Summary
يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.
Abstract
لا يزال التقاط الحالات الجزيئية قصيرة الأجل الناجم عن اللقاء المبكر لاثنين أو أكثر من الجسيمات المتفاعلة يشكل تحديا تجريبيا ذا أهمية كبيرة في مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM). وقد تم وضع عدد قليل من الاستراتيجيات المنهجية التي تدعم هذه الدراسات "حل الوقت"، واحدة منها، Spotiton-a نظام الروبوتية الجديدة يجمع بين الاستغناء عن قطرات عينة الحجم picoliter مع التحكم الزمني والمكاني الدقيق. يوفر سير عمل Spotiton الذي تم حله زمنيا نهجا فعالا بشكل فريد لاستجواب عمليات إعادة الترتيب الهيكلي المبكرة من الحد الأدنى لحجم العينة. أطلقت من موزعات كهربائية بيزوئية تسيطر عليها بشكل مستقل، وعينتين الأرض ومزيج بسرعة على شبكة EM nanowire لأنها تغرق نحو cryogen. يمكن إعداد مئات الشبكات في تعاقب سريع من عدد قليل من microliters فقط من عينة. هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتشغيل نظام Spotiton مع التركيز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشاكل محددة تنشأ أثناء إعداد الشبكة.
Introduction
وقد تحققت إمكانية ل CRYO-EM لالتقاط وتكشف عن حالات تشكيلية عابرة من البروتينات على مقياس زمني دون الثاني (وقت حل cryo-EM) من قبل عدة مجموعات، بدءا من بريمان وأونوين1 الذي بنيت تقنية على طريقة تجميد الهبوط القياسية التي وضعتها دوبوشيه لإعداد شبكات التبريد EM2. وأضافوا رذاذ فقط فوق كوب cryogen التي تستخدم غاز النيتروجين المضغوط لرش ضباب غرامة من عينة ثانية على شبكة EM يغرق تحتوي على العينة الأولى التي تم تطبيقها ولطخت إلى طبقة مائي رقيقة. على الرغم من أن هذا النظام يمكن أن يحقق خلط مرات منخفضة تصل إلى 1 مللي ثانية ، فإنه لا يزال يتطلب النشاف اليدوي للعينة الأولى من قبل المستخدم - مهمة صعبة من الناحية الفنية ، وحجم مرتفع نسبيا من العينة الثانية. وعلاوة على ذلك، من الصعب عمليا معرفة مكان حدوث خلط العينتين، مما يتطلب استخدام الجسيمات النانوية الفيريتين كعلامة في العينة المختلطة. الجهود اللاحقة التي بذلها هوارد وايت وزملاء العمل تحسين السيطرة وإعادة إنتاج هذا النهج الرش خلط من خلال دمج التحكم في الكمبيوتر من النشاف والرش الخطوات3،4. لمعالجة مدى و أين تختلط العينات، انتقلت نفس المجموعة5 و غيرها6و7و8و9و10 إلى نهج خلط الرش11 حيث يتم خلط عينتين إما في أنابيب شعرية ضيقة تحت ضغط مضخات الحقن أو في رقائق ميكروفلويديك المصنعة الدقيقة التي يقودها غاز النيتروجين. هذه النظم premixing ليس فقط ضمان الاختلاط الكامل ، ولكن أيضا تمكين صقل أوقات الاختلاط لزيادة دقة الدراسات التي تم حلها في الوقت المناسب.
إدخال موزعات الكهروضوئية كوسيلة بديلة لتطبيق عينة على شبكات EM في نظام Spotiton مكنت كل من الاستهداف الدقيق لترسب العينة ومتطلبات حجم عينة أصغر بكثير لجعل الشبكة12. في وقت لاحق ، واستخدام شبكات nanowire وتطبيق عينة في الطريق ("على الطاير" اكتشاف) إزالة الحاجة إلى خطوة النشاف وخفض التطبيق إلى التزجيج مرات13،14. لنهج جديد لحل الوقت cryo-EM وصفها هنا، تم إضافة موزع الثاني جنبا إلى جنب مع أجهزة التحكم اللازمة وترقيات البرمجيات إلى نظام Spotiton لتمكين تسليم عينة ثانية على شبكة nanowire تتحرك على الفور تقريبا بعد ترسب أول15. مزيج اثنين من عينات متداخلة على الشبكة لأنها شريرة من قبل nanowires في طبقة مائي رقيقة قبل التزجيج. يمكن تحقيق خلط مرات منخفضة مثل 90 مللي ثانية. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير معلومات عملية حول كيفية إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا باستخدام الاستغناء الكهربائي والشبكات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم تعديل الأجهزة والبرامج لتحسين سهولة الاستخدام والتناسق والإنتاجية، هذا البروتوكول أيضا بمثابة وصف محدثة من الأسلوب15المبلغ عنها سابقا .
Protocol
1. إعداد آلة Spotiton والبرمجيات
- إعداد النظام للاستغناء (الشكل 1).
- افتح الصمام الرئيسي على خزان إمدادات النيتروجين. تأكد من ملء خزان النظام بالمياه غير المغسوحة واللائقة النحافة. قم بتشغيل الكمبيوتر. قم بتشغيل نظام Spotiton في رحلة القوى متعددة المستويات.
- انقر على أيقونة سطح المكتب (الشكل 2A) لفتح واجهة المستخدم (UI) لبرنامج Spotiton (الشكل 2B). في القائمة أدوات، حدد تهيئة مراحل لتهيئة المنزل والروبوتات 3 محاور (مرحلة الشبكة ومرحلة ماصة) والتجمع رئيس موزع الدورية (مرحلة ثيتا). تأكد من أن نصائح الموزع تشير إلى الأسفل قبل التهيئة والتهيئة.
- على النافذة الرئيسية، انقر على الانتقال إلى SafePosition لإرسال الروبوتات إلى SafePosition (الشكل 3).
ملاحظة: يمكن الانتقال إلى SafePosition باستخدام الروبوتات في أي وضع دون خطر الاصطدام. - في علامة التبويب أسبيرات، حدد رئيس الوزراء لطرد رؤساء موزع عدة مرات مع المياه من الخزان. استمر حتى يمكن رؤية تيارات المياه غير المنقطعة تخرج من البقشيشين.
ملاحظة: قد يحتاج هذا إلى تكرار إذا دخل حجم كبير من الهواء خطوط السوائل عندما تم مسح النصائح بالميثانول عند الإغلاق الأخير.
- فحص أداء الموزع
- في علامة التبويب فحص، أرسل كل طرف إلى كاميرا الفحص لاختبار مياه الحريق، ومطابقة نمط إنتاج القطيرات من موزعي(الشكل S1).
ملاحظة: إذا فشل طرف لاطلاق النار بسبب فقاعة (الشكل S2A) أو الحطام، وتنظيف نصائح في محطة الغسيل(الشكل S2B)باستخدام وظيفة غسل بالموجات فوق الصوتية الوصول إليها على علامة التبويب أسبيرات. - ضبط السعة إطلاق (unitless) لكل موزع وعينة لتحقيق تيار من قطرات منفصلة من حجم ثابت.
- تأكيد بصريا إنتاج قطرة مكافئ من قبل موزعين.
- اضغط على زر تسجيل في شاشة الكاميرا العلوية لتسجيل فيديو لإطلاق تلميح 1. تشغيل الفيديو من تلميح 1 اطلاق النار في الشاشة على الجانب الأيمن في نفس الوقت يتم تشغيل تلميح 2 في شاشة الكاميرا العليا (الشكل S1).
ملاحظة: يتم تسجيل مقاطع الفيديو الخاصة بإطلاق كل طرف وتخزينها.
- اضغط على زر تسجيل في شاشة الكاميرا العلوية لتسجيل فيديو لإطلاق تلميح 1. تشغيل الفيديو من تلميح 1 اطلاق النار في الشاشة على الجانب الأيمن في نفس الوقت يتم تشغيل تلميح 2 في شاشة الكاميرا العليا (الشكل S1).
- الموزعات جاهزة الآن لاختبار إطلاق النار على الشبكة.
ملاحظة: يفترض هذا البروتوكول أنه تم التحقق من المحاذاة الصحيحة للشبكة ومراحل ماصة في مواقع الهبوط الخاصة بهم. الفشل في تأكيد المحاذاة الصحيحة يمكن أن يؤدي إلى الاصطدام، مما يضر نصائح أو الروبوتات.
- في علامة التبويب فحص، أرسل كل طرف إلى كاميرا الفحص لاختبار مياه الحريق، ومطابقة نمط إنتاج القطيرات من موزعي(الشكل S1).
- اختبار النار المياه على الشبكة.
- تأكد من وجود الروبوتات في SafePosition.
- إزالة الملاقط من جبل على الروبوت الشبكة باستخدام مفتاح ألن الموردة.
- على سطح مقاعد البدلاء القريبة، ضع شبكة اختبار، نانو واير الجانب حتى، على حافة كتلة الشبكة. الاستيلاء بعناية على حافة الشبكة، والموقف بشكل صحيح في ملاقط (الشكل S3)، وإعادة تحميل ملاقط.
- في علامة التبويب Cryo، انقر على تلميح إلى الكاميرا لنقل النصائح إلى مجال الرؤية لكاميرا مسار الهبوط العلوي(الكاميرا العلوية). تأكد من تحديد Live في شاشة الكاميرا العلوية، ويتم تشغيل ضوء الكاميرا العلوي (اطلب أمام خزانة الجهاز (الشكل 1).
- جبل ملاقط على الروبوت الشبكة. تلميح الموضع 1، المرئي في شاشة الكاميرا العلوية، بالنقر فوق الماوس داخل الشاشة.
ملاحظة: فقط تلميح 1 ستكون مرئية وسوف ينتقل إلى موقع النقرة. - انقر فوق الشبكة إلى الكاميرا لوضع الشبكة أمام الكاميرا العلوية. ضبط تلميح 1 موقف كما كان من قبل، إذا لزم الأمر.
- اختر إما Tip1أو Tip2أو Tip1 و Tip2 لتحديد موزع واحد أو كليهما لاختبار إطلاق النار.
ملاحظة: عند اختبار إطلاق التلميحات بشكل فردي، استخدم الماوس لوضع Tip 1 في شاشة الكاميرا العلوية في مواقع جانبية مختلفة على الشبكة. هذا وسوف إيداع المشارب السائلة من اثنين من النصائح في نمط غير متداخلة والسماح للمستخدم لتأكيد كل طرف قد أطلقت. - في علامة التبويب كريو، تأكد من عدم تحديد شبكة فيتريفي، انقر على هدف قائمة الانتظار،ثم على الهبوط.
ملاحظة: سترتفع مرحلة ماصة قليلا، متبوعة بمرحلة الشبكة. الروبوت الشبكة ثم يغرق الشبكة الماضي موزعات اطلاق النار والكاميرات العليا والسفلى، قادمة للراحة فقط فوق سطح السفينة. يظهر التقاط صورة من الكاميرا العلوية أعلى التقاط صورة من الكاميرا السفلية على الجانب الأيسر من واجهة المستخدم. - تقييم الصور العلوية والسفلية: هل أطلق كل طرف النار عند تحديده؟ عندما أطلقت معا، لم السائل من اثنين من نصائح تتداخل تماما، وخلق شريط سمكا بشكل ملحوظ مما كانت عليه عندما أطلقت بشكل فردي؟
- إذا فشل أي طرف في إطلاق النار ، قم بإجراء دورة غسيل بالموجات فوق الصوتية أو عدة دورات حتى يتم ملاحظة إطلاق نار واضح.
- إذا لم تتداخل خطوط العينة تماما ، فاضبط المحاذاة الجانبية لأحد الموزعات باستخدام مفتاح Allen لتحويل المسمار الجانبي للتكيف على أحد موزعات ربع الدور ، وإجراء اختبار الهبوط. كرر حتى تتداخل المشارب تماما.
ملاحظة: إذا تم تشغيل كل من تلميحات بنجاح وكما هو متوقع، النظام جاهزة لإعداد نماذج الشبكات.
2. إعداد اثنين من عينة، والشبكات المختلطة
- تحديث قيم التسارع والتباطؤ والسرعة في ملف XML معلمات الجهاز لتحقيق وقت خلط الفائدة.
ملاحظة: تم الإبلاغ مسبقا عن جداول ربط هذه القيم إلى أوقات خلط15. - جهز العينة والشبكات.
ملاحظة: من هذه النقطة في البروتوكول، 20-30 دقيقة سينقضي قبل إعداد الشبكة الأولى، ويجب الاحتفاظ العينات في درجة حرارة مناسبة خلال هذه الفترة الزمنية.- تمييع عينتين (أي البروتين والليغند أو شريك التفاعل الآخر) إلى التركيزات المطلوبة مع عازل مناسب ، من الناحية المثالية ، نفس الشيء لكليهما.
ملاحظة: تتطلب شبكات Spotiton تركيزات من البروتين أعلى بمقدار 1.5-2 مرة مما تستخدم عادة للمجمدات التلقائية. قد يكون هذا بسبب الحد الأدنى من الوقت الذي يقضيه البروتين في طبقة مائية رقيقة على سطح الشبكة أثناء الهبوط ، مما يعطي الجسيمات فرصة أقل للتركيز في واجهة الهواء والماء. - ملء وعاء cryogen مع النيتروجين السائل.
- البلازما نظيفة 3-4 شبكات نانو واير. استخدام 5 واط، الهيدروجين والأوكسجين، 1.5 دقيقة كنقطة انطلاق.
ملاحظة: قد تتغير مدة تنظيف البلازما ووصفتها الأكثر فعالية من يوم لآخر استنادا إلى درجة الحرارة والرطوبة المحيطة ودفعة شبكات الأسلاك النانوية المستخدمة. قد تكون خلائط الغاز البديلة أو تفريغ التوهج فعالة أيضا ، ولكن لم يتم اختبارها لهذا الغرض. كما الماء والبروتين في محلول العازلة غالبا ما تكون شريرة بسرعات مختلفة عن طريق أسلاك النانو، فمن أفضل الممارسات لتقييم فتل من الشبكات لاستخدامها في ذلك اليوم على الهبوط الذي يتم الاستغناء عن العينة الفعلية.
- تمييع عينتين (أي البروتين والليغند أو شريك التفاعل الآخر) إلى التركيزات المطلوبة مع عازل مناسب ، من الناحية المثالية ، نفس الشيء لكليهما.
- تعيين مستوى الرطوبة في النظام.
ملاحظة: بالإضافة إلى الظروف المستخدمة في كل من جعل البلازما وتنظيف الشبكات، والرطوبة هي عامل أساسي آخر يؤثر على سرعة فتل من شبكات نانو واير. على الرغم من أن الرطوبة المستهدفة في المئة لجلسة معينة يتم تحديدها تجريبيا لكل يوم ودفعة من الشبكات ، فإن 90-95٪ هي نقطة انطلاق جيدة.- تأكد من تعبئة البخاخات بما فيه الكفاية بالماء فائق النبور. سد العجز في البخاخات، ومراقبة خروج بخار الميناء المركزي على غطاء البخاخات.
- مراقبة مراقبة الرطوبة الحية في النافذة الرئيسية، أو فتح تعقب الرطوبة المحيطة تحت تقارير | المحيطة (الشكل S4). تحقق من مستويات الرطوبة في المنطقتين: الحجرة والكفن.
ملاحظة: تشمل الغرفة جميع المناطق داخل حاوية Spotiton. الكفن هو المنطقة التي تشمل على الفور "في الكاميرا" مواقف الشبكة ونصائح موزع. يحافظ كفن الراتنج الأسود على مستوى الرطوبة المحدد عند فتح أبواب الحاوية لتحميل الشبكة. - بمجرد الوصول إلى قيم الرطوبة المستهدفة، حافظ على هذه القيم إما تلقائيا أو يدويا من علامة التبويب الرطوبة. حدد عنصر التحكم التلقائي، واختر نقطة تعيين ونقطة عتبة للحفاظ على نقطة التعيين ضمن حد العتبة الذي تم اختياره. بدلا من ذلك، حدد التحكم اليدوي، وضبط مستوى الرطوبة باستخدام اثنين من عناصر التحكم مروحة: مروحة الغرفة ومروحة الكفن.
ملاحظة: يقوم تشغيل مروحة الغرفة بسحب البخار من خلال فلتر في المنفذ الأيسر ويمنع قطرات الماء الأكبر من دخول الغرفة، مما يمنع زيادة الرطوبة المحيطة. طالما أن أبواب الغرفة لا تزال مغلقة، فإن مستوى الرطوبة يستقر عند النسبة المئوية المطلوبة. تشغيل مروحة الكفن تسحب البخار من خلال الميناء الأيمن إلى الكفن. هذا على حد سواء يقلل من إطلاق بخار في الغرفة ويزيد من مستوى الرطوبة داخل الكفن.
- تحميل العينة في موزعات.
- أضف 5 ميكرولتر من كل عينة إلى أكواب العينة.
ملاحظة: لتجنب إدخال فقاعات، والاستغناء عن حجم بعناية فائقة على الجدار الجانبي الداخلي للكأس، ثم يهز لأسفل لإجبار العينة إلى الجزء السفلي من الكأس. - قم بتحميل أكواب العينة في صينية الاحتفاظ، وهي عينة النصيحة 1 على اليسار، للنصيحة 2 على اليمين. ادفع الدرج مرة أخرى إلى الجهاز حتى يصبح مقعدا.
- في علامة التبويب أسبيرات، حدد 3 ميكرولتر لوحدة التخزين التي سيتم يستنشقها كل طرف. تأكد من أن علبة العينة قد تم الجلوس بشكل آمن ، ثم انقر على Aspirate ولاحظ كيف تحرك مرحلة ماصة رؤوس الموزع إلى أكواب العينة.
- تحقق من الطموح الناجح لكلا العينتين عن طريق إزالة أكواب العينة ومراقبة انخفاض في مستوى السائل.
- في علامة التبويب فحص، أرسل كل طرف إلى كاميرا الفحص للتأكد من الاستغناء دون عائق. ضبط السعة حسب الحاجة لمطابقة تشكيل القطيرات من كل طرف (انظر القسم 1.2).
ملاحظة: من المرجح أن تحتاج السعة إلى زيادة للطرف الذي يوزع عينة البروتين. - النظام جاهز الآن لإعداد شبكة عينة.
- أضف 5 ميكرولتر من كل عينة إلى أكواب العينة.
- تجميد شبكات العينة
- تحميل البلازما الطازجة تنظيف الشبكة في ملاقط، ولكن لا جبل ملاقط حتى الآن. ضمان ارتفاع مستوى الرطوبة، ~ 90-95٪. ملء كأس الإيثان.
- إجراء اختبار نهائي لاطلاق النار من كل من نصائح أمام كاميرا التفتيش، مما يؤكد عدم وجود عرقلة. في علامة التبويب كريو، انقر على تلميح إلى الكاميرا.
- ملء كأس الإيثان. إذا تشكل جليد الإيثان، تذوب حسب الحاجة مع غاز الإيثان إضافية.
ملاحظة: يجب إكمال الخطوتين 2.5.4 و2.5.5 بسرعة نسبية (<20 ثانية) لتقليل (1) تشبع الأسلاك النانوية في الرطوبة العالية للغرفة و(2) احتمال أن يسد طرف إطلاق عينة البروتين. - جبل ملاقط مع الشبكة على مرحلة الشبكة. في علامة التبويب كريو، انقر على الشبكة إلى الكاميرا. تأكد من وضع Tip 1 بشكل صحيح في شاشة الكاميرا العلوية (راجع الخطوات 1.3.4-1.3.5).
- انقر على شبكة فيتريفي، قائمة انتظار الهدف، ثم يغرق. انقر على موافق عندما يطلب منه الأمر الروبوت الشبكة للقفز الشبكة من الإيثان إلى النيتروجين السائل والإفراج عنه على الرف المغمورة.
ملاحظة: ثم ترتفع الملاقط مرة أخرى إلى الغرفة. بعد القفز إلى النيتروجين السائل ، يبدو أن المطالبة تسأل عما إذا كانت الشبكة قد سقطت من الملاقط. إذا لم يسقط، انقر على لا، وسوف تفتح الملاقط وتغلق عدة مرات لفصل الشبكة. - فحص صور الشبكة(الشكل S5)لتحديد ما إذا كان ينبغي الاحتفاظ بها أو التخلص منها.
- إذا حفظ الشبكة، نقلها إلى مربع الشبكة المبردة مسبقا. بدلا من ذلك، بقعة الشبكات اللاحقة ومن ثم نقل جميع الشبكات في وقت واحد إلى مربع الشبكة، مع الحرص على أن كل شبكة يمكن تحديدها من خلال موقعها في منطقة الراحة.
- لنقل الشبكة إلى مربع الشبكة، قبل بارد ملقط غرامة يميل، فهم بلطف الشبكة من الحافة، ووضعها في فتحة مربع الشبكة، بدءا من الفتحة الأولى اليسار من الشق تسير في اتجاه عقارب الساعة.
- عندما يتم تحميل جميع الشبكات، نعلق غطاء مربع الشبكة إلى أداة الغطاء، وprecool في النيتروجين السائل. المسمار الغطاء على مربع الشبكة، وتشديد مع أداة غطاء أو مفك البراغي المبردة مسبقا.
- استخدم ملقط كبير لنقل مربع الشبكة المغلق بسرعة إلى ديوار صغير للتصوير أو التخزين على المدى الطويل.
- تقييم ملاءمة الشبكة للتصوير ب EM في المصب.
- مراقبة الصور من كاميرات مسار الهبوط العلوي والسفلي التي يتم عرضها على الجانب الأيسر من واجهة المستخدم مباشرة بعد أن يتم إغراق الشبكة. استخدام هذه الصور لتقييم سرعة فتل، وإطلاق النار بنجاح من كل من النصائح، ومدى التداخل بين المشارب عينتين.
- مراجعة ومقارنة صور الشبكة من الكاميرات العلوية والسفلية جنبا إلى جنب مع إعدادات الجهاز وقياسات الرطوبة في وقت الهبوط باستخدام عارض التجربة: تقارير | التجربة.
- حدد شبكات للتصوير في المجهر الإلكتروني التي تثبت أدلة على فتل جيدة.
Representative Results
الشكل 4 يظهر صورا لشبكات أعدت خلال جلسة سبوتيتون حلها مرة واحدة عن طريق خلط البوليميراز RNA و105 BP الحمض النووي oligomer تحمل تسلسل المروج لمدة 150 مللي ثانية قبل التزجيج15. وينظر في هذا الرقم هي الصور التي اتخذتها اثنين من الكاميرات عالية السرعة من ست شبكات في نقطتين زمنيتين بعد تطبيق العينة. هذه الكاميرات، فريدة من نوعها بين المجمدات على غرار يغرق، تسمح للمستخدم أن يقرر على الفور ما إذا كان للحفاظ على أو تجاهل شبكة على أساس مدى لاحظ من فتل من قبل أسلاك النانو واحتمال تم سحب العينات السائلة في طبقة مائي رقيقة بما يكفي للتصوير EM. وعلى الرغم من أن شبكة واحدة يمكن أن توفر ما يكفي من الجليد لمجموعة بيانات كاملة، فبمجرد تحقيق الظروف المثلى، فإن العديد من الشبكات مستعدة للإبقاء على أهبة الاستعداد في حالة فقدان أو تلوث شبكة واحدة أو أكثر. من الشبكات الست التي أعدت في هذه الدورة ، والتقاط الصور تظهر واحدة فقط مع فتل دون المستوى الأمثل(الشكل 4F).
تم إعداد الشبكات المعروضة (الخطوات من 2.5.1 إلى 2.5.8) على التوالي على مدى 40 دقيقة بعد ساعة لتجهيز العينات والجهاز كما هو موضح في البروتوكول (الخطوات من 1.1.1 إلى 2.4.6). ومن بين الشبكات الست، استخدمت شبكتان لجمع البيانات، وحفظت الشبكات المتبقية لتحليلها لاحقا إذا لزم الأمر. نمط الجليد على شبكة vitrified (الشكل 5C) يطابق عن كثب نمط السائل المودع ينظر في صورة الكاميرا العليا (الشكل 5B). فتل فعال من العينات المختلطة ، التي أدلى بها واضح من عدم وجود شريط السائل مرئية في صورة الكاميرا السفلى(الشكل 5A)، يحدث على طول قضبان الشبكة التي تغطيها nanowire ، وعينة نادرا ما يفيض في المربعات المجاورة لتلك التي هبطت فيها. داخل المربعات المليئة بالجليد ، يكون الجليد عادة أكثر سمكا داخل الثقوب في وسط المربع ويصبح أرق في ثقوب أقرب إلى قضبان الشبكة(الشكل 5E). غالبا ما تكون الثقوب المجاورة مباشرة لقضبان الشبكة فارغة بسبب قربها من الأسلاك النانوية(الشكل 5F).
الشكل 1: نظام Spotiton الذي تم حله زمنيا. 1. محطة عمل المشغل؛ 2. غرفة البيئة؛ 3. إمدادات النيتروجين؛ 4. إيثان توريد 5. التحكم في الإضاءة الخلفية لكاميرا مسار الهبوط العلوي 6. وحدات تحكم موزع كهربائية؛ 7. مضخات حقنة؛ 8. مضخة فراغ؛ 9. غسل إمدادات المياه وزجاجات النفايات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Spotiton واجهة المستخدم البرمجيات. (أ) رمز سطح المكتب وشاشة البداية. (ب) ويتكون واجهة المستخدم الرئيسية من ستة مجالات: 1. منطقة العرض لمسار يغرق العلوي ("العلوي") وكاميرات التفتيش تلميح; 2. منطقة العرض لانخفاض مسار الهبوط ("أقل") الكاميرا؛ 3. منطقة التشغيل لمقاطع فيديو التفتيش تلميح؛ 4. منطقة علامة التبويب متعددة الوظائف؛ 5. رصد الرطوبة الحية؛ 6. ملف سجل النظام المباشر. اختصار: واجهة المستخدم = واجهة المستخدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منظر داخلي لغرفة Spotiton (روبوتات في SafePosition). 1. شبكة الروبوت (أحمر)؛ 2. موزع الروبوت (الأصفر)؛ 3. كاميرا مسار الهبوط العلوي (الوردي)؛ 4. انخفاض كاميرا مسار الهبوط (الأزرق الفاتح)؛ 5. تلميح كاميرا التفتيش (البرتقالي)؛ 6. كفن الرطوبة (أخضر)؛ 7. عينة صينية؛ 8. تجميع البخاخات (أزرق داكن)؛ 9. نظام الخزانات وخطوط المياه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور كاميرا النظام التمثيلي من جلسة عمل Spotiton التي تم حلها زمنيا. (أ) -F) العلوي (يسار) وأقل (يمين) يغرق صور كاميرا المسار من ست شبكات التي تم تطبيقها بوليمراز الحمض النووي RNA وتسلسل الحمض النووي المروج باستخدام Spotiton. مقياس الشريط = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نمط ترسب الجليد على شبكة Spotiton المعدة. أجزاء من (أ) أقل و (ب) صور الكاميرا العليا و (C) أطلس الشبكة هو مبين في الشكل 4F. المواقع التقريبية للجليد الناتج عن ترسب العينة والاختلاط هي الخزامى الملونة. يتم تصوير المناطق داخل المربع الذي تم وضع علامة عليه برأس سهم أصفر في (E-G). المنطقة الموضحة في (E) محاصر باللون الأصفر في (D). مربع تمثيلي (E) ، ثقب (F) ، و (G) صور التعرض التي تم جمعها من الشبكة المبينة في (A-D). المناطق محاصر في مربع وصور حفرة تتوافق مع ثقب والتعرض للصور، على التوالي. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A-D)، 5 ميكرومتر (E)، 2 ميكرومتر (F)، 100 نانومتر (G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: التفتيش على طرف اطلاق النار. وينظر إلى عرض حي لإطلاق تلميح 2 في شاشة الكاميرا العليا على يسار واجهة المستخدم، في حين أن تسجيل أدلى سابقا من تلميح 1 اطلاق يلعب على حلقة للمقارنة في منطقة تشغيل الفيديو على اليمين. الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.
الشكل S2: التنظيف بالموجات فوق الصوتية من نصائح موزع. فقاعة الهواء في (A) تلميح سوف تعطل تشكيل قطرة ومنع إطلاق طرف. (ب) نصائح مغمورة في الماء في محطة التنظيف بالموجات فوق الصوتية لإزالة فقاعة الهواء أو البروتين المجفف واضحة عرقلة فتحة تلميح. الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.
الشكل S3: تحميل الشبكة في ملاقط. (أ) وضعت شبكة نانو واير الجانب حتى على حافة كتلة الشبكة. (ب) شبكة متمركزة بشكل صحيح في ملاقط الإغلاق الذاتي. الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.
الشكل S4: تعقب الرطوبة. الرطوبة النسبية في الغرفة (الأزرق الداكن) والكفن (الأزرق الفاتح) كما هو مسجل خلال جلسة نموذجية لصنع الشبكة. يتم رسم أوقات هبوط الشبكة (المربعات الخضراء) على الرسم البياني. الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.
الشكل S5: فتل على شبكات نانو واير خلال الهبوط. ممثل العلوي (A, C, E) وأقل (B, D, F) يغرق صور الكاميرا مسار فتل على شبكات نانو واير التي هي بطيئة جدا (A, B), مثالية (C, D), وسريع جدا (E, F). سماكة طفيفة (رؤوس الأسهم البيضاء) يشير إلى أشرطة الشبكة مع أسلاك النانو التي تم تشبعها بالعينة. الساحات في هذه المناطق تحتوي عادة على الجليد من سمك مناسب للتصوير المجهري الإلكتروني. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا تحميل هذا الملف.
Discussion
يحدد هذا البروتوكول استخدام نظام Spotiton الروبوتي لإعداد شبكات التصوير بالتبريد -EM التي تحمل عينتين ، عادة بروتين مثير للاهتمام وليغاند نشط ، تم خلطهما لمدة 90-500 مللي ثانية. على الرغم من أن سير العمل مباشر، إلا أن هناك بعض الاعتبارات التي يجب على المستخدم وضعها في الاعتبار لضمان جلسة عمل إنتاجية لصنع الشبكة. أولا، ليس من غير المألوف أن تصبح إحدى نصائح موزع الكهروضوئي مسدودة أو مسدودة تمنعها من إطلاق النار. سيؤدي مثل هذا الفشل إلى شريط سائل ، يظهر على التقاط الصور من الكاميرا العلوية أو السفلية ، وهو أضيق بشكل واضح من ذلك الذي شوهد بعد إطلاق كلتا النصائح. يمكن أن ينتج الانسداد عن فقاعة هوائية في الطرف ، مما يعطل تكوين القطيرات ، أو من عينة البروتين التي جفت وأغلقت فتحة الطرف الضيقة. على الرغم من فقدان العينة يستنشق في هذه العملية، يمكن حل كل من المشاكل عن طريق غسل بالموجات فوق الصوتية من النصائح وإعادة الطموح للعينة. لمنع انسداد اللاحقة وعينة النفايات، فمن الأهمية بمكان لرئيس تماما (دافق) خطوط السوائل قبل الطموح عينة والحفاظ على مستوى الرطوبة عالية ومتسقة داخل الغرفة والكفن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر عينة البروتين ذات التركيز العالي بشكل خاص على إطلاق البقشيش على الرغم من الرطوبة التي يتم الحفاظ عليها بشكل جيد. على الرغم من أن زيادة سعة الإطلاق على علامة التبويب Inspect يمكن أن تعوض جزئيا عن ضعف إطلاق النار بسبب تركيز البروتين العالي ، فإن تمييع العينة على الأقل 1:2 سيحسن إطلاق البقشيش وتجنب الانسداد.
ثانيا، قد يكون من الصعب تحقيق سرعة الفتل المثالية اللازمة لتوليد جليد من سمك أمثل لمدة الخلط المستهدفة. عموما، سوف أوقات خلط أسرع تتطلب فتل أسرع، وأوقات خلط أبطأ تتطلب فتل أبطأ. بالنسبة للشبكة الشريرة بشكل مثالي ، يمكن تمييز الشريط السائل بوضوح في صورة الكاميرا العلوية ، بينما في الكاميرا السفلية ، لا يزال سماكة طفيفة جدا لقضبان الشبكة في موقع الشريط مرئية. فتل بطيء، وأشار من قبل شريط داكن على صورة الكاميرا السفلى، ويترك عموما الجليد التي هي سميكة جدا للتصوير. غياب شريط على أي صورة يشير إلى فتل سريع التي قد تركت أي ماء في الثقوب (الشكل S5). يمكن أن تؤثر عدة عوامل مثل كثافة الأسلاك النانوية وإعدادات تنظيف البلازما ومدتها ووقت التعرض لمستوى رطوبة الغرفة وتعيينه على سرعة الفتل. قد يكون فتل الفقراء (البطيء) نتيجة لطلاء متناثر من الأسلاك النانوية على الشبكة. عن طريق تخفيف قليلا وزيادة وقت التعرض للحل nanowire16، وكثافة وتغطية nanowires على قضبان الشبكة وزيادة ، وتسهيل أسرع فتل. إذا كانت كثافة الأسلاك النانوية كافية ، فإن زيادة إعداد القوة الكهربائية أو مدة تنظيف البلازما ستحسن أيضا الفتل. الإعدادات الموصى بها هنا منخفضة نسبيا ومدة طويلة، ولكن قد تتغير إذا لزم الأمر.
ومع ذلك ، إذا كانت كل من الدفعة المحددة من الشبكات وإعدادات تنظيف البلازما قد عملت بشكل جيد في جلسة سابقة ، فقد ينشأ أداء الفتل البطيء من التعرض المفرط للأسلاك النانوية إلى رطوبة عالية داخل الغرفة ، مما يؤدي إلى تشبعها بالرطوبة وتقليل القدرة على حمل السائل. يمكن تقليل تأثير تشبع الشبكة من رطوبة الغرفة إما عن طريق تقليل الوقت المنقضي بين تصاعد ملاقط والشبكة تغرق أو خفض مستوى رطوبة النظام قبل الهبوط. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا الأخير يجلب الخطر المرتبط بأن الطرف المحملة عينة البروتين سوف تسد. لتعويض هذا الخطر، عقد نصائح في الكفن حيث يتم الحفاظ على مستوى الرطوبة العالية، يمكن أن تزيد من مقدار الوقت المسموح به لتركيب ملاقط عقد شبكة جديدة. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن انخفاض وقت الهبوط (الذي يتحقق عن طريق زيادة تسارع الشبكة و / أو السرعة القصوى) يمكن أن يؤدي إلى شبكات مع الجليد أرق دون تغيير خصائص الفتيل في الواقع من الشبكة. ومع ذلك ، كما سيتم أيضا تقليل وقت خلط العينتين ، فإن وقت الهبوط ليس عاملا يتم تغييره عادة لمعالجة الفتل البطيء. لمعالجة الفتل الذي هو سريع جدا، مما أدى إلى الجليد التي هي إما رقيقة جدا أو غائبة في ثقوب الشبكة، يمكن اتخاذ عكس التدابير المبينة أعلاه.
Spotiton يقدم بعض المزايا والعيوب بالمقارنة مع التقنيات الأخرى التي وضعت للدراسات دون الثانوية حل الوقت. كما يحتوي على شريط عينة مختلطة فقط 2-4 nL من السائل من كل موزع، واحد 3 ميكرولتر aliquot من كل عينة كافية لإعداد العديد من الشبكات-ميزة رئيسية عندما تكون العينة محدودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة ترسب العينة باستخدام الكاميرات المتكاملة ، على الرغم من أنها ليست فريدة تماما ل Spotiton17، ليست سمة من سمات أجهزة الخلط الأخرى وتسمح للشبكات المغرقة بالخضوع لتقييم تمرير / فشل الخام ، مما يقلل إلى حد كبير من وقت الفحص. أحد العيوب الرئيسية للنظام هو الحد الأدنى من وقت الاختلاط 90 مللي ثانية ، مقيدا بالقيود المادية للمكونات الميكانيكية ، مما يجعل استجواب التفاعلات البيولوجية الأسرع بعيدا عن متناول اليد. وعلى سبيل المقارنة، يتم تحقيق أقل من 10 مللي ثانية بشكل روتيني على الأنظمة الدقيقة الفلورية الموجودة. على Spotiton القائم على نظام الحرباء المتاحة تجاريا ، والتصميم والبناء التحسينات خفضت الحد الأدنى من الوقت يغرق إلى 54 مللي ثانية ، ورفع احتمال أن إضافة موزع الثاني يمكن أن تسمح أسرع أوقات الاختلاط من Spotiton يمكن أن تقدم حاليا.
حتى الآن ، تم إجراء مجموعة من التجارب للتحقيق في الحالات الجزيئية المبكرة قصيرة الأجل باستخدام Spotiton ، بما في ذلك تجميع الريبوسوم 70S ، والتغيرات التركيبية الناجمة عن الكالسيوم في قناة أيونات عبر الميمبران ، وانقباض ال دينامين استجابة للتحلل المائي GTP15. ومنذ نشر هذه النتائج، أدخلت عدة تغييرات على النظام لتعزيز إنتاجية دورات صنع الشبكة Spotiton وإعادة استنساخها والإبلاغ عنها. وتشمل هذه، من بين أمور أخرى، نظام مراقبة الرطوبة والتحكم التلقائي في المنطقة المزدوجة، وميزة عارض التجربة، وميزة فحص البقشيش جنبا إلى جنب، والعديد من الترقيات الطفيفة لواجهة المستخدم. وسيدعم النظام المطور بشكل أفضل تجارب الخلط المستقبلية ذات العينتين المماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا وكذلك المقايسات الملزمة السريعة مثل بين علاج جزيء صغير وهدفه البروتيني أو حتى تكوين مركب مستضد الأجسام المضادة. وفي حين أن التجارب الحالية والمستقبلية التي تم حلها زمنيا والتي تشمل شريكين متفاعلين ستستمر بالتأكيد، فإن إضافة موزع كهرومغناطيس ثالث وما يرتبط به من أجهزة يمكن أن يزيد من توسيع نطاق التجارب المحتملة. على سبيل المثال، يمكن أن يزيل الترسب الأولي للمنظفات يليه البروتين المثير للاهتمام، يليه ليغاند المتفاعل أو المنشط أي تأثير سلبي محتمل للتعرض الموسع للمنظفات، وغالبا ما يكون ضروريا لمنع نتائج التصوير الشائعة دون المستوى الأمثل مثل التوجه المفضل. في ضوء كل من العمل المنشور بالفعل والتطبيقات المستقبلية المحتملة ، تمثل Spotiton أداة مهمة لمجتمع cryo-EM لتسهيل إجراء دراسات حل الوقت الثانوي.
Disclosures
B.C./C.S.P. لديها علاقة تجارية مع SPT Labtech، وهي شركة تنتج أداة متاحة تجاريا، الحرباء، التي تقوم على نموذج Spotiton الأولي.
Acknowledgments
نود أن نشكر بيتر أ. كان وتيري رود في شركة الفنون الهندسية ذ.م.م (أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية) على التصميم الأولي والتطوير اللاحق لنظام Spotiton. نشكر موظفي مركز سيمونز للفحص المجهري الإلكتروني في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية على المساعدة والدعم التقني. تم تنفيذ العمل المعروض هنا في المورد الوطني للمجهر الجزيئي الآلي الموجود في مركز نيويورك للبيولوجيا الهيكلية، بدعم من المنح المقدمة من المعاهد القومية للصحة (GM103310) ومؤسسة سيمونز (SF349247).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer | N/A | N/A | |
| cryogenic grid storage boxes | EMS (Hatfield, PA; USA) | N/A | |
| Cu/Rh 300 mesh EM grids | EMS (Hatfield, PA; USA) | EMS300-Cu-Rh | treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018) |
| ethane gas | TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA) | N/A | |
| Grid-handling forceps | EMS (Hatfield, PA; USA) | 78320-5B | |
| liquid nitrogen | Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA) | N/A | |
| liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA) | ||
| Picosystem | Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA) | N/A | water purification system |
| Protein/other sample | N/A | N/A | |
| Solarus 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA) | N/A |
References
- Berriman, J., Unwin, N. Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy. 56 (4), 241-252 (1994).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- White, H. D., Walker, M. L., Trinick, J. A computer-controlled spraying-freezing apparatus for millisecond time-resolution electron cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 121 (3), 306-313 (1998).
- White, H. D., Thirumurugan, K., Walker, M. L., Trinick, J. A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray. Journal of Structural Biology. 144 (1-2), 246-252 (2003).
- Kontziampasis, D., et al. A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies. IUCrJ. 6, Pt 6 1024-1031 (2019).
- Lu, Z., et al. Gas-assisted annular microsprayer for sample preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 24 (11), 115001 (2014).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23 (6), 1097-1105 (2015).
- Kaledhonkar, S., et al. Late steps in bacterial translation initiation visualized using time-resolved cryo-EM. Nature. 570 (7761), 400-404 (2019).
- Fu, Z., et al. The structural basis for release-factor activation during translation termination revealed by time-resolved cryogenic electron microscopy. Nature Communications. 10 (1), 2579 (2019).
- Mäeots, M. -E., et al. Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM. Nature Communications. 11 (1), 3465 (2020).
- Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. Time-resolved cryo-electron microscopy using a microfluidic chip. Methods in Molecular Biology. 1764, 59-71 (2018).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: a prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A new method for vitrifying samples for cryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New features and applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Dandey, V. P., et al. Time-resolved cryo-EM using Spotiton. Nature Methods. 17, 897-900 (2020).
- Wei, H., et al. Optimizing "self-wicking" nanowire grids. Journal of Structural Biology. 202 (2), 170-174 (2018).
- Ravelli, R. B. G., et al. Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification. Nature Communications. 11 (1), 2563 (2020).
