O protocolo aqui apresentado descreve o uso do Spotiton, um novo sistema robótico, para entregar duas amostras de interesse em uma grade de nanofios que se misturam por um mínimo de 90 ms antes da vitrificação em criogen líquido.
A captura de estados moleculares de curta duração desencadeada pelo encontro precoce de duas ou mais partículas interativas continua a ser um desafio experimental de grande interesse para o campo da microscopia crio-elétron (crio-EM). Foram desenvolvidas algumas estratégias metodológicas que suportam esses estudos “resolvidos no tempo”, um dos quais, Spotiton-um novo sistema robótico, combina a dispensação de gotículas amostrais do tamanho de picoliter com controle temporal e espacial preciso. O fluxo de trabalho Spotiton resolvido com o tempo oferece uma abordagem exclusivamente eficiente para interrogar rearranjos estruturais precoces a partir do volume mínimo da amostra. Disparados de distribuidores piezoelétricos controlados independentemente, duas amostras pousam e se misturam rapidamente em uma grade EM nanofios enquanto mergulha em direção ao criógeno. Potencialmente centenas de grades podem ser preparadas em rápida sucessão a partir de apenas alguns microliters de uma amostra. Aqui, um protocolo passo-a-passo detalhado da operação do sistema Spotiton é apresentado com foco na solução de problemas específicos que surgem durante a preparação da grade.
O potencial para que o crio-EM capture e revele estados conformacionais transitórios de proteínas na escala de tempo sub-segundo (crio-EM resolvido pelo tempo) foi realizado por vários grupos, começando por Berriman e Unwin1 cuja técnica foi construída sobre o método padrão de congelamento de mergulho desenvolvido por Dubochet para a preparação das grades crio-EM2. Eles adicionaram um atomizador logo acima do copo de criogen que usou gás nitrogênio comprimido para pulverizar uma névoa fina de uma segunda amostra em uma grade EM mergulhando contendo uma primeira amostra que havia sido aplicada e borrada em uma fina camada aquosa. Embora este sistema pudesse alcançar tempos de mistura tão baixos quanto 1 ms, ele ainda exigia a mancha manual da primeira amostra pelo usuário – uma tarefa tecnicamente desafiadora – e um volume relativamente alto da segunda amostra. Além disso, na prática, era difícil saber onde havia ocorrido a mistura das duas amostras, exigindo o uso de nanopartículas de ferritina como marcador fiduciário na amostra mista. Os esforços subsequentes de Howard White e colegas de trabalho melhoraram o controle e a reprodutibilidade dessa abordagem de mistura de pulverização, incorporando o controle computacional das etapas de mancha e pulverização3,4. Para abordar o quão bem e onde as amostras se misturam, o mesmo grupo5 e outros6,7,8,9,10 mudaram para uma abordagem de pulverização de mistura11 em que duas amostras são misturadas em tubos capilares estreitos sob a pressão de bombas de seringa ou em chips microfabridados microfluidos conduzidos por gás nitrogênio. Esses sistemas de pré-mistura não só garantem a mistura completa, mas também permitem o ajuste fino dos tempos de mistura para aumentar a resolução de estudos resolvidos pelo tempo.
A introdução de distribuidores piezoelétricos como uma maneira alternativa de aplicar amostra às redes EM no sistema Spotiton permitiu tanto o direcionamento preciso da deposição amostral quanto a exigência de um volume amostral muito menor para fazer uma grade12. Posteriormente, o uso de grades de nanofios e aplicação de amostra em rota (“spotting on-the-fly”) removeu a necessidade de uma etapa de mancha e reduziu o vezes de aplicação para vitrificação13,14. Para a nova abordagem para crio-EM resolvida pelo tempo descrita aqui, um segundo dispensador juntamente com os upgrades de hardware e software de controle necessários foram adicionados ao sistema Spotiton para permitir a entrega de uma segunda amostra em uma grade de nanofios móveis quase imediatamente após a deposição dos primeiros15. As duas amostras sobrepostas se misturam na grade, pois são perversas pelos nanofios em uma fina camada aquosa antes da vitrificação. Tempos de mistura tão baixos quanto 90 ms podem ser alcançados. Este protocolo pretende fornecer informações práticas sobre como realizar experimentos resolvidos com o tempo usando redes piezoelétricas e nanofios. Além disso, como o hardware e o software estão sendo modificados para melhorar a facilidade de uso, consistência e throughput, este protocolo também serve como uma descrição atualizada do método15relatado anteriormente .
Este protocolo descreve o uso do sistema robótico Spotiton para preparar grades para imagens crio-EM que carregam duas amostras, geralmente uma proteína de interesse e um ligante ativador, que foram misturados para 90-500 ms. Embora o fluxo de trabalho seja simples, existem algumas considerações que o usuário deve ter em mente para garantir uma sessão produtiva de fabricação de grade. Em primeiro lugar, não é incomum que uma das pontas do dispensador piezoelétrico fique entupida ou bloqueada impedindo que ela dispare. Tal falha resultará em uma faixa líquida, vista em capturas de imagem da câmera superior ou inferior, que é visivelmente mais estreita do que a vista após ambas as pontas disparadas. Um bloqueio pode resultar de uma entrada de bolha de ar na ponta, interrompendo a formação de gotículas, ou de uma amostra de proteína que secou e selou o orifício de ponta estreita. Embora a amostra aspirada seja perdida no processo, ambos os problemas podem ser resolvidos por uma lavagem ultrassônica das pontas e a ressusida da amostra. Para evitar o entupimento subsequente e resíduos amostrais, é crucial que o topo das linhas de fluidos antes da aspiração da amostra e mantenha um nível de umidade alto e consistente dentro da câmara e da mortalha. Além disso, uma amostra de proteína com uma concentração particularmente alta pode afetar a queima de ponta, apesar da umidade bem conservada. Embora o aumento da amplitude de disparo na guia Inspect possa compensar parcialmente o disparo fraco devido à alta concentração de proteínas, diluir a amostra pelo menos 1:2 melhorará o disparo de ponta e evitará entupimento.
Em segundo lugar, pode ser difícil alcançar a velocidade ideal de pavio necessária para gerar gelo de espessura ideal para a duração da mistura direcionada. Geralmente, tempos de mistura mais rápidos exigirão um pavimento mais rápido, tempos de mistura mais lentos requerem pavio mais lento. Para a grade idealmente perversa, uma faixa líquida é claramente discernível na imagem da câmera superior, enquanto na câmera inferior, apenas um leve espessamento das barras de grade na localização da listra permanece visível. O pavio lento, indicado por uma faixa escura na imagem da câmera inferior, geralmente deixa gelo muito espesso para a imagem. A ausência de uma listra em qualquer imagem indica pavio rápido que pode não ter deixado água nos orifícios(Figura S5). Vários fatores como densidade de nanofios, configurações de limpeza de plasma e duração, e tempo de exposição e nível definido de umidade da câmara podem afetar a velocidade de pavio. O pavio ruim (lento) pode ser o resultado de um revestimento esparso de nanofios na grade. Ao diluir ligeiramente e aumentar o tempo de exposição à solução de nanofios16,a densidade e a cobertura de nanofios nas barras de grade aumentarão, facilitando o pavio mais rápido. Se a densidade de nanofios for suficiente, aumentar a configuração de wattage ou a duração da limpeza plasmática também melhorará a ad vime. As configurações recomendadas aqui são relativamente baixa potência e longa duração, mas podem ser alteradas se necessário.
No entanto, se tanto o lote específico de grades quanto as configurações de limpeza de plasma funcionaram bem em uma sessão anterior, o desempenho lento pode surgir da exposição excessiva dos nanofios à alta umidade dentro da câmara, levando à sua saturação com umidade e capacidade reduzida de retenção líquida. O efeito saturador da grade da umidade da câmara pode ser reduzido minimizando o tempo decorrido entre a montagem da pinça e a queda da grade ou a diminuição do nível de umidade do sistema antes de um mergulho. Deve-se notar, no entanto, que este último traz o risco associado de que a ponta carregada com amostra de proteínas obstrua. Para compensar esse risco, segurar as pontas na mortalha onde um alto nível de umidade é mantido, pode aumentar o tempo permitido para montar pinças segurando uma nova grade. Finalmente, deve-se notar que um tempo reduzido de mergulho (alcançado pelo aumento da aceleração da grade e/ou velocidade máxima) pode resultar em grades com gelo mais fino sem realmente alterar as características de pavio da grade. No entanto, como o tempo de mistura das duas amostras também será reduzido, o tempo de mergulho não é um fator que normalmente é alterado para lidar com a delírio lento. Para abordar o pavio que é muito rápido, resultando em gelo que é muito fino ou ausente nos orifícios da grade, o oposto das medidas acima descritas pode ser tomada.
Spotiton apresenta certas vantagens e desvantagens quando comparado com outras técnicas desenvolvidas para estudos subssegundos resolvidos no tempo. Como a faixa de amostra mista contém apenas 2-4 nL de líquido de cada dispensador, uma única alíquota de 3 μL de cada amostra é suficiente para preparar muitas grades – uma vantagem chave quando a amostra é limitada. Além disso, a observação da deposição amostral usando câmeras integradas, embora não totalmente exclusiva do Spotiton17,não é uma característica de outros dispositivos de mistura e permite que grades mergulhadas sejam submetidas a uma avaliação bruta de passe/falha, reduzindo consideravelmente o tempo de triagem. Uma das principais desvantagens do sistema é um tempo mínimo de mistura de 90 ms, restrito pelas limitações físicas dos componentes mecânicos, que coloca o interrogatório de reações biológicas mais rápidas fora de alcance. Em comparação, vezes menos de 10 ms são rotineiramente alcançados em sistemas microfluidos existentes. No sistema camaleão, com base no Spotiton, melhorias no design e construção reduziram o tempo mínimo de mergulho para 54 ms e levantaram a possibilidade de que a adição de um segundo dispensador poderia permitir tempos de mixagem mais rápidos do que o Spotiton pode oferecer atualmente.
Até o momento, uma série de experimentos foram realizados para investigar estados moleculares de curta duração usando spotiton, incluindo a montagem do ribossomo 70S, alterações conformais desencadeadas por cálcio em um canal de íons transmembranos, e constrição de dinamismo em resposta à hidrólise GTP15. Desde a publicação desses resultados, várias mudanças foram incorporadas ao sistema para melhorar o throughput, a reprodutibilidade e o relatório das sessões de fabricação de grades spotiton. Estes incluem, entre outros, o sistema de controle e monitoramento automático de umidade, o recurso de visualização de experimentos, o recurso de inspeção de ponta lado a lado e várias pequenas atualizações para a interface do usuário. O sistema atualizado suportará melhor futuros experimentos de mistura de duas amostras semelhantes aos relatados anteriormente, bem como ensaios de ligação rápida, como entre uma pequena molécula terapêutica e seu alvo proteico ou mesmo formação complexa de anticorpos-anticorpos. Embora os experimentos atuais e futuros resolvidos com o tempo envolvendo dois parceiros interagindo certamente continuem, a adição de um terceiro distribuidor piezoelétrico e hardware associado poderia ampliar ainda mais o leque de possíveis experimentos. Por exemplo, a deposição inicial de um detergente seguido pela proteína de interesse, seguida pelo ligante interagindo ou ativando poderia remover qualquer impacto negativo potencial de exposição prolongada ao detergente, muitas vezes necessário para evitar desfechos comuns de imagem subótimal, como orientação preferencial. À luz tanto do trabalho já publicado quanto de potenciais aplicações futuras, o Spotiton representa uma ferramenta importante para a comunidade crio-EM facilitar a realização de estudos subssegundos resolvidos no tempo.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Peter A. Kahn e Terry Rohde na Engineering Arts LLC (Arizona, EUA) pelo projeto inicial e posterior desenvolvimento do sistema Spotiton. Agradecemos à equipe do Centro de Microscopia Eletrônica Simons do Centro de Biologia Estrutural de Nova York por ajuda e suporte técnico. O trabalho aqui apresentado foi realizado no National Resource for Automated Molecular Microscopy localizado no Centro de Biologia Estrutural de Nova York, apoiado por subsídios do NIH (GM103310) e da Fundação Simons (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |