren in dramatische veranderingen in het moleculaire profiel, waardoor de tumor uiteindelijk niet de dominante klonen in de patiënttumorweerspiegelt 12. Hoewel PDX's met klonale successie nuttig kunnen zijn in preklinische studies, kunnen veel genen die bedoeld zijn voor targeting (bijv. Her2) verloren gaan met klonale successie. Daarom wordt frequente screening van PDX-modellen aangemoedigd om te bepalen of ze nog steeds het moleculaire profiel van de gewenste kloon behouden.
Kortom, PDX-modellen vertegenwoordigen een uitstekend modelsysteem voor de studie van niet alleen CZS-metastase, maar ook andere tumortypen. Het ontwikkelen van deze modellen heeft aangetoond dat ze grotendeels het fenotypische, moleculaire profiel en heterogeniteit van menselijke CZS-metastase 8,9,10,12 weerspiegelen. Ze dienen als effectieve modellen voor het bestuderen van zowel CZS-metastasebiologie en dienen ook goed als fysiologisch relevante preklinische modellen, ter vervanging van overmatig gebruikte cellijnmodellen die historisch werden gebruikt voor in vivo studies van CZS-metastase. Ongetwijfeld bestaan er verschillen tussen de PDX en de tumor van de donorpatiënt12,18. Weten wat deze verschillen zijn, is belangrijk voor een goede planning en uitvoering van preklinische studies. Ten slotte, door te kiezen tussen verschillende inentingsroutes, zijn PDX-modellen veelzijdig in hun gebruik, waardoor meerdere aspecten van de ziekte kunnen worden bestudeerd. PDXs-modellen zullen ongetwijfeld een belangrijke rol spelen bij het bevorderen van ons begrip van CZS-metastase en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Figuur 3A is afkomstig uit onze vorige publicatie12 en werd gegenereerd in het laboratorium van Dr. Jann Sarkaria in de Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
- Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
- Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
- Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448 (2014).
- Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P.
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
- Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
- Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
- Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444 (2020).
- Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
- Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
- Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
- Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
- Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
- Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
- Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
- Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
- Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).
