Protokollen præsenteres her beskriver brugen af Spotiton, en ny robot system, til at levere to prøver af interesse på en selvtransporterende, nanowire gitter, der blandes for mindst 90 ms før vitrifikation i flydende cryogen.
Fangsten af kortvarige molekylære tilstande udløst af det tidlige møde med to eller flere interagerende partikler fortsætter med at være en eksperimentel udfordring af stor interesse for området kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM). Et par metodiske strategier er blevet udviklet, der understøtter disse “tid-løst” undersøgelser, hvoraf den ene, Spotiton-en ny robot system-kombinerer udlevering af picoliter mellemstore prøvedråber med præcis tidsmæssig og rumlig kontrol. Den tidsforløste Spotiton-arbejdsgang tilbyder en unik effektiv tilgang til at afhøre tidlige strukturelle omlægninger fra minimal prøvevolumen. Fyret fra uafhængigt kontrollerede piezoelektriske dispensere, to prøver lander og blandes hurtigt på et nanowire EM-gitter, da det kaster mod cryogen. Potentielt hundredvis af gitre kan fremstilles i hurtig rækkefølge fra kun et par mikroliter af en prøve. Her præsenteres en detaljeret trinvis protokol for driften af Spotiton-systemet med fokus på fejlfinding af specifikke problemer, der opstår under gitterforberedelse.
Potentialet for cryo-EM til at fange og afsløre forbigående kropsbygningstilstande af proteiner på sub-sekund tidsskala (tid-løst cryo-EM) er blevet realiseret af flere grupper, begyndende med Berriman og Unwin1, hvis teknik bygger på standard springet frysning metode udviklet af Dubochet til fremstilling af cryo-EM gitre2. De tilføjede en forstøver lige over cryogen kop, der anvendes komprimeret nitrogen gas til at sprøjte en fin tåge af en anden prøve på en kaste EM gitter, der indeholder en første prøve, der var blevet anvendt og blottet for et tyndt vandig lag. Selv om dette system kunne opnå blanding gange så lavt som 1 ms, det stadig krævede manuel blotting af den første prøve af brugeren-en teknisk udfordrende opgave-og en relativt høj volumen af den anden prøve. Desuden var det i praksis vanskeligt at vide, hvor blanding af de to prøver var sket, hvilket krævede anvendelse af ferritin nanopartikler som fiducial markør i den blandede prøve. Howard Whites og kollegernes efterfølgende indsats forbedrede kontrollen og reproducerbarheden af denne sprøjteblandingsmetode ved at indarbejde computerkontrol af blotting- og sprøjtningstrin3,4. For at adressere, hvor godt og hvor prøverne blandes, er den samme gruppe5 og andre6,7,8,9,10 flyttet til en blandingssprøjtetilgang11, hvor to prøver blandes enten i smalle kapillærrør under tryk af sprøjtepumper eller i mikrofabricated, mikrofluidiske chips drevet af nitrogengas. Disse forblandingssystemer sikrer ikke kun fuldstændig blanding, men gør det også muligt at finjustere blandingstiderne for at øge opløsningen af tidsforløsede undersøgelser.
Indførelsen af piezoelektriske dispensere som en alternativ måde at anvende prøve på EM-net i Spotiton-systemet gjorde det muligt både præcist at målrette prøveaflejringen og kravet om en meget mindre prøvevolumen for at lave et gitter12. Senere fjernede brugen af nanowire-net og undervejs prøveapplikation (“on-the-fly” spotting) behovet for et blotting-trin og reducerede applikations-til-vitrifikation gange13,14. For den nye tilgang til tidsforklaret cryo-EM beskrevet her, en anden dispenser sammen med de nødvendige kontrol hardware og software opgraderinger blev tilføjet til Spotiton system til at muliggøre levering af en anden prøve på en bevægelig nanowire gitter næsten umiddelbart efter aflejring af de første15. De to overlappende prøver blandes på nettet, da de er onde af nanowires i et tyndt vandigt lag før vitrifikation. Blanding gange så lavt som 90 ms kan opnås. Denne protokol har til formål at give praktiske oplysninger om, hvordan man udfører tidsforsluttet eksperimenter ved hjælp af piezoelektriske dispensering og nanowire net. Da hardwaren og softwaren ændres for at forbedre brugervenligheden, konsistensen og gennemløbet, fungerer denne protokol også som en opdateret beskrivelse af den tidligere rapporterede metode15.
Denne protokol skitserer brugen af Spotiton robotsystem til at forberede gitre til cryo-EM billeddannelse, der bærer to prøver, generelt et protein af interesse og en aktiverende ligand, der er blevet blandet for 90-500 ms. Selvom arbejdsprocessen er ligetil, er der et par overvejelser, som brugeren skal huske på for at sikre en produktiv gittersession. For det første er det ikke ualmindeligt, at en af de piezoelektriske dispenserspidser bliver tilstoppede eller blokerede, der forhindrer den i at skyde. En sådan fejl vil resultere i en flydende stribe, set på billedoptagelser fra det øvre eller nedre kamera, hvilket er synligt smallere end det, der ses efter begge spidser fyret. En blokering kan skyldes en luftboble logi i spidsen, forstyrre dråbedannelse, eller fra proteinprøve, der er tørret ud og forseglet den smalle spids åbning. Selvom den indsugningsprøve går tabt i processen, kan begge problemer løses ved en ultralydsvask af spidserne og re-aspiration af prøven. For at forhindre efterfølgende tilstopning og prøveaffald er det afgørende at prime væskelinjerne grundigt før prøvehygge og at opretholde et højt og ensartet fugtighedsniveau i kammeret og ligklædet. Derudover kan en proteinprøve med en særlig høj koncentration påvirke tipfyring på trods af velholdt fugtighed. Selvom en forøgelse af affyrings amplituden under fanen Undersøg delvist kan kompensere for svag fyring på grund af høj proteinkoncentration, vil fortynding af prøven mindst 1:2 forbedre tipaffyring og undgå tilstopning.
For det andet kan det være svært at opnå den ideelle wicking hastighed, der er nødvendig for at generere is af optimal tykkelse for den målrettede blanding varighed. Generelt vil hurtigere blandingstider kræve hurtigere wicking, langsommere blandingstider kræver langsommere wicking. For det ideelt onde gitter er en flydende stribe tydeligt synlig i det øverste kamerabillede, mens kun en meget lille fortykkelse af gitterstængerne i striben forbliver synlig i det nederste kamera. Langsom fugttransport, angivet med en mørk stribe på det nederste kamerabillede, efterlader generelt is, der er for tyk til billeddannelse. Fravær af en stribe på begge billeder indikerer hurtigtransport, der måske ikke har efterladt vand i hullerne (Figur S5). Flere faktorer såsom nanowire tæthed, plasma rengøring indstillinger og varighed, og tidspunktet for eksponering for og indstillet niveau af kammer fugtighed kan påvirke svedtransporterende hastighed. Dårlig (langsom) wicking kan være resultatet af en sparsom belægning af nanowires på nettet. Ved at fortynde og øge eksponeringstiden for nanowire-løsningen16vil tætheden og dækningen af nanotråde på gitterstængerne stige, hvilket letter hurtigere fugt. Hvis nanowiretætheden er tilstrækkelig, vil en forøgelse af watt-indstillingen eller varigheden af plasmarensning også forbedre wicking. De indstillinger, der anbefales her, er relativt lav effekt og lang varighed, men kan ændres, hvis det er nødvendigt.
Men hvis både det specifikke parti af gitre og plasmarensningsindstillinger har fungeret godt i en tidligere session, kan der opstå langsom wicking-ydeevne som følge af overdreven eksponering af nanotråde for høj luftfugtighed i kammeret, hvilket fører til mætning med fugt og reduceret væskekapacitet. Den gittermættede effekt af kammerfugtens fugtighed kan reduceres ved enten at minimere den forløbne tid mellem pincetmontering og gitter, der kaster, eller ved at reducere systemets fugtighedsniveau før et dyk. Det skal dog bemærkes, at sidstnævnte bringer den tilhørende risiko for, at spidsen lastet med proteinprøve vil tilstoppe. For at opveje denne risiko kan det øge den tilladte tid at montere pincet, der holder et nyt gitter, hvis der holdes et højt fugtighedsniveau. Endelig skal det bemærkes, at en reduceret dyktid (opnået ved at øge gitteraccelerationen og/eller den maksimale hastighed) kan resultere i gitre med tyndere is uden faktisk at ændre gitterets svedtransporterende egenskaber. Men da blandingstiden for de to prøver også vil blive reduceret, er dyktiden ikke en faktor, der typisk ændres for at løse langsom wicking. For at løse svedtransport, der er for hurtig, hvilket resulterer i is, der enten er for tynd eller fraværende i gitterhullerne, kan det modsatte af de foranstaltninger, der er skitseret ovenfor, træffes.
Spotiton frembyder visse fordele og ulemper sammenlignet med andre teknikker udviklet til subsekund tid-løste undersøgelser. Da den blandede prøvestribe kun indeholder 2-4 nL væske fra hver dispenser, er en enkelt 3 μL-aliquot af hver prøve tilstrækkelig til at forberede mange gitre- en vigtig fordel, når prøven er begrænset. Derudover observation af prøveaflejring ved hjælp af integrerede kameraer, men ikke helt unik for Spotiton17, er ikke en funktion af andre blanding enheder og gør det muligt kastet gitre, der skal underkastes en rå pass / fail evaluering, i høj grad at reducere screening tid. En væsentlig ulempe ved systemet er en minimum blandingstid på 90 ms, begrænset af de fysiske begrænsninger af de mekaniske komponenter, der sætter forhør af hurtigere biologiske reaktioner uden for rækkevidde. Til sammenligning opnås gange mindre end 10 ms rutinemæssigt på eksisterende mikrofluidiske systemer. På Spotiton-baserede, kommercielt tilgængelige kamæleon system, design og konstruktion forbedringer har reduceret den mindste dyktid til 54 ms og øge muligheden for, at tilføjelsen af en anden dispenser kunne tillade hurtigere blanding gange end Spotiton kan i øjeblikket tilbyde.
Til dato er der udført en række eksperimenter for at undersøge tidlige, kortvarige molekylære tilstande ved hjælp af Spotiton, herunder samling af 70S ribosom, calcium-udløste kropsbygningsændringer i en transmembranionkanal og indsnævring af dynamin som reaktion på GTP hydrolyse15. Siden offentliggørelsen af disse resultater, flere ændringer er blevet indarbejdet i systemet for at forbedre gennemløb, reproducerbarhed, og rapportering af Spotiton grid-making sessioner. Disse omfatter blandt andet dual-zone, automatisk fugtighedsovervågnings- og kontrolsystem, eksperimentfremviserfunktionen, side om side tipinspektionsfunktionen og flere mindre opgraderinger til brugergrænsefladen. Det opgraderede system vil bedre støtte fremtidige to-prøve blanding eksperimenter svarende til dem, der tidligere er rapporteret samt hurtige bindende assays såsom mellem en lille-molekyle terapeutisk og dens protein mål eller endda antistof-antigen kompleks dannelse. Mens nuværende og fremtidige tidsfor løste eksperimenter, der involverer to interagerende partnere, helt sikkert vil fortsætte, kan tilføjelsen af en tredje piezoelektrisk dispenser og tilhørende hardware yderligere udvide rækken af mulige eksperimenter. For eksempel kan første aflejring af et vaskemiddel efterfulgt af interesseproteinet efterfulgt af den interagerende eller aktiverende ligand fjerne enhver potentiel negativ indvirkning af udvidet eksponering for vaskemidlet, ofte nødvendigt for at forhindre fælles suboptimale billeddannelsesresultater såsom foretrukken orientering. I lyset af både det allerede offentliggjorte arbejde og potentielle fremtidige anvendelser udgør Spotiton et vigtigt redskab for cryo-EM-samfundet til at lette gennemførelsen af igangværende tidsforberedt undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Peter A. Kahn og Terry Rohde på Engineering Arts LLC (Arizona, USA) for indledende design og efterfølgende udvikling af Spotiton-systemet. Vi takker personalet i Simons Electron Microscopy Center på New York Structural Biology Center for hjælp og teknisk support. Det arbejde, der præsenteres her blev udført på National Resource for Automated Molecular Microscopy placeret på New York Structural Biology Center, støttet af tilskud fra NIH (GM103310) og Simons Foundation (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |