Summary
Os modelos PDX de metástases do sistema nervoso central representam as características fenotípicas e moleculares das metástases humanas, tornando-os excelentes modelos para estudos pré-clínicos. Descrevemos aqui como estabelecer modelos de PDX e as rotas de inoculação que são mais bem utilizadas para estudos pré-clínicos.
Abstract
O desenvolvimento de novas terapias para metástases no sistema nervoso central (SNC) tem sido dificultado pela falta de modelos pré-clínicos que representem com precisão a doença. Demonstrou-se que modelos de xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) de metástase no SNC representam melhor as características fenotípicas e moleculares da doença humana, bem como refletem melhor a heterogeneidade e a dinâmica clonal de tumores de pacientes humanos em comparação com modelos históricos de linhagem celular. Existem vários locais que podem ser usados para implantar tecido derivado do paciente ao estabelecer ensaios pré-clínicos, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens, e cada um adequado para estudar diferentes aspectos da cascata metastática. Aqui, o protocolo descreve como estabelecer modelos PDX e apresenta três abordagens diferentes para a utilização de modelos PDX de metástase do SNC em estudos pré-clínicos, discutindo cada uma de suas aplicações e limitações. Estes incluem implante de flanco, injeção ortotópica no cérebro e injeção intracardíaca. O implante do flanco subcutâneo é o mais fácil de monitorar e, portanto, mais conveniente para estudos pré-clínicos. Além disso, metástases para o cérebro e outros tecidos a partir do implante do flanco foram observadas, indicando que o tumor sofreu múltiplas etapas de metástase, incluindo intravasamento, extravasamento e colonização. A injeção ortotópica no cérebro é a melhor opção para recapitular o microambiente do tumor cerebral e é útil para determinar a eficácia dos biológicos para atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), mas ignora a maioria das etapas da cascata metastática. A injeção intracardíaca facilita a metástase para o cérebro e também é útil para estudar o tropismo de órgãos. Embora esse método renuncie a etapas anteriores da cascata metastática, essas células ainda terão que sobreviver à circulação, extravasar e colonizar. A utilidade de um modelo PDX é, portanto, impactada pela via de inoculação tumoral e a escolha de qual utilizar deve ser ditada pela questão científica e pelos objetivos gerais do experimento.
Introduction
A incidência de metástases para o sistema nervoso central (SNC) tem aumentado nos últimos anos 1,2,3. As terapias tradicionais para metástases do SNC, como ressecção tumoral, radioterapia cerebral total e radiocirurgia estereotáxica, têm sido em grande parte paliativas e raramente curativas, podendo levar a efeitos colaterais debilitantes, como deterioraçãocognitiva1. Recentemente, muitas novas terapias direcionadas e imunológicas estão sendo desenvolvidas para o tratamento de metástases do SNC que se mostram promissoras por serem tratamentos mais eficazes, porém com menos efeitoscolaterais4.
A tradução de resultados pré-clínicos em desfechos clínicos significativos geralmente requer estratégias de modelagem eficazes e preditivas. Historicamente, os modelos de xenoenxerto de linhagem celular foram o padrão para pesquisa pré-clínica na pesquisa de metástases do SNC. Entretanto, esses modelos de linhagens celulares não refletem o verdadeiro comportamento tumoral do tumor hospedeiro ou representam a heterogeneidade histológica ou molecular da doença. Além disso, modelos de linhagens celulares são capazes de se adaptar às condições de crescimento in vitro e, portanto, perder as propriedades originais do tumor hospedeiro. Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs), que enxertam o tumor de um paciente em um camundongo imunodeficiente ou humanizado, são cada vez mais usados na pesquisa translacional do câncer. Os pesquisadores mostraram que os modelos PDX geralmente podem recapitular fielmente o crescimento tumoral, as características histológicas, manter a heterogeneidade tumoral, o potencial metastático e as características genéticas moleculares. Além disso, os modelos PDX são prognósticos em que o período de latência tumoral do PDX se correlaciona com a sobrevida global do paciente e também demonstraram predizer com precisão a resposta terapêutica em estudos compacientes5,6.
Houve o surgimento de PDXs metastáticos do SNC. Em sua maioria, estes foram desenvolvidos representando tumores originados de uma única origem, como o câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC)7, câncer demama8,9 emelanoma10,11. Mais recentemente, uma grande e diversificada coleção de modelos PDX foi desenvolvida e caracterizada, representando oito diferentes subtiposhistológicos12. Demonstrou-se que os modelos PDX para metástases no SNC se assemelham muito ao tumor original do paciente, tanto histológica quanto molecularmente, e também demonstraram diferenças e semelhanças histológicasúnicas10,12. Além disso, enquanto a maioria dos modelos PDX de metástases no SNC mantém a heterogeneidade clonal dos tumores humanos, alguns apresentaram evidências de sucessãoclonal12, tornando-os também ideais para estudar a resistência a terapias por meio do monitoramento das alterações clonais após o tratamento.
Os protocolos aqui descritos descrevem métodos de estabelecimento de PDX e várias vias de inoculação utilizadas em estudos pré-clínicos de metástases no SNC (Figura 1). Esses métodos de implantação variam em sua capacidade de mimetizar crescimento e metástase. Aqui, o protocolo destaca as aplicações para cada via de implantação e demonstra como elas poderiam ser usadas para o estudo de metástases no SNC.
Protocol
A seguir, apresentamos uma série de protocolos passo a passo utilizados tanto para o estabelecimento de modelos de PDX por implante de flanco subcutâneo quanto para a montagem de estudos pré-clínicos que possibilitem a realização de testes de tratamentos, que podem auxiliar na avaliação de alterações biológicas e de várias etapas da cascata metastática. Todos os estudos e modelos utilizaram camundongos NOG fêmeas com 3-8 semanas de idade. Todas as amostras de tecido foram coletadas sob consentimento informado de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pela Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Estabelecimento e propagação de modelos PDX por implantação de flanco
- Estabelecimento de modelos PDX
- Após a ressecção cirúrgica do tumor do paciente na sala de cirurgia, armazene os tecidos frescos do tumor em uma solução adequada (como DMEM) e coloque-o imediatamente no gelo. Use um excesso de solução de armazenamento (>10 mL) para garantir que o tecido esteja totalmente submerso.
- Transfira o tecido para a placa de cultura de tecidos e enxágue com 5 mL de DPBS.
OBS: Esta etapa deve ser realizada em um gabinete de biossegurança utilizando técnicas assépticas. Precauções devem ser tomadas com o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados para proteger contra possíveis agentes infecciosos humanos. - Remover regiões necróticas do tumor.
NOTA: Isso pode ser reconhecido como uma região branca e mole em direção ao centro do tecido. - Corte o tecido restante em pedaços de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transfira os tecidos para um tubo de microcentrífuga contendo a matriz da membrana basal reduzida do fator de crescimento e armazene-os no gelo. Certifique-se de que a matriz de membrana basal suficiente (>200 μL) seja usada para submergir completamente cada pedaço de tecido.
- Criopreservar os tecidos remanescentes que não serão implantados conforme protocolo descrito no passo 1.3.
- Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano a 2-5% e oxigênio. Uma vez anestesiado, transferir o animal para um cone nasal para manter a anestesia a 1,5-2,5% de isoflurano com fornecimento contínuo de oxigênio. Confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal. Aplique a pomada oftálmica veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Fornecer suporte térmico para o animal durante todo o procedimento até que o animal se recupere.
- Identifique o local de implantação no mouse.
OBS: Este deve ser no flanco direito ou esquerdo do camundongo, geralmente demarcado lateralmente no lado da região abdominal, caudal à caixa torácica. - Para o preparo da área cirúrgica, raspar o pelo e desinfetar com três esfoliantes alternados de iodopovidona e etanol 70%.
- Usando pinças, levante a pele do rato e faça uma incisão de 0,5-1 cm sobre a pele.
- Insira uma tesoura cirúrgica lentamente sob a pele no local da incisão para criar uma bolsa (0,5-1 cm de profundidade) no espaço subcutâneo.
- Coloque cuidadosamente uma peça de tumor no bolso e empurre-a, empurre-a para o fundo da bolsa para evitar que o tumor escorregue.
- Fechar a incisão com pontos cirúrgicos de náilon 4-0.
NOTA: Outros métodos de fechamento de feridas, como suturas não absorvíveis ou absorvíveis e clipes de ferida, também podem ser usados. - Transfira o camundongo de volta para a gaiola e acompanhe a recuperação do animal da anestesia, até que esteja deambulando.
NOTA: Analgésicos não são necessários, mas podem ser administrados se a dor for observada nos camundongos. - Monitorar o crescimento do tumor semanalmente. Espera-se um tumor por camundongo.
NOTA: O volume do tumor no transplante parece diminuir inicialmente, mas isso não é motivo de preocupação. Considera-se que um tumor tomou uma vez que se torna palpável e entra em uma fase de crescimento logarítmico. Esta primeira passagem representa a geração F0. - Uma vez que os tumores começam a crescer, medir os tumores três vezes por semana. Meça o comprimento e a largura dos tumores com um paquímetro. Para calcular o volume do tumor, use a fórmula: comprimento x largura x largura / 2.
- Eutanasiar os camundongos implantados com tumores PDX quando os tumores tiverem mais de 15 mm de diâmetro usando o lado mais longo do tumor. Realizar a eutanásia por inalação de CO 2 em câmara de indução de CO2, seguida de deslocamento cervical como método secundário.
- Ressecção do tumor do flanco do animal fazendo uma incisão. Dissecar suavemente o tumor excisado com tesoura romba e pinça. Para fazer isso, primeiro corte a pele em cima do tumor, em seguida, corte o tumor longe da camada muscular abaixo dele.
- Transfira o tecido tumoral para >10 mL de uma solução de armazenamento adequada (como DMEM). Imediatamente coloque-o no gelo. Este tumor pode ser criopreservado ou passado para outro conjunto de camundongos. Considere esta passagem como F1.
NOTA: A passagem novamente tornaria a passagem do tumor F2 e assim por diante.
- Propagação de modelos PDX
- Começar com o tumor ressecado mantido em solução de armazenamento a partir do passo 1.1.19.
- Transfira o tecido para uma placa de cultura de tecidos e enxágue com 5 mL de DPBS.
- Remova as regiões necróticas do tumor.
- Corte o tecido em pedaços de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transferir os tecidos para um tubo de microcentrífuga contendo matriz de membrana basal reduzida com fator de crescimento (>200 μL) e armazenar em gelo.
- Criopreservar o tecido remanescente que não é utilizado para propagação de acordo com o protocolo descrito no passo 1.3.
- Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano a 2-5% e oxigênio. Uma vez anestesiado, transferir o animal para um cone nasal para manter a anestesia a 1,5-2,5% de isoflurano com fornecimento contínuo de oxigênio. Confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal. Aplique a pomada oftálmica veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Fornecer suporte térmico para o animal durante todo o procedimento até que o animal se recupere.
- Identifique o local de implantação no mouse.
NOTA: Este deve ser no flanco direito ou esquerdo do rato, geralmente na região abdominal, caudal à caixa torácica. - Para o preparo da área cirúrgica, raspar o pelo e desinfetar com três esfoliantes alternados de iodopovidona e etanol 70%.
- Faça uma incisão de 0,5-1 cm em um flanco do mouse.
- Insira uma tesoura cirúrgica lentamente sob a pele na incisão para criar uma bolsa (0,5-1 cm de profundidade) no espaço subcutâneo.
- Coloque cuidadosamente um pedaço de tumor no bolso e empurre-o para o fundo do bolso para evitar que o tumor escorregue.
- Fechar a incisão usando suturas cirúrgicas de náilon 4-0 ou outros métodos de fechamento da ferida.
- Transfira o camundongo de volta para a gaiola e monitore sua recuperação da anestesia, até que esteja deambulando.
NOTA: Analgésicos não são necessários, mas podem ser administrados se a dor for observada nos camundongos. - Durante a latência (fase de não crescimento), monitorar o crescimento do tumor semanalmente. Espera-se um tumor por camundongo.
NOTA: O volume do tumor no transplante parece diminuir inicialmente, mas isso não é motivo de preocupação. Um tumor é considerado para ser tomado uma vez que se torna palpável e começa a crescer continuamente. - Uma vez que os tumores começam a crescer, medir os tumores três vezes por semana. Meça o comprimento e a largura dos tumores com um paquímetro. Calcule o volume do tumor usando a fórmula: comprimento x largura x largura / 2.
- Eutanasiar os camundongos implantados com tumores PDX quando os tumores tiverem mais de 15 mm de diâmetro usando o lado mais longo do tumor. Realizar a eutanásia por inalação de CO2 em câmara de indução de CO2, seguida de deslocamento cervical como método secundário.
- Ressecção do tumor a partir do flanco do animal fazendo uma incisão e dissecando o tumor suavemente com tesoura romba e pinça.
- Transfira o tecido tumoral para >10 mL de uma solução de armazenamento adequada (como DMEM) e, em seguida, coloque imediatamente no gelo.
- Criopreservação de tumores PDX
- Eutanasiar os camundongos implantados com tumores PDX quando os tumores tiverem mais de 15 mm de diâmetro usando o lado mais longo do tumor. Realizar a eutanásia por inalação de CO 2 em câmara de indução de CO2, seguida de deslocamento cervical como método secundário.
- Ressecção do tumor a partir do flanco do animal fazendo uma incisão e dissecando o tumor suavemente com tesoura romba e pinça.
- Transfira o tecido tumoral para >10 mL de uma solução de armazenamento adequada (como DMEM) e, em seguida, coloque imediatamente no gelo.
- Transfira o tecido para uma placa de cultura de tecidos e enxágue com 5 mL de DPBS.
- Remover regiões necróticas do tumor.
- Corte o tecido em pedaços de aproximadamente 2 x 2 x 2 mm.
- Transfira o tecido para criotubos contendo 20% de DMEM, 70% de SFB e 10% de DMSO.
- Transfira os criotubos para um recipiente de criopreservação e coloque em um freezer de -80 °C.
- Quando os criotubos forem resfriados a -80 °C, transfira-os para o armazenamento de nitrogênio líquido.
2. Vias de inoculação para estudos pré-clínicos
- Implante de flanco subcutâneo.
NOTA: O implante do flanco subcutâneo pode ser usado para facilitar e pode ser útil para estudar todas as etapas da cascata metastática.- Use tumores PDX em crescimento ou tumores PDX criopreservados para implantação inicial do flanco.
- Para tumores PDX em crescimento, eutanasiar os camundongos usando um método aprovado pela IACUC quando os tumores tiverem mais de 15 mm de comprimento; ressecar o tumor e transferir o tecido tumoral para uma solução de armazenamento adequada (como DMEM) e imediatamente colocar no gelo.
- Para tumores PDX criopreservados descongelar o tecido PDX criopreservado rapidamente imergindo em banho-maria a 37 °C.
- Siga os passos 1.2.2-1.2.19.
- Implante ortotópico por injeção intracraniana no cérebro.
NOTA: Este modelo pode ser usado para testar a eficácia de drogas para atravessar a BHE e para estudar a colonização tumoral. Esta seção refere-se principalmente ao uso do kit de dissociação tumoral (ver Tabela de Materiais). Diferentes tipos de tecidos requerem diferentes protocolos de dissociação. Recomenda-se que o usuário teste e otimize o protocolo para maximizar a eficiência da dissociação.- Eutanásia dos camundongos implantados com tumores PDX usando um método aprovado pela IACUC quando os tumores tiverem mais de 15 mm de comprimento.
- Sob condições estéreis em um gabinete de biossegurança, ressecção cirúrgica dos tumores PDX e armazenamento em DMEM em gelo.
- Preparar a solução de dissociação no tubo apropriado adicionando a mistura enzimática em DMEM, conforme indicado pelo protocolo do fabricante.
- Lavar o tumor em 5 mL de DPBS em uma placa de cultura de tecidos.
- Remova as regiões necróticas do tumor.
- Corte o tumor em pequenos pedaços de 2-4 mm de comprimento.
- Transfira os pedaços do tumor para o tubo que contém a mistura enzimática.
- Conecte o tubo ao dissociador de tecido e execute o programa adequado para o tipo de tecido. Consulte o protocolo do fabricante para o programa apropriado a ser executado e o tempo de dissociação necessário.
- Após a conclusão do programa, coe as células através de um filtro celular de 70 μm.
- Lavar o filtro celular com 20 mL de DMEM.
- Centrifugar as células dissociadas a 300 x g por 7 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em DPBS.
- Conte as células e dilua até a concentração necessária.
- Configure o quadro estereotáxico de acordo com as instruções do fabricante e prepare uma almofada de aquecimento para os ratos. Higienizar todas as áreas com etanol 70%.
- Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano a 2-5% e oxigênio. Uma vez anestesiado, transferir o animal para um cone nasal para manter a anestesia a 1,5-2,5% de isoflurano com fornecimento contínuo de oxigênio. Confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal. Aplique a pomada oftálmica veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Fornecer suporte térmico para o animal durante todo o procedimento até que o animal se recupere.
- Prepare a área cirúrgica raspando o pelo na cabeça do rato para expor o couro cabeludo.
- Fornecer ao rato o analgésico adequado, tal como uma dose de 1 mg/kg de buprenorfina de libertação sustentada (SR) administrada por injeção subcutânea.
- Transfira o mouse para o quadro estereotáxico. Certifique-se de que o mouse está mordendo o bloco de mordida. Use as barras auriculares para prender firmemente a cabeça do mouse.
NOTA: O mouse é fixado corretamente se a cabeça não se move quando pressionada suavemente com pinças. - Desinfetar a área raspada com três esfoliantes alternados de iodopovidona e etanol 70%.
- Faça uma incisão longitudinal de 5-7 mm no couro cabeludo para expor o crânio e retrair o couro cabeludo.
- Raspe o periósteo com um instrumento cirúrgico rombo, como pinças.
- Localize o bregma no crânio.
- Posicione a agulha do quadro estereotáxico em cima do bregma e redefina as coordenadas para 0 ou observe a coordenada no braço.
- Mover o braço 1 mm posterior (caudalmente) e 1 mm lateral, à direita da linha média.
- Marque este local com um marcador permanente. Se o braço contiver uma ranhura para a seringa, fixe um marcador à ranhura da seringa para marcar a localização.
- Faça um pequeno furo no crânio neste local. Não aplique muita pressão para evitar perfurar o cérebro.
- Carregar uma seringa de Hamilton de 5 μL, 26 G com 5-10 x 104 células, num volume de 1-2 μL, e fixar no braço estereotáxico.
- Insira lentamente a agulha da seringa de Hamilton 2 mm no cérebro.
- Comece a injetar células na taxa desejada, geralmente 0,2-0,5 μL/min.
- Após a conclusão da injeção, retraia lentamente a agulha do cérebro.
- Preencha o orifício da rebarba com cera de osso.
- Fechar a incisão com suturas cirúrgicas ou cola cirúrgica.
- Transfira o rato de volta para a gaiola e monitorize a sua recuperação da anestesia.
- Monitorar a condição dos animais regularmente e eutanasiá-los quando os critérios de desfecho humano forem atingidos no protocolo aprovado.
NOTA: O crescimento bem-sucedido do tumor no cérebro resulta na deterioração da condição do animal, que muitas vezes se manifesta com inclinação da cabeça, pelagem áspera, corpo curvado, olhos apertados, atividade reduzida e baixo escore de condição corporal (BCS < 2). - Realizar necropsia nos animais eutanasiados, seguida de análise histológica para confirmar a presença de tumores no cérebro. Registre o tempo que leva desde a implantação até a eutanásia.
- Implante de modelos PDX por injeção intracardíaca
NOTA: Este modelo pode ser usado para estudar o tropismo de órgãos uma vez que as células tumorais estão em circulação. Esta seção também usa o Kit de Dissociação Tumoral e requer otimização por tipo de tecido.- Siga os passos 2.2.1-2.2.13.
- Anestesiar o animal em câmara de indução com isoflurano a 2-5% e oxigênio. Uma vez anestesiado, transferir o animal para um cone nasal para manter a anestesia a 1,5-2,5% de isoflurano com fornecimento contínuo de oxigênio. Confirme a profundidade da anestesia através da ausência do reflexo pedal. Aplique a pomada oftálmica veterinária para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia. Fornecer suporte térmico para o animal durante todo o procedimento até que o animal se recupere.
- Em seguida, posicione o mouse em decúbito dorsal.
- Para preparar a área cirúrgica no tórax, raspe o pelo e desinfete-o com três esfoliantes alternados de iodopovidona e etanol 70%.
- Introduzir 0,5-10 x 105 células numa seringa com uma agulha de 28 G, até um volume de 100 μL.
NOTA: O número de células necessárias varia dependendo da agressividade do modelo e o número ideal de células deve ser determinado empiricamente para cada modelo. - Localize o local de injeção (ligeiramente à esquerda do esterno do rato e a meio caminho entre a fúrcula esternal e o processo xifoide).
- Introduza a agulha verticalmente no rato no local da injeção.
- Observe a entrada bem-sucedida no ventrículo esquerdo através de um refluxo de sangue que entra na seringa. Distribua lentamente as células no ventrículo esquerdo sem mover a agulha.
- Puxe lentamente a agulha verticalmente do mouse.
- Aplique um pedaço de gaze estéril sobre o local da injeção e aplique pressão por cerca de 1 min até que o sangramento pare, enquanto ainda permite o movimento do tórax para a respiração.
- Retire o mouse da anestesia e permita que ele se recupere em uma almofada aquecida.
NOTA: O crescimento bem-sucedido do tumor resulta na deterioração da condição do animal, que muitas vezes se manifesta com pelagem babada, corpo curvado, olhos apertados, atividade reduzida e baixo escore de condição corporal (BCS < 2). - Monitorar a condição dos animais regularmente e eutanasiá-los quando os critérios de desfecho humano forem atingidos no protocolo aprovado.
- Realizar necropsia para identificação de metástases nos animais eutanasiados, seguida de análise histológica para confirmar a presença de tumores no órgão-alvo. Registre o tempo que leva desde a injeção intracardíaca até a eutanásia.
Representative Results
Os tumores PDX propagados por flancos são os mais fáceis de implantar, monitorar e ressecar, sendo geralmente recomendados para o estabelecimento inicial e propagação dos tumores PDX (Figura 1). Ao estabelecer ou propagar tumores PDX, é prudente implantar tumores em vários animais, pois a taxa de ocorrência do tumor pode variar e nem todo pedaço de tumor sempre será usado em camundongos. Métodos têm sido desenvolvidos para o estabelecimento e propagação de PDXs de metástases do SNC diretamente no encéfalo13. No entanto, esses métodos ainda são mais desafiadores com taxas de tomada mais baixas e os tumores são significativamente mais difíceis de propagar e monitorar do que o implante de flanco.
Se os tumores dos pacientes não estiverem prontamente disponíveis, os tumores PDX de metástase do SNC também podem ser obtidos de uma variedade de fontes, incluindo repositórios de laboratórios acadêmicos ou empresas comerciais. Após a aquisição dos tumores, a primeira prioridade seria propagar e criopreservar o máximo de material possível, garantindo que um grande número de tumores de baixa passagem seja preservado. Isso garante que material suficiente esteja disponível para um número indefinido de estudos subsequentes com os modelos PDX. Assim como as linhagens celulares imortalizadas, os tumores PDX devem ser criopreservados e utilizados em baixo número de passagens, pois a deriva genética resulta em mudanças no fenótipo e genótipo das PDXs ao longo do tempo12,14,15. Independentemente da origem dos tumores PDX, é importante realizar a triagem frequente de PDX e colônias de camundongos para patógenos humanos e de camundongos, como HIV e hepatite para humanos e Corynebacterium bovis para camundongos. Isso limitará a disseminação de patógenos indesejados do PDX tanto para o indivíduo que os manuseia quanto para outros camundongos no estudo e no biotério.
Os métodos de implantação aqui descritos podem ser usados para estudar a biologia tumoral, avaliar múltiplos aspectos da cascata metastática e para estudos pré-clínicos. A principal vantagem do implante de flanco é a facilidade de monitoramento do tumor ao longo do tempo, pois os tumores são visíveis, e seu crescimento pode ser facilmente medido com paquímetro. Este método pode ser um bom ponto de partida para estabelecer a viabilidade de um alvo de droga. O implante intracraniano é preferido se a presença do microambiente cerebral for importante e puder alterar o crescimento ou o perfil molecular do tumor. Além disso, o implante intracraniano coloca o tumor atrás da barreira hematoencefálica (BHE), tornando-o essencial para estudos pré-clínicos que examinem a eficácia de medicamentos necessários para atravessar a BHE. No entanto, é difícil monitorar o crescimento de tumores PDX e requer imagens radiológicas ou imagens bioluminescentes se as células forem marcadas. Saber quando iniciar o tratamento medicamentoso pré-clinicamente exigiria dados de imagem para monitorar o crescimento ou conhecimento da sobrevida média de camundongos portadores de um tumor PDX específico. Além disso, o implante intracraniano ignora todas as etapas essenciais da cascata metastática, tornando-o adequado apenas para estudar a eficácia da droga e o microambiente tumoral dentro do cérebro. Apesar das diferenças no microambiente tumoral, a morfologia dos tumores PDX é semelhante independentemente do local de implantação, como pode ser visto neste tumor PDX (CM04) derivado de uma metástase cerebral originada de um tumor primário de câncer de pulmão de pequenas células (Figura 2). A morfologia do câncer de pulmão de pequenas células de células tumorais com núcleos pequenos e citoplasma escasso pode ser observada no tumor de flanco, tumor intracraniano e metástase abdominal resultante da injeção intracardíaca. Além disso, metástases espontâneas de tumores implantados no flanco foram previamenteobservadas12, sugerindo que os processos metastáticos como intravasamento, extravasamento e colonização podem ser recapitulados e estudados em tumores de flanco, o que de outra forma não seria possível com tumores ortotópicos no cérebro. Em geral, observa-se que o implante de flanco é um método adequado para estudar a biologia de metástases do SNC e realizar estudos pré-clínicos.
A injeção intracardíaca é mais frequentemente usada para estudar o tropismo de órgãos e o potencial metastático de tumores. As células tumorais injetadas teriam que passar por várias etapas da cascata metastática, incluindo a sobrevivência à circulação, extravasamento e colonização do sítio metastático. Assim como a injeção ortotópica no cérebro, pode ser difícil rastrear o progresso da metástase tumoral sem imagens radiológicas ou marcação celular. No entanto, como na implantação ortotópica, a inoculação bem-sucedida resulta na deterioração da condição dos animais ao longo do tempo à medida que o tumor se espalha. A Figura 3A demonstra metástase para o encéfalo após injeção intracardíaca em metástase do SNC modelo PDX, M2, originada de melanoma. A injeção intracardíaca do tumor PDX (CM04) resultou em metástase para cavidade abdominal e fígado (Figura 3B). Outros órgãos avaliados, como pulmão, rim e ovários, não apresentavam metástases visíveis.
Figura 1: Fluxograma mostrando o fluxo de trabalho geral de estabelecimento, propagação e uso do PDX para estudos pré-clínicos. Para cada método de inoculação, as etapas da cascata metastática envolvida estão listadas abaixo de cada método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Histologia dos tumores PDX seguindo diferentes métodos de inoculação. A coloração pela hematoxilina e eosina (H&E) de um tumor PDX com metástase no SNC originado de câncer de pulmão de pequenas células (CM04) implantado em camundongos imunocomprometidos pelos três métodos tem características pato-histológicas e morfológicas semelhantes aos cânceres de pulmão de pequenas células, com núcleos pequenos e citoplasma escasso. O painel de injeção intracardíaca mostra uma metástase abdominal. Ninhos de células de pequeno porte e alta relação núcleo/citoplasma são evidentes nas três imagens. As imagens foram obtidas em um scanner de slides e ampliadas para 10x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Metástases observadas após injeção intracardíaca. Coloração H&E de tecidos com metástases visíveis durante avaliação por necropsia após injeção intracardíaca de (A) M2 e (B) CM04. As imagens foram obtidas (A) em um scanner de lâminas e ampliadas para 1x (esquerda) ou 20x (direita) ou (B) em um microscópio comum com aumento de 10x. Este número foi modificado de nossa publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
No presente manuscrito, métodos para o estabelecimento e propagação de PDX foram detalhados. Três diferentes métodos de inoculação que podem ser usados para estabelecer estudos pré-clínicos na avaliação de metástases no SNC também foram demonstrados. O método de escolha deve depender dos objetivos do experimento. Em alguns casos, seria benéfico usar mais de uma via de inoculação. Por exemplo, o implante de flanco subcutâneo fornece uma abordagem simples para estudar a eficácia de uma droga no crescimento do tumor e avaliar a droga em seu alvo, além de fornecer uma visão do tamanho do tumor que é facilmente monitorada e medida. No entanto, uma vez estabelecida a viabilidade do alvo e as propriedades antitumorais de crescimento, pode-se estabelecer um estudo ortotópico para avaliar a eficácia do biológico em atravessar a BHE e estudar seu efeito dentro do microambiente do tumor cerebral. Além disso, a sobrevida é melhor avaliada em estudos de injeção ortotópica e intracardíaca.
A injeção intracraniana de modelos PDX de metástases cerebrais é frequentemente o modelo pré-clínico de escolha devido à presença do microambiente cerebral e BBB. No entanto, estudos têm demonstrado que as metástases cerebrais têm a capacidade de modificar a BHE, o que afeta a permeabilidade das moléculas ao tumor16. Essas alterações na BHE não seriam refletidas por tumores implantados intracranialmente e, devido a isso, os estudos pré-clínicos com drogas podem não refletir totalmente a resposta dos tumores dos pacientes. Mesmo com essa ressalva, a injeção intracraniana continua sendo o melhor método para testar a permeabilidade e a eficácia de drogas para atravessar a BHE em modelos pré-clínicos. Outro desafio dos modelos intracranianos é que eles são difíceis de monitorar o crescimento tumoral e requerem o uso de técnicas de imagem. A transdução viral de PDXs com marcadores fluorescentes ou bioluminescentes tem sido tradicionalmente usada, mas pode ser desafiadora de ser realizada. No entanto, várias técnicas de imagem estão sendo desenvolvidas para uso em camundongos que não requerem a introdução de marcadores, o que poderia melhorar a facilidade de monitoramento desses tumores cerebrais ortotópicos para estudos pré-clínicos. Estas incluem tecnologias de imagem como ressonância magnética (RM) e tomografia por emissão de pósitrons (PET) e microtomografia computadorizada (micro-TC). Finalmente, a injeção intracraniana pode não refletir com precisão o microambiente de metástases do SNC fora do cérebro, como nas metástases leptomeníngeas. Nesse caso, a injeção na cisterna magna poderia ser realizada para representar com maior precisão as metástases leptomeníngeas17.
A caracterização das características fenotípicas e moleculares do modelo PDX é importante para a seleção dos melhores modelos para estudos pré-clínicos. A latência tumoral pode variar de 7 a 140 dias e as taxas de demora também podem ser muitovariáveis12. O número ideal de animais a serem implantados e o momento para iniciar o tratamento teriam que ser baseados nas características de cada modelo de PDX e precisam ser determinados empiricamente. Além disso, o perfil molecular dos tumores PDX também é importante para a seleção dos modelos PDX mais representativos para estudos pré-clínicos. Quanto mais próximo o modelo representar molecularmente o tecido doador, mais preditivo de resposta clínica ele provavelmente será. Além disso, é fundamental garantir que os alvos selecionados a partir de dados humanos estejam presentes nos PDXs que estão sendo escolhidos para estudos e sejam sustentados ao longo de algumas gerações, como mostrado que a sucessão clonal está associada a um perfil genômico diferente do clone dominante incumbente. Em vista disso, os perfis fenotípicos e moleculares dos tumores PDX metastáticos do SNC têm sido extensivamente caracterizados ao longo de múltiplasgerações12.
Apesar das inúmeras vantagens do uso de modelos PDX de metástase no SNC, existem várias limitações relacionadas ao seu uso. Primeiro, um microambiente tumoral alternativo e, especialmente, a falta de um sistema imunológico são limitações bem documentadas dos modelos PDX18. O xenoenxerto de um tumor humano em camundongos resulta na substituição do estroma humano pelo estroma de camundongo a cada passagem subsequente e o estroma humano geralmente é completamente substituído após váriaspassagens19. No entanto, as diferenças no microambiente tumoral não resultam em grandes diferenças no perfil molecular dos tumores PDX implantados no flanco em comparação com o tumor original dopaciente12, sugerindo que os modelos de flanco ainda representam bons modelos experimentais para estudar metástases no SNC. Em segundo lugar, o uso de animais imunocomprometidos resulta em falta de infiltração de células imunes no tumor e em uma resposta imune geral do hospedeiro, limitando uma maneira fundamental pela qual o hospedeiro tenta combater o crescimento docâncer12. Embora camundongos humanizados enxertados com células imunes humanas estejam disponíveis para estudar as interações de células imunes específicas com o tumor, ainda existem muitas dúvidas e controvérsias sobre as abordagens, métodos e interpretação dessesresultados20.
Embora a maioria das PDXs tenha se mostrado geneticamente estável, nós e outros mostramos que, em casos raros, mesmo na ausência de tratamentos ou outras pressões seletivas externas, pode haver alterações nos clones dos tumores, como a aquisição de clones menores12,14,15. Isso poderia resultar em mudanças dramáticas no perfil molecular, o que acabaria por tornar o tumor não refletindo os clones dominantes no tumor dopaciente12. Embora PDXs exibindo sucessão clonal possam ter uso em estudos pré-clínicos, muitos genes destinados ao alvo (por exemplo, Her2) podem ser perdidos com a sucessão clonal. Portanto, a triagem frequente de modelos PDX para determinar se eles ainda mantêm o perfil molecular do clone desejado é encorajada.
Em resumo, os modelos PDX representam um excelente sistema modelo para o estudo não só de metástases no SNC, mas também de outros tipos tumorais. O desenvolvimento desses modelos mostrou que eles refletem em grande parte o perfil fenotípico, molecular e a heterogeneidade das metástases do SNC humano8,9,10,12. Eles servem como modelos eficazes para estudar a biologia de metástases do SNC e também servem bem como modelos pré-clínicos fisiologicamente relevantes, substituindo modelos de linhagem celular usados em excesso historicamente usados para estudos in vivo de metástases no SNC. Sem dúvida, existem diferenças entre o PDX e o tumor do pacientedoador12,18. Saber quais são essas diferenças é importante para o planejamento e execução adequados de estudos pré-clínicos. Por fim, ao escolher entre várias vias de inoculação, os modelos PDX são versáteis em seu uso, permitindo o estudo de múltiplos aspectos da doença. Os modelos PDXs sem dúvida desempenharão um papel importante no avanço de nossa compreensão da metástase do SNC e no desenvolvimento de novas terapias.
Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Acknowledgments
A Figura 3A foi retirada de nossa publicação anterior12 e foi gerada no laboratório do Dr. Jann Sarkaria na Mayo Clinic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25G needle | VWR | BD305122 | |
| 70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
| 70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
| Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
| CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
| Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
| Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
| Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
| PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
| Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
| Surgical glue | MedVet | VG3 | |
| Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
| Syringe | VWR | 53548-001 | |
| Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |
References
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