Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.
Abstract
לכידת מצבים מולקולריים קצרי מועד המופעלים על ידי המפגש המוקדם של שני חלקיקים אינטראקציה או יותר ממשיכה להיות אתגר ניסיוני של עניין רב לתחום המיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM). פותחו כמה אסטרטגיות מתודולוגיות התומכות במחקרים "שנפתרו בזמן", שאחד מהם, Spotiton- מערכת רובוטית חדשנית - משלב את חלוקת טיפות הדגימה בגודל פיקוליטר עם שליטה זמנית ומרחבית מדויקת. זרימת העבודה של Spotiton שנפתרה בזמן מציעה גישה יעילה וייחודית לחקור סידורים מבניים מוקדמים מנפח דגימה מינימלי. מפוטר ממתקני פיזואלקטריים בשליטה עצמאית, שתי דגימות נוחתות ומתערבבות במהירות על רשת EM ננו-חוטית כשהיא צוללת לכיוון הקריוגן. מאות רשתות פוטנציאליות יכולות להיות מוכנות ברצף מהיר מכמה מיקרוליטרים של מדגם. כאן, פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב של הפעולה של מערכת Spotiton מוצג עם דגש על פתרון בעיות ספציפיות המתעוררות במהלך הכנת הרשת.
Introduction
הפוטנציאל של cryo-EM ללכוד ולחשוף מצבים קונפורמציה ארעית של חלבונים בציר הזמן תת שנייה (זמן נפתר cryo-EM) מומש על ידי מספר קבוצות, החל ברימן ו Unwin1 אשר הטכניקה שנבנתה על שיטת הקפאת הצלילה הסטנדרטית שפותחה על ידי Dubochet להכנת רשתות cryo-EM2. הם הוסיפו אטומיזר ממש מעל הקריוגן שהשתמש בגז חנקן דחוס כדי לרסס ערפל דק של דגימה שנייה על רשת EM צוללת המכילה דגימה ראשונה שהוחלה ונמחקה לשכבה מימית דקה. למרות שמערכת זו יכולה להשיג זמני ערבוב נמוכים כמו 1 אלפיות השנייה, היא עדיין דרשה חבטה ידנית של המדגם הראשון על ידי המשתמש - משימה מאתגרת מבחינה טכנית - ונפח גבוה יחסית של המדגם השני. יתר על כן, בפועל, היה קשה לדעת היכן התרחש ערבוב של שתי הדגימות, הדורש שימוש בננו-חלקיקי פריטין כסמן פי דו-שנתי במדגם המעורב. מאמצים מאוחרים יותר של הווארד ווייט ושותפיו לעבודה שיפרו את השליטה והשחזור של גישה זו של ריסוס ערבוב על ידי שילוב שליטה במחשב של השלבים3,4. כדי לטפל כמה טוב ואיפה הדגימות לערבב, אותה קבוצה5 ואחרים6,7,8,9,10 עברו לגישה ערבוב ריסוס11 שבו שתי דגימות מעורבבות או צינורות נימים צרים תחת הלחץ של משאבות מזרק או שבבים microfabricated, מיקרופלואידי מונע על ידי גז חנקן. מערכות premixing אלה לא רק להבטיח ערבוב מלא, אלא גם לאפשר כוונון עדין של זמני ערבוב כדי להגדיל את הרזולוציה של מחקרים שנפתרו בזמן.
כניסתם של מכשירי פיזואלקטריים כדרך חלופית להחיל מדגם על רשתות EM במערכת Spotiton אפשרה הן פילוח מדויק של תצהיר מדגם והן דרישה של נפח מדגם קטן בהרבה כדי להפוך את רשת12. מאוחר יותר, השימוש ברשתות ננו-חוטים ויישום לדוגמה בדרך ("תוך כדי תנועה" תצפית) הסיר את הצורך בשלב סופג וצמצם את היישום-ל-vitrification כפול13,14. עבור הגישה החדשה להקפאה-EM שנפתרה בזמן המתוארת כאן, מתקן שני יחד עם חומרת הבקרה הדרושה ושדרוגי תוכנה נוספו למערכת Spotiton כדי לאפשר משלוח של דגימה שנייה לרשת ננו-חוט נעה כמעט מיד לאחר התצהיר של15הראשונים . שתי הדגימות החופפות מתערבבות על הרשת מכיוון שהן מרושעות על ידי הננו-חוטים לשכבה מימית דקה לפני ההחלמה. ערבוב פעמים נמוך ככל 90 ms ניתן להשיג. פרוטוקול זה נועד לספק מידע מעשי לגבי אופן ביצוע ניסויים שנפתרו בזמן באמצעות חלוקה פיזואלקטרית ורשתות ננו-חוטים. בנוסף, כאשר החומרה והתוכנה משתנות כדי לשפר את קלות השימוש, העקביות והתפוקה, פרוטוקול זה משמש גם כתיאור עדכני של השיטה15שדווחה קודם לכן .
Protocol
1. הקימו את המכונה והתוכנה של Spotiton
- הכן את המערכת לחלוקה (איור 1).
- פתח את השסתום הראשי על מיכל אספקת החנקן. ודא שמאגר המערכת מלא במים מפורסמים במיוחד. הפעל את המחשב. הפעל את מערכת Spotiton במפסי החשמל הרב-אוטם.
- לחץ על סמל שולחן העבודה (איור 2A) כדי לפתוח את ממשק המשתמש (UI) של תוכנת Spotiton (איור 2B). בתפריט כלים, בחר את Initialize שלבים כדי לאתחל ולבית את הרובוטים תלת-צירים (שלב רשת ושלב פיפטה) ואת הרכבת ראש המתקן המסתובב (שלב תטא). ודאו שטיפים למתקן מצביעים כלפי מטה לפני האתחול והביות.
- בחלון הראשי, לחץ על עבור אל SafePosition כדי לשלוח את הרובוטים ל- SafePosition ( איור3).
הערה: המעבר ל- SafePosition יכול להיעשות עם רובוטים בכל עמדה ללא סיכון להתנגשות. - בכרטיסיה Aspirate, בחר Prime כדי לשטוף את ראשי המתקן מספר פעמים במים מהמאגר. המשך עד שניתן יהיה לראות זרמי מים ללא הפרעה מגיחים משני הטיפים.
הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על כך אם נפח משמעותי של אוויר נכנס לקווי הנוזל כאשר הטיפים היו שטפו עם מתנול בכיבוי האחרון.
- בדיקת ביצועי מתקן
- בכרטיסיה בדיקה, שלח כל טיפ למצלמת הבדיקה כדי לבדוק מי אש ולהתאים את דפוס ייצור הטיפות משני מכשירי המזון(איור S1).
הערה: אם טיפ נכשל לירות עקב בועה (איור S2A) או פסולת, לנקות את הטיפים בתחנת הכביסה (איור S2B) באמצעות פונקציית שטיפת אולטרה סאונד לגשת בכרטיסייה Aspirate. - התאם את משרעת הירי (ללא יחידה) עבור כל מתקן ודגימה כדי להשיג זרם של טיפות נפרדות בגודל עקבי.
- לאשר חזותית ייצור טיפה שווה ערך על ידי שני מכשירי.
- לחץ על לחצן הקלט בצג המצלמה העליון כדי להקליט סרטון של ירי של עצה 1. הפעל את הווידאו של טיפ 1 יורה בצג בצד ימין באותו הזמן עצה 2 נורה בצג המצלמה העליונה(איור S1).
הערה: סרטונים של כל ירי טיפים מוקלטים ומאוחסנים.
- לחץ על לחצן הקלט בצג המצלמה העליון כדי להקליט סרטון של ירי של עצה 1. הפעל את הווידאו של טיפ 1 יורה בצג בצד ימין באותו הזמן עצה 2 נורה בצג המצלמה העליונה(איור S1).
- מכשירי מתקן מוכנים עכשיו לבחון אש על רשת.
הערה: פרוטוקול זה מניח כי יישור נכון של שלבי הרשת והצינורות בעמדות הצלילה המתאימות שלהם אומת. אי אישור יישור נכון עלול לגרום להתנגשות, לפגוע בעצות או ברובוטים.
- בכרטיסיה בדיקה, שלח כל טיפ למצלמת הבדיקה כדי לבדוק מי אש ולהתאים את דפוס ייצור הטיפות משני מכשירי המזון(איור S1).
- מי אש מבחן על רשת.
- ודא שרובוטים נמצאים ב-SafePosition.
- הסר את הפינצטה מההרכב על רובוט הרשת באמצעות מפתח אלן שסופק.
- על ספסל סמוך, מקם רשת בדיקה, ננו-חוט בצד למעלה, בקצה בלוק הרשת. תפסו בזהירות את שפת הרשת, התמקם נכון בפינצטה(איור S3)וטען מחדש את פינצטה.
- בכרטיסיה Cryo, לחץ על עצה למצלמה כדי להעביר את העצות לשדה הראייה של מצלמת נתיב הצלילה העליונה(מצלמה עליונה). ודא ש-Live נבחר בצג המצלמה העליון, ונור המצלמה העליונה מופעל (חייג בחזית ארון המחשב (איור 1).
- תרכיב את פינצטה על רובוט הרשת. מקם עצה 1, הנראה בצג המצלמה העליונה, על-ידי לחיצה על העכבר בתוך הצג.
הערה: רק עצה 1 תהיה גלויה ותעבור למיקום הקליק. - לחץ על רשת למצלמה כדי למקם את הרשת מול המצלמה העליונה. כוונן את מיקום עצה 1 כבעבר, במידת הצורך.
- בחר Tip1, Tip2או Tip1 ו- Tip2 כדי לבחור אחד או שניהם מכשירי בדיקה.
הערה: בעת בדיקת העצות בנפרד, השתמש בעכבר כדי למקם את עצה 1 בצג המצלמה העליונה במיקומים לרוחב שונים ברשת. זה יפקיד פסים נוזליים משני הטיפים בתבנית שאינה חופפת ולאפשר למשתמש לאשר כל טיפ ירה. - בכרטיסיה Cryo, ודא שרשת Vitrify לא נבחרה, לחץ על יעד התורולאחר מכן על צלילה.
הערה: שלב הפיפטה יעלה מעט, ואחריו שלב הרשת. רובוט הרשת לאחר מכן צולל את הרשת על פני מכשירי הירי ומצלמות עליון ותחתונים, מגיע לנוח ממש מעל הסיפון. לכידת תמונה מהמצלמה העליונה מופיעה מעל לכידת תמונה מהמצלמה התחתונה בצד שמאל של ממשק המשתמש. - להעריך את התמונות העליונות והתחתון: האם כל קצה ירה כאשר נבחר? כאשר ירו יחד, האם הנוזל משני הטיפים חופף באופן מלא, יצירת פס עבה יותר באופן ניכר מאשר כאשר ירה בנפרד?
- אם אחד הטיפים נכשל לירות, לבצע מחזור לשטוף קולי אחד או מרובים עד ירי ברור הוא ציין.
- אם הפסים לדוגמה אינם חופפים באופן מלא, התאימו את היישור לרוחב של אחד המכשירים באמצעות מפתח אלן כדי להפוך את בורג ההתאמה לרוחב על אחד המכשירים רבע סיבוב, ולבצע צלילה בדיקה. חזור על הפעולה עד לפסים חופפים לחלוטין.
הערה: אם שני העצות נורו בהצלחה וכצפוי, המערכת מוכנה להכין רשתות מדגם.
2. הכן שתי רשתות מעורבות דו-מדגמיות
- עדכן את ערכי התאוצה, ההאטה והמהירות בקובץ XML של פרמטרי מחשב כדי להשיג את זמן הערבוב של העניין.
הערה: טבלאות התואמות ערכים אלה פעמים ערבוב דווחו בעבר15. - הכינו את הדגימה והרשתות.
הערה: מנקודה זו בפרוטוקול, 20-30 דקות יחלפו לפני הרשת הראשונה מוכנה, ודגימות צריך להישמר בטמפרטורה מתאימה במהלך מרווח זמן זה.- לדלל שתי דגימות (כלומר, חלבון, ליגנד או שותף אינטראקציה אחר) לריכוזים הרצויים עם חוצץ מתאים, באופן אידיאלי, זהה עבור שניהם.
הערה: רשתות Spotiton דורשות ריכוזים גבוהים פי 1.5-2 של חלבון מאשר בדרך כלל למקפיאי צלילה אוטומטיים. ייתכן שהסיבה לכך היא הזמן המינימלי שהחלבון מבלה בשכבה מימית דקה על פני הרשת במהלך צלילה, מה שנותן לחלקיקים פחות הזדמנות להתרכז בממשק מי האוויר. - ממלאים את קערת הקריוגן בחנקן נוזלי.
- רשת ננו-חוטים נקייה פלזמה 3-4. השתמש 5 W, מימן וחמצן, 1.5 דקות כנקודת התחלה.
הערה: משך ניקוי הפלזמה היעיל ביותר ומתכון עשוי להשתנות מיום ליום בהתבסס על טמפרטורת הסביבה ולחות ואת אצווה של רשתות nanowire בשימוש. תערובות גז חלופיות או פריקה זוהרת עשויות להיות יעילות גם כן, אך לא נבדקו למטרה זו. כמו מים וחלבון בתמיסת חיץ הם לעתים קרובות מרושעים במהירויות שונות על ידי nanowires, מומלץ להעריך את פתיל הרשתות לשמש באותו יום על צלילה שבה המדגם בפועל מחולק.
- לדלל שתי דגימות (כלומר, חלבון, ליגנד או שותף אינטראקציה אחר) לריכוזים הרצויים עם חוצץ מתאים, באופן אידיאלי, זהה עבור שניהם.
- הגדר את רמת הלחות במערכת.
הערה: בנוסף לתנאים המשמשים הן לעשות פלזמה לנקות את הרשתות, לחות היא גורם עיקרי נוסף המשפיע על מהירות פתיל של רשתות ננו-חוט. למרות שאחוז היעד של לחות עבור מפגש מסוים נקבע אמפירית עבור כל יום וקבוצה של רשתות, 90-95% היא נקודת התחלה טובה.- ודאו שהנבלייזר מלא מספיק במים אולטרה-תיבול. חבר את nebulizer, ולצפות האדים לצאת היציאה המרכזית על כובע nebulizer.
- צפה בצג הלחות החיה בחלון הראשי, או פתח את גשש הלחות הסביבה תחת דוחות | הסביבה (איור S4). בדוק את רמות הלחות בשני האזורים: קאמרי ותכריכים.
הערה: החדר כולל את כל האזורים בתוך מתחם Spotiton. תכריכים הוא האזור המקיף מיד את עמדות "במצלמה" של הרשת וטיפים מתקן. תכריכי השרף השחור שומרים על רמת הלחות שנקבעה כאשר דלתות המתחם נפתחות כדי לטעון רשת. - לאחר הגעת ערכי לחות היעד, שמור על ערכים אלה באופן אוטומטי או ידני מהכרטיסיה לחות. בחר פקד אוטומטיובחר נקודת קבע וסף כדי לשמור על נקודת הקבע בתוך מגבלת הסף שנבחרה. לחלופין, בחרו 'בקרה ידנית'והתאמו את רמת הלחות באמצעות שני פקדי המאוורר: מאוורר קאמרי ומאוורר תכריכים.
הערה: הפעלת מאוורר התא מושכת את האדים דרך מסנן בנמל השמאלי ומונעת מטפות מים גדולות יותר להיכנס לתא, ומונעת עלייה נוספת בלחות הסביבה. כל עוד דלתות התא יישארו סגורות, רמת הלחות תתייצב באחוז הרצוי. הפעלת מאוורר התכריכים מושכת את האדים דרך היציאה הימנית אל התכריכים. זה גם מפחית שחרור אדים לתוך התא ומגביר את רמת הלחות בתוך התכריכים.
- טען את הדגימה לתוך מכשירי.
- הוסף 5 μL של כל מדגם לתוך כוסות מדגם.
הערה: כדי להימנע מהכנסת בועות, מחלקים את הנפח בזהירות רבה על הקיר הצדדי הפנימי של הכוס, ואז לנער כלפי מטה כדי לכפות את המדגם לתחתית הכוס. - טען את כוסות הדגימה לתוך מגש ההחזקה, המדגם עבור עצה 1 בצד שמאל, עבור עצה 2 בצד ימין. דוחפים את המגש בחזרה למכונה עד שהוא יושב.
- בכרטיסיה Aspirate, בחר 3 μL כדי שאיפה של אמצעי האחסון על-ידי כל עצה. ודאו שמגש הדגימה יושב בבטחה, ואז לחצו על Aspirate ובחון כיצד שלב הפיפטה מזיז את ראשי המתקן לכוסות הדגימה.
- אמת שאיפה מוצלחת של שתי הדגימות על ידי הסרת כוסות המדגם והתבוננות בירידה ברמת הנוזל.
- בכרטיסיה בדיקה, שלח כל טיפ למצלמת הבדיקה כדי לאשר חלוקה ללא הפרעה. התאם את המשרעת לפי הצורך כדי להתאים את היווצרות טיפה מכל קצה (ראה סעיף 1.2).
הערה: סביר להניח שיהיה צורך להגדיל את המשרעת עבור הקצה שמחלק את דגימת החלבון. - המערכת מוכנה כעת להכין רשת מדגם.
- הוסף 5 μL של כל מדגם לתוך כוסות מדגם.
- הקפאת רשתות לדוגמה
- טען רשת פלזמה טרייה ניקה לתוך פינצטה, אבל לא לעלות פינצטה עדיין. ודא שרמת הלחות גבוהה, כ-90-95%. מלא את האתאן.
- בצע אש בדיקה סופית של שני הטיפים מול מצלמת הבדיקה, המאשרת שאין חסימה. בכרטיסיה קריו, לחץ על עצה למצלמה.
- מלא אתאן. אם נוצר קרח אתאן, נמסים לפי הצורך עם גז אתאן נוסף.
הערה: שלבים 2.5.4 ו- 2.5.5 צריכים להסתיים במהירות יחסית (<20 s) כדי למזער (i) את הרוויה של הננו-חוטים בלחות הגבוהה של התא ו- (ii) את הסבירות שהקצה שיורה את דגימת החלבון יתסתום. - הר את פינצטה עם הרשת על במת הרשת. בכרטיסיה קריו, לחץ על רשת למצלמה. ודא שקצה 1 ממוקם כראוי בצג המצלמה העליון (ראה שלבים 1.3.4-1.3.5).
- לחץ על רשת ויטרייפיי, יעד תור,ולאחר מכן לצלול. לחץ על אישור כאשר התבקש לפקד על רובוט הרשת לקפוץ את הרשת מאתאן לחנגן נוזלי ולשחרר אותו על המדף השקוע.
הערה: פינצטה ואז לעלות בחזרה לתוך החדר. לאחר הקפיצה לחנקן נוזלי, מופיעה הנחיה השואלת אם הרשת ירדה מהפינצטה. אם זה לא ירד, לחץ על לא, ואת פינצטה ייפתחו ולסגור מספר פעמים כדי לנתק את הרשת. - בדוק תמונות של הרשת (איור S5) כדי להחליט אם יש לשמור אותה או למחוק אותה.
- אם שומרים את הרשת, העבירו אותה לתיבת הרשת מקוררת מראש. לחלופין, לזהות רשתות עוקבות ולאחר מכן להעביר את כל הרשתות בבת אחת לתיבת הרשת, תוך דאגה כי כל רשת יכולה להיות מזוהה על ידי המיקום שלה באזור המנוחה.
- כדי להעביר את הרשת לתיבת רשת, מלקחיים עדינים קרירים מראש, תפסו בעדינות את הרשת בקצה ומניחים אותה בחריץ תיבת רשת, החל מהחריץ הראשון משמאל לחריץ שנושב בכיוון השעון.
- כאשר כל הרשתות נטענות, חבר את מכסה תיבת הרשת לכלי המכסה, וקדם-קול בחנקן נוזלי. הבריקו את המכסה על תיבת הרשת, והידקו בעזרת כלי מכסה או מברג מסול לפני השימוש.
- השתמש במלקחיים גדולים כדי להעביר במהירות את תיבת הרשת הסגורה ל- dewar קטן להדמיה או לאחסון לטווח ארוך.
- הערך התאמת רשת עבור הדמיה EM במורד הזרם.
- שים לב לתמונות ממצלמות נתיב הצלילה העליונות והתחתונות המוצגות בצד שמאל של ממשק המשתמש מיד לאחר שצוללת רשת. השתמש בתמונות אלה כדי להעריך את מהירות המנדלות, ירי מוצלח של שני הטיפים, ואת מידת החפיפה של שני פסי הדגימות.
- סקור והשווה את תמונות הרשת מהמצלמות העליונות והתחתונות יחד עם הגדרות המכונה ומדידות הלחות בזמן הצלילה באמצעות מציג הניסוי: דוחות | ניסוי.
- בחר רשתות להדמיה במיקרוסקופ האלקטרונים המדגימות ראיות של פתילות טובה.
Representative Results
איור 4 מציג תמונות של רשתות שהוכנו במהלך מפגש Spotiton יחיד שנפתר בזמן על ידי ערבוב RNA פולימראז ואוליגומר DNA 105 bp הנושא רצף מקדם עבור 150 ms לפני vitrification15. באיור נראים תמונות שצולמו על ידי שתי מצלמות מהירות של שש רשתות בשתי נקודות זמן בעקבות יישום לדוגמה. מצלמות אלה, ייחודיות בין מקפיאים בסגנון צלילה, מאפשרות למשתמש להחליט באופן מיידי אם לשמור או להשליך רשת בהתבסס על היקף הננו-חוטים הנצפה והסבירות שדגימות הנוזל נמשכו לשכבה מימית דקה מספיק להדמיית EM. למרות רשת אחת יכול לספק קרח מספיק עבור ערכת נתונים מלאה, לאחר התנאים האופטימליים הושגו, מספר רשתות מוכנות לשמור על היד במקרה אחד או יותר הולך לאיבוד או מזוהם. מתוך שש הרשתות שהוכנו בהפעלה זו, לכידות התמונה מציגות רק אחת עם מנדלות תת-אופטימליות(איור 4F).
הרשתות המוצגות הוכנו (שלבים 2.5.1 עד 2.5.8) ברצף על פני תקופה של 40 דקות לאחר שעה כדי להכין את הדגימות ואת המכונה כמתואר בפרוטוקול (שלבים 1.1.1 עד 2.4.6). מתוך שש הרשתות, שתיים שימשו לאיסוף נתונים, והשאר נשמרו לניתוח מאוחר יותר במידת הצורך. תבנית הקרח ברשת מנומרת(איור 5C)תואמת במידה רבה לתבנית הנוזל שהופקדה בתמונת המצלמה העליונה(איור 5B). פתילות יעיל של הדגימות המעורבות, המתברר בהיעדר פס נוזלי גלוי בתמונת המצלמה התחתונה (איור 5A), מתרחש לאורך מוטות הרשת המכוסים בננו-חוטים, ודוגימה לעתים רחוקות עולה על גדותיהם לריבועים הסמוכים לאלה שבהם הוא נחת. בתוך ריבועים מלאים בקרח, הקרח הוא בדרך כלל העבה ביותר בתוך חורים במרכז הריבוע ונעשה דק יותר בחורים קרובים יותר לסורגי הרשת(איור 5E). לעתים קרובות חורים הסמוכים לסורגי הרשת ריקים עקב קרבה לננו-חוטים(איור 5F).
איור 1: מערכת Spotiton שנפתרה בזמן. 1. תחנת העבודה של המפעיל; 2. חדר סביבתי; 3. אספקת חנקן; 4. אספקת אתאן 5. בקרת תאורה אחורית עבור מצלמת נתיב הצלילה העליונה 6. בקרי מתקן פיזואלקטרי; 7. משאבות מזרק; 8. משאבת ואקום; 9. לשטוף אספקת מים ובקבוקי פסולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ממשק משתמש של תוכנת Spotiton. (A)סמל שולחן העבודה ומסך הפתיחה. (B)ממשק המשתמש הראשי מורכב משישה אזורים: 1. אזור תצוגה לנתיב הצלילה העליון ("עליון") ומצלמות בדיקת קצה; 2. אזור תצוגה למצלמה של נתיב צלילה נמוך יותר ("נמוך יותר"; 3. אזור השמעה לסרטונים לבדיקת טיפים; 4. אזור כרטיסיות רב תכליתיות; 5. צג לחות חי; 6. קובץ יומן מערכת חי. קיצור: ממשק משתמש = ממשק משתמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבט פנימי על תא ספוטיטון (רובוטים ב SafePosition). 1. רובוט רשת (אדום); 2. רובוט מתקן (צהוב); 3. מצלמת נתיב צלילה עליונה (ורוד); 4. מצלמת נתיב צלילה נמוכה יותר (כחול בהיר); 5. מצלמת בדיקת טיפים (כתומה); 6. תכריכי לחות (ירוק); 7. מגש לדוגמה; 8. הרכבה נבולייזר (כחול כהה); 9. מאגר מערכת וקווי מים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של מצלמת מערכת מהפעלה של יצירת רשת Spotiton שנפתרה בזמן. (א -F) העליון (משמאל) והתחתון (מימין) לצלול תמונות מצלמת נתיב של שש רשתות שעליהן RNA פולימראז ורצף DNA מקדם הוחלו באמצעות Spotiton. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תבנית של תצהיר קרח על רשת שהוכנה על ידי Spotiton. חלקים מתמונות המצלמה התחתונה (A) ו- (B) העליונות ו - (C) אטלס של הרשת המוצגת באיור 4F. מיקומים משוערים של קרח הנובעים תצהיר מדגם וערבוב הם לבנדר צבעוני. אזורים בתוך הריבוע המסומנים בראש חץ צהוב מוצגים ב- (E-G). האזור המוצג ב- (E) הוא בקופסה בצהוב ב -D. ריבוע מייצג (E), חור (F) ו (G) תמונות חשיפה שנאספו מהרשת המוצגת ב (A-D). האזורים בקופסאות בתמונות הריבוע והחור תואמים לתמונות החור והחשיפה, בהתאמה. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-D), 5 מיקרומטר (E), 2 מיקרומטר(F),100 ננומטר(G). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 1: בדיקה של ירי טיפים. תצוגה חיה של ירי טיפ 2 נראית בצג המצלמה העליון בצד שמאל של ממשק המשתמש, בעוד הקלטה שנעשתה בעבר של טיפ 1 יורה משחקת בלולאה להשוואה באזור הפעלת הווידאו בצד ימין. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.
איור S2: ניקוי אולטרה סאונד של טיפים מתקן. בועת אוויר בקצה (A) תשבש את היווצרות הטיפות ותמנע ירי קצה. (B)טיפים שקועים במים בתחנת הניקוי הקולית כדי להסיר בועת אוויר או חלבון מיובש ברור חוסם את פתח הקצה. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.
איור S3: טעינת רשת פינצטה. (A)רשת הממוקמת בצד ננו-חוט בקצה בלוק הרשת. (B)רשת הממוקמת כראוי בפינצטה של סגירה עצמית. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.
איור S4: גשש לחות. אחוז הלחות היחסית בתא (כחול כהה) ותכריכים (כחול בהיר) כפי שנרשם במהלך מפגש ייצור רשת טיפוסי. הזמנים של צניחת רשת (ריבועים ירוקים) מתווים על הגרף. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.
איור S5: פתילה ברשתות ננו-חוט במהלך צלילה. ייצוג עליון(A, C, E)ונמוך (B, D, F) לצלול תמונות מצלמת נתיב של מנדלות על רשתות ננו-חוט כי הוא איטי מדי(A, B),אידיאלי (C, D),ומהר מדי(E, F). עיבוי קל (ראשי חץ לבנים) מציין מוטות רשת עם ננו-חוטים שהיו רוויים במדגם. ריבועים באזורים אלה מכילים בדרך כלל קרח בעובי מתאים להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן הורד קובץ זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת הרובוטית Spotiton להכנת רשתות להדמיה קריו-EM הנושאות שתי דגימות, בדרך כלל חלבון מעניין ולגנד מפעיל, שהיו מעורבים במשך 90-500 אלפיות השנייה. למרות שזרימת העבודה פשוטה, ישנם מספר שיקולים שהמשתמש חייב לזכור כדי להבטיח הפעלת ייצור רשת פרודוקטיבית. ראשית, זה לא נדיר עבור אחד טיפים מתקן piezoelectric להיות סתום או חסום מניעת הירי. כישלון כזה יגרום פס נוזלי, לראות על לכידות תמונה מהמצלמה העליונה או התחתונה, אשר צרה בעליל מזו שנראית לאחר שני הטיפים שנורו. חסימה יכולה לנבוע מלינה של בועת אוויר בקצה, משבשת את היווצרות הטיפות, או מדגם חלבון שהתייבש ואטם את פתח הקצה הצר. למרות המדגם שאפתן הולך לאיבוד בתהליך, שתי הבעיות ניתן לפתור על ידי לשטוף קולי של טיפים ושאיפה מחדש של המדגם. כדי למנוע סתימה ופסולת מדגם לאחר מכן, חיוני כדי טאג''י (סומק) של קווי הנוזלים לפני שאיפת המדגם ולשמור על רמת לחות גבוהה ועקבית בתוך התא והתכריכים. בנוסף, דגימת חלבון עם ריכוז גבוה במיוחד יכולה להשפיע על ירי טיפים למרות לחות מתוחזקת היטב. למרות שהגדלת משרעת הירי בכרטיסייה Inspect יכולה לפצות חלקית על ירי חלש בשל ריכוז חלבון גבוה, דילול המדגם לפחות 1:2 ישפר את ירי הטיפים וימנע סתימה.
שנית, זה יכול להיות קשה להשיג את מהירות פתיל אידיאלי כי הוא נחוץ כדי ליצור קרח של עובי אופטימלי עבור משך ערבוב ממוקד. בדרך כלל, זמני ערבוב מהירים יותר ידרשו פתילות מהירה יותר, זמני ערבוב איטיים יותר דורשים פתילות איטית יותר. עבור הרשת המרושעת באופן אידיאלי, פס נוזלי ניכר בבירור בתמונת המצלמה העליונה, ואילו במצלמה התחתונה, רק עיבוי קל מאוד של מוטות הרשת במיקום הפס נשאר גלוי. פתילות איטית, המצוינת על ידי פס כהה בתמונת המצלמה התחתונה, משאירה בדרך כלל קרח עבה מדי להדמיה. היעדר פס בכל אחת מהתמונות מצביע על פתילות מהירה שאולי לא הותירה מים בבורות(איור S5). מספר גורמים כגון צפיפות ננו-חוט, הגדרות ניקוי פלזמה ומשך זמן, וזמן החשיפה לרמה שנקבעה של לחות החדר יכול להשפיע על מהירות מנדף. מנדטים גרועים (איטיים) עשויים להיות תוצאה של ציפוי דליל של ננו-חוטים ברשת. על ידי דילול מעט והגדלת זמן החשיפה לפתרון nanowire16, הצפיפות והכיסוי של ננו-חוטים על סרגלי הרשת יגדלו, מה שמקל על פתילות מהירה יותר. אם צפיפות nanowire מספיק, הגדלת הגדרת ההספק או משך ניקוי פלזמה ישפר גם את פתיל. ההגדרות המומלצות כאן הן בעלות הספק נמוך יחסית ומשך זמן ארוך, אך עשויות להשתנות במידת הצורך.
עם זאת, אם הן אצווה ספציפית של רשתות והגדרות ניקוי פלזמה עבדו היטב בפגישה קודמת, ביצועים מנדפים איטיים עשויים לנבוע מחשיפה מוגזמת של nanowires ללחות גבוהה בתוך התא, מה שמוביל לרוויה שלהם עם לחות ויכולת החזקת נוזל מופחתת. ניתן להפחית את ההשפעה הרוויה של לחות החדר על ידי מזעור הזמן שחלף בין הרכבת פינצטה וצלילה ברשת או הפחתת רמת הלחות של המערכת לפני הצלילה. יש לציין, עם זאת, כי האחרון מביא את הסיכון הנלווה כי הקצה טעון עם דגימת חלבון יהיה סתימה. כדי לקזז את הסיכון הזה, החזקת הטיפים בתכריכים שבהם נשמרת רמת לחות גבוהה, יכול להגדיל את משך הזמן המותר להרכבה פינצטה מחזיק רשת חדשה. לבסוף, יש לציין כי זמן צלילה מופחת (מושגת על ידי הגדלת האצת הרשת ו /או מהירות מקסימלית) יכול לגרום לרשתות עם קרח דק מבלי לשנות בפועל את המאפיינים המנדדים של הרשת. עם זאת, כמו זמן ערבוב של שתי הדגימות גם יצומצם, זמן צלילה אינו גורם כי הוא השתנה בדרך כלל כדי לטפל פתיל איטי. כדי לטפל במנדטים מהירים מדי, וכתוצאה מכך קרח דק מדי או נעדר בחורי הרשת, ניתן לנקוט את ההפך מהצעדים שתוארו לעיל.
Spotiton מציג יתרונות וחסרונות מסוימים בהשוואה לטכניקות אחרות שפותחו עבור מחקרים שנפתרו בזמן תת-שניות. כמו פס מדגם מעורב מכיל רק 2-4 nL של נוזל מכל מתקן, aliquot יחיד 3 μL של כל מדגם מספיק כדי להכין רשתות רבות - יתרון מפתח כאשר המדגם מוגבל. בנוסף, התבוננות בתצהיר מדגם באמצעות מצלמות משולבות, אם כי לא לגמרי ייחודי Spotiton17, אינו תכונה של מכשירי ערבוב אחרים ומאפשר רשתות צלליות להיות נתון להערכת מעבר גס / להיכשל, צמצום משמעותי של זמן ההקרנה. חיסרון מרכזי אחד של המערכת הוא זמן ערבוב מינימלי של 90 אלפיות שני, מוגבל על ידי המגבלות הפיזיות של הרכיבים המכניים, המציב חקירה של תגובות ביולוגיות מהירות יותר מחוץ להישג יד. לשם השוואה, פעמים פחות מ 10 ms מושגים באופן שגרתי על מערכות מיקרופלואידיות קיימות. במערכת הזיקית המבוססת על Spotiton, הזמינה מסחרית, שיפורי תכנון ובנייה צמצמו את זמן הצלילה המינימלי ל-54 אלפיות השנייה ומעלה את האפשרות שתוספת של מתקן שני יכולה לאפשר זמני ערבוב מהירים יותר ממה שספוטיטון יכולה להציע כעת.
עד כה, מגוון של ניסויים נערך כדי לחקור מוקדם, מצבים מולקולריים קצרי מועד באמצעות Spotiton, כולל הרכבה של ריבוזום 70S, שינויים קונפורמציה מופעל סידן בערוץ יונים transmembrane, וכיווצ של דינמין בתגובה GTP הידרוליזה15. מאז פרסום תוצאות אלה, שולבו במערכת מספר שינויים כדי לשפר את התפוקה, השכפול והדיווח של מפגשי יצירת רשת Spotiton. אלה כוללים, בין היתר, את האזור הכפול, מערכת ניטור ובקרת לחות אוטומטית, תכונת מציג הניסוי, תכונת בדיקת הטיפים זה לצד זה ומספר שדרוגים קלים לממשק המשתמש. המערכת המשודרגת תתמוך טוב יותר בניסויי ערבוב עתידיים של שתי דוגמאות בדומה לאלו שדווחו בעבר, כמו גם בבדיקות כריכה מהירות כגון בין טיפול במולקולה קטנה לבין יעד החלבון שלו או אפילו היווצרות קומפלקס אנטיגן נוגדנים. בעוד שניסויים עדכניים ועתידיים שנפתרו בזמן הכוללים שני שותפים אינטראקציה בהחלט יימשכו, תוספת של מתקן פיזואלקטרי שלישי וחומרה נלווית עשויה להרחיב עוד יותר את טווח הניסויים האפשריים. לדוגמה, תצהיר ראשוני של חומר ניקוי ואחריו חלבון של עניין, ואחריו אינטראקציה או הפעלת ליגנד יכול להסיר כל השפעה שלילית פוטנציאלית של חשיפה ממושכת חומר הניקוי, לעתים קרובות הכרחי כדי למנוע תוצאות הדמיה תת-אופטימלית נפוצות כגון אוריינטציה מועדפת. לאור העבודה שכבר פורסמה והן יישומים עתידיים פוטנציאליים, Spotiton מייצג כלי חשוב עבור קהילת cryo-EM כדי להקל על ביצוע מחקרים שנפתרו בזמן תת-שניות.
Disclosures
B.C./C.S.P. יש מערכת יחסים מסחרית עם SPT Labtech, חברה המייצרת מכשיר זמין מסחרית, זיקית, המבוסס על אב טיפוס Spotiton.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לפיטר קאהן וטרי רודה בהנדסה ארטס LLC (אריזונה, ארה"ב) על התכנון הראשוני והפיתוח הבא של מערכת Spotiton. אנו מודים לצוות המרכז למיקרוסקופיה אלקטרונית סימונס במרכז לביולוגיה מבנית בניו יורק על עזרה ותמיכה טכנית. העבודה המוצגת כאן נערכה במשאב הלאומי למיקרוסקופיה מולקולרית אוטומטית הממוקמת במרכז לביולוגיה מבנית בניו יורק, בתמיכת מענקים מ- NIH (GM103310) וקרן סימונס (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
