Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.
Het vastleggen van kortstondige moleculaire toestanden veroorzaakt door de vroege ontmoeting van twee of meer interagerende deeltjes blijft een experimentele uitdaging van groot belang voor het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Er zijn een paar methodologische strategieën ontwikkeld die deze “tijd-opgeloste” studies ondersteunen, waarvan er één, Spotiton – een nieuw robotsysteem – de afgifte van picoliter-sized monsterdruppels combineert met nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle. De tijd-opgeloste Spotiton-workflow biedt een unieke efficiënte aanpak om vroege structurele herschikkingen te ondervragen vanuit een minimaal monstervolume. Gebakken vanuit onafhankelijk gecontroleerde piëzo-elektrische dispensers, landen twee monsters en mengen zich snel op een nanodraad EM-raster terwijl het naar het cryogene water stort. Mogelijk kunnen honderden roosters snel achter elkaar worden bereid uit slechts enkele microliters van een monster. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol van de werking van het Spotiton-systeem gepresenteerd met een focus op het oplossen van specifieke problemen die zich voordoen tijdens de voorbereiding van het net.
Het potentieel voor cryo-EM om voorbijgaande conformatietoestanden van eiwitten op de subseconde tijdschaal (tijd-opgeloste cryo-EM) vast te leggen en te onthullen, is gerealiseerd door verschillende groepen, te beginnen met Berriman en Unwin1, waarvan de techniek is gebaseerd op de standaard plunge freezing-methode ontwikkeld door Dubochet voor het bereiden van cryo-EM-rasters2. Ze voegden een verstuiver toe net boven de cryogene beker die samengeperst stikstofgas gebruikte om een fijne nevel van een tweede monster op een kelderend EM-rooster te spuiten met een eerste monster dat was aangebracht en uitgeveegd op een dunne waterige laag. Hoewel dit systeem mengtijden tot 1 ms kon bereiken, vereiste het nog steeds handmatige vloeiing van het eerste monster door de gebruiker – een technisch uitdagende taak – en een relatief hoog volume van het tweede monster. Bovendien was het in de praktijk moeilijk om te weten waar vermenging van de twee monsters had plaatsgevonden, waardoor ferritine nanodeeltjes als fiduciële marker in het gemengde monster moesten worden gebruikt. Latere inspanningen van Howard White en collega’s verbeterden de controle en reproduceerbaarheid van deze spuit-mengbenadering door computerbesturing van de devlott- en spuitstappen3,4opte nemen. Om aan te pakken hoe goed en waar de monsters mengen, zijn dezelfde groep5 en anderen6,7,8,9,10 overgestapt op een meng-spuitbenadering11 waarbij twee monsters worden gemengd in smalle capillaire buizen onder druk van spuitpompen of in microgefabriceerde, microfluïdische chips aangedreven door stikstofgas. Deze voormengsystemen zorgen niet alleen voor een volledige menging, maar maken ook de fijnafstelling van mengtijden mogelijk om de resolutie van tijdsgeo opgeloste studies te verhogen.
De introductie van piëzo-elektrische dispensers als een alternatieve manier om monsters toe te passen op EM-rasters in het Spotiton-systeem maakte zowel de precieze targeting van monsterdepositie mogelijk als de vereiste van een veel kleiner monstervolume om een raster te maken12. Later nam het gebruik van nanodraadroosters en en-route monstertoepassing (“on-the-fly” spotting) de noodzaak van een blotting-stap weg en verminderde toepassing-naar-vitrificatietijden13,14. Voor de nieuwe benadering van tijd-opgeloste cryo-EM die hier wordt beschreven, werd een tweede dispenser samen met de nodige besturingshardware en software-upgrades toegevoegd aan het Spotiton-systeem om de levering van een tweede monster op een bewegend nanodraadraster vrijwel onmiddellijk na afzetting van de eerste15mogelijk te maken . De twee overlappende monsters mengen zich op het rooster omdat ze door de nanodraden in een dunne waterige laag worden gebracht voorafgaand aan vitrificatie. Mengtijden zo laag als 90 ms kunnen worden bereikt. Dit protocol is bedoeld om praktische informatie te verstrekken over het uitvoeren van tijd-opgeloste experimenten met behulp van piëzo-elektrische dispensing en nanodraadroosters. Aangezien de hardware en software worden aangepast om het gebruiksgemak, de consistentie en de doorvoer te verbeteren, dient dit protocol ook als een up-to-date beschrijving van de eerder gerapporteerde methode15.
Dit protocol schetst het gebruik van het Spotiton-robotsysteem om rasters voor cryo-EM-beeldvorming voor te bereiden die twee monsters dragen, over het algemeen een eiwit van belang en een activerend ligand, die gedurende 90-500 ms zijn gemengd. Hoewel de workflow eenvoudig is, zijn er een paar overwegingen die de gebruiker in gedachten moet houden om een productieve sessie voor het maken van rasters te garanderen. Ten eerste is het niet ongebruikelijk dat een van de piëzo-elektrische dispensertips verstopt raakt of geblokkeerd raakt, waardoor deze niet kan vuren. Zo’n storing zal resulteren in een vloeibare streep, te zien op beeldopnamen van de bovenste of onderste camera, die zichtbaar smaller is dan die gezien nadat beide tips zijn afgevuurd. Een verstopping kan het gevolg zijn van een luchtbel in de punt, waardoor de vorming van druppels wordt verstoord, of van eiwitmonster dat is uitgedroogd en de smalle puntopening heeft afgesloten. Hoewel het aangezogen monster tijdens het proces verloren gaat, kunnen beide problemen worden opgelost door een ultrasone wassing van de uiteinden en heraspiratie van het monster. Om daaropvolgende verstopping en monsterverspilling te voorkomen, is het van cruciaal belang om de vloeistofleidingen grondig te primen (spoelen) voorafgaand aan de monsteraspiratie en om een hoge en consistente luchtvochtigheid in de kamer en de lijkwade te handhaven. Bovendien kan een eiwitmonster met een bijzonder hoge concentratie het bakken van de punt beïnvloeden, ondanks een goed onderhouden vochtigheid. Hoewel het verhogen van de stookamplitude op het tabblad Inspect gedeeltelijk kan compenseren voor zwak vuren als gevolg van een hoge eiwitconcentratie, zal het verdunn van het monster ten minste 1: 2 het bakken van de punt verbeteren en verstopping voorkomen.
Ten tweede kan het moeilijk zijn om de ideale afvoersnelheid te bereiken die nodig is om ijs van optimale dikte te genereren voor de beoogde mengduur. Over het algemeen vereisen snellere mengtijden een snellere afvoer, langzamere mengtijden vereisen een langzamere afvoer. Voor het idealiter slechte raster is een vloeibare streep duidelijk waarneembaar in het bovenste camerabeeld, terwijl in de onderste camera slechts een zeer lichte verdikking van de rasterbalken op de locatie van de streep zichtbaar blijft. Langzame wicking, aangegeven door een donkere streep op het onderste camerabeeld, laat over het algemeen ijs achter dat te dik is voor beeldvorming. Afwezigheid van een streep op beide afbeeldingen duidt op een snelle afvoer die mogelijk geen water in de gaten heeft achtergelaten(figuur S5). Verschillende factoren zoals nanodraaddichtheid, plasmareinigingsinstellingen en -duur en tijd van blootstelling aan en ingestelde kamervochtigheid kunnen de afvoersnelheid beïnvloeden. Slechte (langzame) afvoer kan het gevolg zijn van een schaarse coating van nanodraden op het rooster. Door de tijd van blootstelling aan de nanodraadoplossing licht te verdunnen en te verlengen16, zal de dichtheid en dekking van nanodraden op de roosterbalken toenemen, waardoor snellere afvoer mogelijk wordt. Als de nanodraaddichtheid voldoende is, zal het verhogen van de wattage-instelling of de duur van plasmareiniging ook de afvoer verbeteren. De instellingen die hier worden aanbevolen, zijn relatief laag vermogen en lange duur, maar kunnen indien nodig worden gewijzigd.
Als echter zowel de specifieke batch roosters als plasmareinigingsinstellingen goed hebben gewerkt in een eerdere sessie, kunnen langzame afvoerprestaties het gevolg zijn van overmatige blootstelling van de nanodraden aan een hoge luchtvochtigheid in de kamer, wat leidt tot hun verzadiging met vocht en verminderde vloeistofvasthoudende capaciteit. Het rasterverzadigende effect van de luchtvochtigheid in de kamer kan worden verminderd door de verstreken tijd tussen pincetmontage en roosterduiken te minimaliseren of door de luchtvochtigheid van het systeem voorafgaand aan een duik te verlagen. Opgemerkt moet echter worden dat dit laatste het bijbehorende risico met zich meebrengt dat de tip geladen met eiwitmonster verstopt zal zijn. Om dit risico te compenseren, kan het vasthouden van de uiteinden in de lijkwade waar een hoge luchtvochtigheid wordt gehandhaafd, de toegestane hoeveelheid tijd verlengen om een pincet te monteren met een nieuw rooster. Ten slotte moet worden opgemerkt dat een kortere duiktijd (bereikt door het verhogen van de netversnelling en / of maximale snelheid) kan resulteren in rasters met dunner ijs zonder de afvoerkarakteristieken van het raster daadwerkelijk te veranderen. Omdat de mengtijd van de twee monsters echter ook zal worden verkort, is de duiktijd geen factor die meestal wordt gewijzigd om langzame wicking aan te pakken. Om de afvoer aan te pakken die te snel is, met ijs tot gevolg dat te dun of afwezig is in de roostergaten, kan het tegenovergestelde van de hierboven geschetste maatregelen worden genomen.
Spotiton presenteert bepaalde voor- en nadelen in vergelijking met andere technieken die zijn ontwikkeld voor subseconde tijd-opgeloste studies. Aangezien de gemengde monsterstreep slechts 2-4 nL vloeistof uit elke dispenser bevat, is een enkele aliquot van 3 μL van elk monster voldoende om veel roosters te bereiden – een belangrijk voordeel wanneer het monster beperkt is. Bovendien is observatie van monsterafzetting met behulp van geïntegreerde camera’s, hoewel niet helemaal uniek voor Spotiton17,geen kenmerk van andere mengapparaten en maakt het mogelijk om ondergedompelde roosters te onderwerpen aan een ruwe pass / fail-evaluatie, waardoor de screeningstijd aanzienlijk wordt verkort. Een belangrijk nadeel van het systeem is een minimale mengtijd van 90 ms, beperkt door de fysieke beperkingen van de mechanische componenten, waardoor het ondervragen van snellere biologische reacties buiten bereik is. Ter vergelijking: tijden minder dan 10 ms worden routinematig bereikt op bestaande microfluïdische systemen. Op het op Spotiton gebaseerde, in de handel verkrijgbare kameleonsysteem hebben ontwerp- en constructieverbeteringen de minimale duiktijd teruggebracht tot 54 ms en de mogelijkheid vergroten dat toevoeging van een tweede dispenser snellere mengtijden mogelijk zou kunnen maken dan Spotiton momenteel kan bieden.
Tot op heden is een reeks experimenten uitgevoerd om vroege, kortstondige moleculaire toestanden te onderzoeken met behulp van Spotiton, waaronder assemblage van het 70S-ribosoom, calcium-geactiveerde conformatieveranderingen in een transmembraanionkanaal en vernauwing van dynamin als reactie op GTP-hydrolyse15. Sinds de publicatie van deze resultaten zijn er verschillende wijzigingen in het systeem aangebracht om de doorvoer, reproduceerbaarheid en rapportage van Spotiton-rastersessies te verbeteren. Deze omvatten onder andere het dual-zone, automatische vochtigheidsbewakings- en besturingssysteem, de experiment viewer-functie, de side-by-side tip inspectiefunctie en verschillende kleine upgrades voor de gebruikersinterface. Het verbeterde systeem zal toekomstige mengexperimenten met twee monsters beter ondersteunen die vergelijkbaar zijn met die eerder gerapporteerd, evenals snelle bindingstests, zoals tussen een therapeutisch klein molecuul en zijn eiwitdoel of zelfs de vorming van antilichaam-antigeencomplex. Hoewel de huidige en toekomstige tijd-opgeloste experimenten met twee samenwerkende partners zeker zullen doorgaan, zou de toevoeging van een derde piëzo-elektrische dispenser en bijbehorende hardware het scala aan mogelijke experimenten verder kunnen verbreden. Bijvoorbeeld, de eerste afzetting van een detergens gevolgd door het eiwit van belang, gevolgd door het interagerende of activerende ligand kan elk potentieel negatief effect van langdurige blootstelling aan het detergens wegnemen, vaak nodig om gemeenschappelijke suboptimale beeldvormingsresultaten zoals voorkeursoriëntatie te voorkomen. In het licht van zowel het reeds gepubliceerde werk als mogelijke toekomstige toepassingen, vertegenwoordigt Spotiton een belangrijk hulpmiddel voor de cryo-EM-gemeenschap om het uitvoeren van subseconde tijd-opgeloste studies te vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
We willen Peter A. Kahn en Terry Rohde van Engineering Arts LLC (Arizona, VS) bedanken voor het eerste ontwerp en de daaropvolgende ontwikkeling van het Spotiton-systeem. We bedanken het personeel van het Simons Electron Microscopy Center van het New York Structural Biology Center voor hulp en technische ondersteuning. Het hier gepresenteerde werk werd uitgevoerd in de National Resource for Automated Molecular Microscopy in het New York Structural Biology Center, ondersteund door subsidies van de NIH (GM103310) en de Simons Foundation (SF349247).
Buffer | N/A | N/A | |
cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
Protein/other sample | N/A | N/A | |
Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |