Le protocole présenté ici décrit l’utilisation de Spotiton, un nouveau système robotique, pour livrer deux échantillons d’intérêt sur une grille de nanofils à mèche automatique qui se mélangent pendant au moins 90 ms avant la vitrification dans le cryogène liquide.
La capture d’états moléculaires à courte durée de vie déclenchée par la rencontre précoce de deux ou plusieurs particules en interaction continue d’être un défi expérimental d’un grand intérêt pour le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Quelques stratégies méthodologiques ont été développées qui soutiennent ces études « résolues dans le temps », dont l’une, Spotiton – un nouveau système robotique – combine la distribution de gouttelettes d’échantillon de la taille d’un picoliter avec un contrôle temporel et spatial précis. Le flux de travail Spotiton à résolution temporelle offre une approche particulièrement efficace pour interroger les réarrangements structurels précoces à partir d’un volume d’échantillon minimal. Tirés à partir de distributeurs piézoélectriques contrôlés indépendamment, deux échantillons atterrissent et se mélangent rapidement sur une grille EM de nanofils alors qu’il plonge vers le cryogène. Potentiellement, des centaines de grilles peuvent être préparées en succession rapide à partir de seulement quelques microlitres d’un échantillon. Ici, un protocole détaillé étape par étape du fonctionnement du système Spotiton est présenté en mettant l’accent sur le dépannage des problèmes spécifiques qui surviennent lors de la préparation du réseau.
Le potentiel de la cryo-EM pour capturer et révéler des états conformationnels transitoires des protéines sur l’échelle de temps inférieure à la seconde (cryo-EM résolue dans le temps) a été réalisé par plusieurs groupes, à commencer par Berriman et Unwin1 dont la technique s’est appuyée sur la méthode standard de congélation par plongeon développée par Dubochet pour préparer des grilles cryo-EM2. Ils ont ajouté un atomiseur juste au-dessus de la coupbe de cryogène qui utilisait de l’azote gazeux comprimé pour pulvériser une fine brume d’un deuxième échantillon sur une grille EM plongeante contenant un premier échantillon qui avait été appliqué et épongé sur une fine couche aqueuse. Bien que ce système puisse atteindre des temps de mélange aussi bas que 1 ms, il exigeait toujours un buvard manuel du premier échantillon par l’utilisateur – une tâche techniquement difficile – et un volume relativement élevé du deuxième échantillon. De plus, dans la pratique, il était difficile de savoir où le mélange des deux échantillons s’était produit, ce qui nécessitait l’utilisation de nanoparticules de ferritine comme marqueur fiduciaire dans l’échantillon mélangé. Les efforts ultérieurs de Howard White et de ses collègues ont amélioré le contrôle et la reproductibilité de cette approche de pulvérisation-mélange en incorporant le contrôle informatique des étapes de buvardage et de pulvérisation3,4. Pour savoir dans quelle mesure et où les échantillons se mélangent, le même groupe5 et les autres6,7,8,9,10 sont passés à une approche de mélange-pulvérisation11 dans laquelle deux échantillons sont mélangés soit dans des tubes capillaires étroits sous la pression de pompes à seringues, soit dans des puces microfabriquées microfluidiques entraînées par de l’azote gazeux. Ces systèmes de prémélange assurent non seulement un mélange complet, mais permettent également d’affiner les temps de mélange pour augmenter la résolution des études résolues dans le temps.
L’introduction de distributeurs piézoélectriques comme autre moyen d’appliquer l’échantillon aux grilles EM dans le système Spotiton a permis à la fois le ciblage précis des dépôts d’échantillons et l’exigence d’un volume d’échantillon beaucoup plus petit pour faire une grille12. Plus tard, l’utilisation de grilles de nanofils et l’application d’échantillons en route (repérage « à la volée ») ont éliminé le besoin d’une étape de buvard et réduit l’application à la vitrification multipliée par13,14. Pour la nouvelle approche de cryo-EM à résolution temporelle décrite ici, un deuxième distributeur ainsi que les mises à niveau matérielles et logicielles de contrôle nécessaires ont été ajoutés au système Spotiton pour permettre la livraison d’un deuxième échantillon sur une grille de nanofils en mouvement presque immédiatement après le dépôt des15premiers . Les deux échantillons qui se chevauchent se mélangent sur la grille car ils sont méchants par les nanofils en une fine couche aqueuse avant la vitrification. Des temps de mélange aussi bas que 90 ms peuvent être atteints. Ce protocole vise à fournir des informations pratiques sur la façon de mener des expériences résolues dans le temps en utilisant la distribution piézoélectrique et les grilles de nanofils. En outre, comme le matériel et les logiciels sont modifiés pour améliorer la facilité d’utilisation, la cohérence et le débit, ce protocole sert également de description à jour de la méthode15précédemment signalée.
Ce protocole décrit l’utilisation du système robotique Spotiton pour préparer des grilles pour l’imagerie cryo-EM qui transportent deux échantillons, généralement une protéine d’intérêt et un ligand activateur, qui ont été mélangés pendant 90 à 500 ms. Bien que le flux de travail soit simple, l’utilisateur doit garder à l’esprit quelques considérations pour garantir une session de création de grille productive. Tout d’abord, il n’est pas rare que l’une des pointes du distributeur piézoélectrique se bouche ou se bloque, l’empêchant de tirer. Une telle défaillance entraînera une bande liquide, vue sur les captures d’image de la caméra supérieure ou inférieure, qui est visiblement plus étroite que celle observée après le tir des deux pointes. Un blocage peut résulter d’un logement de bulle d’air dans la pointe, perturbant la formation de gouttelettes, ou d’un échantillon de protéines qui a séché et scellé l’orifice de la pointe étroite. Bien que l’échantillon aspiré soit perdu dans le processus, les deux problèmes peuvent être résolus par un lavage par ultrasons des pointes et une nouvelle aspiration de l’échantillon. Pour éviter le colmatage ultérieur et le gaspillage des échantillons, il est essentiel d’amorcer soigneusement (rincer) les conduites de fluide avant l’aspiration de l’échantillon et de maintenir un niveau d’humidité élevé et constant dans la chambre et le carénage. De plus, un échantillon de protéines avec une concentration particulièrement élevée peut affecter la cuisson de la pointe malgré une humidité bien entretenue. Bien que l’augmentation de l’amplitude de tir sur l’onglet Inspect puisse compenser partiellement la faible cuisson due à une concentration élevée en protéines, la dilution de l’échantillon au moins 1:2 améliorera la cuisson de la pointe et évitera le colmatage.
Deuxièmement, il peut être difficile d’atteindre la vitesse d’évacuation idéale nécessaire pour générer de la glace d’épaisseur optimale pour la durée de mélange ciblée. Généralement, des temps de mélange plus rapides nécessiteront une mèche plus rapide, des temps de mélange plus lents nécessiteront une mèche plus lente. Pour la grille idéalement méchante, une bande liquide est clairement discernable dans l’image de la caméra supérieure, tandis que dans la caméra inférieure, seul un très léger épaississement des barres de grille à l’emplacement de la bande reste visible. La mèche lente, indiquée par une bande sombre sur l’image inférieure de la caméra, laisse généralement de la glace trop épaisse pour l’imagerie. L’absence de bande sur l’une ou l’autre image indique une mèche rapide qui n’a peut-être laissé aucune eau dans les trous (Figure S5). Plusieurs facteurs tels que la densité des nanofils, les paramètres et la durée du nettoyage du plasma, ainsi que le temps d’exposition et le niveau défini d’humidité de la chambre peuvent affecter la vitesse de mèche. Une mauvaise mèche (lente) peut être le résultat d’un revêtement clairsemé de nanofils sur la grille. En diluant légèrement et en augmentant le temps d’exposition à la solution denanofils 16,la densité et la couverture des nanofils sur les barres de grille augmenteront, ce qui facilitera une évacuation plus rapide. Si la densité du nanofil est suffisante, l’augmentation du réglage en watts ou de la durée du nettoyage au plasma améliorera également l’évacuation. Les paramètres recommandés ici sont relativement peu puissants et de longue durée, mais peuvent être modifiés si nécessaire.
Cependant, si le lot spécifique de grilles et les paramètres de nettoyage au plasma ont bien fonctionné lors d’une séance précédente, des performances d’évacuation lentes peuvent résulter d’une exposition excessive des nanofils à une humidité élevée dans la chambre, entraînant leur saturation en humidité et une capacité de rétention de liquide réduite. L’effet de saturation de la grille de l’humidité de la chambre peut être réduit en minimisant le temps écoulé entre le montage de la pince et le plongeon de la grille ou en diminuant le niveau d’humidité du système avant un plongeon. Il convient toutefois de noter que ce dernier comporte le risque associé que la pointe chargée d’échantillon de protéines se bouche. Pour compenser ce risque, maintenir les pointes dans le carénage où un niveau d’humidité élevé est maintenu peut augmenter le temps autorisé pour monter une pince à épiler tenant une nouvelle grille. Enfin, il convient de noter qu’un temps de plongée réduit (obtenu en augmentant l’accélération de la grille et / ou la vitesse maximale) peut entraîner des grilles avec une glace plus mince sans réellement modifier les caractéristiques de mèche de la grille. Cependant, comme le temps de mélange des deux échantillons sera également réduit, le temps de plongée n’est pas un facteur qui est généralement modifié pour traiter la mèche lente. Pour remédier à la mèche trop rapide, entraînant une glace trop mince ou absente dans les trous de la grille, le contraire des mesures décrites ci-dessus peut être pris.
Spotiton présente certains avantages et inconvénients par rapport à d’autres techniques développées pour des études résolues dans un temps inférieur à la seconde. Comme la bande d’échantillon mélangée ne contient que 2 à 4 nL de liquide provenant de chaque distributeur, une seule aliquote de 3 μL de chaque échantillon est suffisante pour préparer de nombreuses grilles – un avantage clé lorsque l’échantillon est limité. De plus, l’observation des dépôts d’échantillons à l’aide de caméras intégrées, bien qu’elle ne soit pas entièrement unique à Spotiton17,n’est pas une caractéristique des autres dispositifs de mélange et permet aux grilles plongeantes d’être soumises à une évaluation brute de réussite / échec, ce qui réduit considérablement le temps de criblage. L’un des principaux inconvénients du système est un temps de mélange minimum de 90 ms, limité par les limitations physiques des composants mécaniques, qui met hors de portée l’interrogation des réactions biologiques plus rapides. En comparaison, des temps inférieurs à 10 ms sont régulièrement atteints sur les systèmes microfluidiques existants. Sur le système caméléon basé sur Spotiton, disponible dans le commerce, les améliorations apportées à la conception et à la construction ont réduit le temps de plongée minimum à 54 ms et soulèvent la possibilité que l’ajout d’un deuxième distributeur permette des temps de mélange plus rapides que ceux que Spotiton peut actuellement offrir.
À ce jour, une série d’expériences ont été menées pour étudier les états moléculaires précoces et de courte durée à l’aide de Spotiton, y compris l’assemblage du ribosome 70S, les changements conformationnels déclenchés par le calcium dans un canal ionique transmembranaire et la constriction de la dynamine en réponse à l’hydrolyse GTP15. Depuis la publication de ces résultats, plusieurs modifications ont été apportées au système afin d’améliorer le débit, la reproductibilité et le reporting des sessions de création de grille Spotiton. Ceux-ci incluent, entre autres, le système de surveillance et de contrôle automatique de l’humidité à deux zones, la fonction de visionneuse d’expérience, la fonction d’inspection de pointe côte à côte et plusieurs mises à niveau mineures de l’interface utilisateur. Le système amélioré permettra de mieux prendre en charge les futures expériences de mélange à deux échantillons similaires à celles précédemment rapportées, ainsi que les essais de liaison rapide, par exemple entre une thérapie à petite molécule et sa cible protéique ou même la formation d’un complexe anticorps-antigène. Bien que les expériences actuelles et futures résolues dans le temps impliquant deux partenaires en interaction se poursuivront certainement, l’ajout d’un troisième distributeur piézoélectrique et du matériel associé pourrait élargir davantage la gamme d’expériences possibles. Par exemple, le dépôt initial d’un détergent suivi de la protéine d’intérêt, suivi du ligand en interaction ou en activation, pourrait éliminer tout impact négatif potentiel d’une exposition prolongée au détergent, souvent nécessaire pour éviter les résultats d’imagerie sous-optimaux courants tels que l’orientation préférée. À la lumière des travaux déjà publiés et des applications futures potentielles, Spotiton représente un outil important pour la communauté cryo-EM afin de faciliter la conduite d’études résolues dans un temps inférieur à la seconde.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Peter A. Kahn et Terry Rohde de Engineering Arts LLC (Arizona, États-Unis) pour la conception initiale et le développement ultérieur du système Spotiton. Nous remercions le personnel du Simons Electron Microscopy Center du New York Structural Biology Center pour son aide et son soutien technique. Les travaux présentés ici ont été menés au National Resource for Automated Molecular Microscopy situé au New York Structural Biology Center, soutenu par des subventions du NIH (GM103310) et de la Simons Foundation (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |