Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

Summary

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Abstract

Het vastleggen van kortstondige moleculaire toestanden veroorzaakt door de vroege ontmoeting van twee of meer interagerende deeltjes blijft een experimentele uitdaging van groot belang voor het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Er zijn een paar methodologische strategieën ontwikkeld die deze "tijd-opgeloste" studies ondersteunen, waarvan er één, Spotiton - een nieuw robotsysteem - de afgifte van picoliter-sized monsterdruppels combineert met nauwkeurige temporele en ruimtelijke controle. De tijd-opgeloste Spotiton-workflow biedt een unieke efficiënte aanpak om vroege structurele herschikkingen te ondervragen vanuit een minimaal monstervolume. Gebakken vanuit onafhankelijk gecontroleerde piëzo-elektrische dispensers, landen twee monsters en mengen zich snel op een nanodraad EM-raster terwijl het naar het cryogene water stort. Mogelijk kunnen honderden roosters snel achter elkaar worden bereid uit slechts enkele microliters van een monster. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol van de werking van het Spotiton-systeem gepresenteerd met een focus op het oplossen van specifieke problemen die zich voordoen tijdens de voorbereiding van het net.

Introduction

Het potentieel voor cryo-EM om voorbijgaande conformatietoestanden van eiwitten op de subseconde tijdschaal (tijd-opgeloste cryo-EM) vast te leggen en te onthullen, is gerealiseerd door verschillende groepen, te beginnen met Berriman en Unwin^1, waarvan de techniek is gebaseerd op de standaard plunge freezing-methode ontwikkeld door Dubochet voor het bereiden van cryo-EM-rasters². Ze voegden een verstuiver toe net boven de cryogene beker die samengeperst stikstofgas gebruikte om een fijne nevel van een tweede monster op een kelderend EM-rooster te spuiten met een eerste monster dat was aangebracht en uitgeveegd op een dunne waterige laag. Hoewel dit systeem mengtijden tot 1 ms kon bereiken, vereiste het nog steeds handmatige vloeiing van het eerste monster door de gebruiker - een technisch uitdagende taak - en een relatief hoog volume van het tweede monster. Bovendien was het in de praktijk moeilijk om te weten waar vermenging van de twee monsters had plaatsgevonden, waardoor ferritine nanodeeltjes als fiduciële marker in het gemengde monster moesten worden gebruikt. Latere inspanningen van Howard White en collega's verbeterden de controle en reproduceerbaarheid van deze spuit-mengbenadering door computerbesturing van de devlott- en spuitstappen^3,4opte nemen. Om aan te pakken hoe goed en waar de monsters mengen, zijn dezelfde groep⁵ en anderen^6,7,8,9,10 overgestapt op een meng-spuitbenadering¹¹ waarbij twee monsters worden gemengd in smalle capillaire buizen onder druk van spuitpompen of in microgefabriceerde, microfluïdische chips aangedreven door stikstofgas. Deze voormengsystemen zorgen niet alleen voor een volledige menging, maar maken ook de fijnafstelling van mengtijden mogelijk om de resolutie van tijdsgeo opgeloste studies te verhogen.

De introductie van piëzo-elektrische dispensers als een alternatieve manier om monsters toe te passen op EM-rasters in het Spotiton-systeem maakte zowel de precieze targeting van monsterdepositie mogelijk als de vereiste van een veel kleiner monstervolume om een raster te maken¹². Later nam het gebruik van nanodraadroosters en en-route monstertoepassing ("on-the-fly" spotting) de noodzaak van een blotting-stap weg en verminderde toepassing-naar-vitrificatietijden^13,14. Voor de nieuwe benadering van tijd-opgeloste cryo-EM die hier wordt beschreven, werd een tweede dispenser samen met de nodige besturingshardware en software-upgrades toegevoegd aan het Spotiton-systeem om de levering van een tweede monster op een bewegend nanodraadraster vrijwel onmiddellijk na afzetting van de eerste¹⁵mogelijk te maken . De twee overlappende monsters mengen zich op het rooster omdat ze door de nanodraden in een dunne waterige laag worden gebracht voorafgaand aan vitrificatie. Mengtijden zo laag als 90 ms kunnen worden bereikt. Dit protocol is bedoeld om praktische informatie te verstrekken over het uitvoeren van tijd-opgeloste experimenten met behulp van piëzo-elektrische dispensing en nanodraadroosters. Aangezien de hardware en software worden aangepast om het gebruiksgemak, de consistentie en de doorvoer te verbeteren, dient dit protocol ook als een up-to-date beschrijving van de eerder gerapporteerde methode¹⁵.

Protocol

1. De Spotiton machine en software instellen

1. Bereid het systeem voor op de dispense(figuur 1).
   1. Open de hoofdklep van de stikstoftoevoertank. Zorg ervoor dat het systeemreservoir is gevuld met ontgast, ultraplein water. Schakel de computer in. Schakel het Spotiton-systeem in bij de multioutlet powerstrip.
   2. Klik op het bureaubladpictogram (Figuur 2A)om de gebruikersinterface (UI) van de Spotiton-software te openen(Figuur 2B). Selecteer in het menu Extra de optie Stadia initialiseren om de 3-assige robots (rastertrap en pipettrap) en de roterende dispenserkopassemblage (thetatrap) te initialiseren en thuis te zetten. Zorg ervoor dat de dispenserpunten naar beneden wijzen voordat ze worden geïnitialiseerd en ge homing.
   3. Klik in het hoofdvenster op Ga naar SafePosition om de robots naar de SafePosition te sturen(Figuur 3).
      OPMERKING: De overgang naar SafePosition kan worden gedaan met robots in elke positie zonder risico op botsingen.
   4. Selecteer op het tabblad Aspirate de optie Prime om de dispenserkoppen meerdere keren door te spoelen met water uit het reservoir. Ga door totdat ononderbroken waterstromen te zien zijn die uit de twee uiteinden komen.
      OPMERKING: Dit moet mogelijk worden herhaald als een aanzienlijk volume lucht de vloeistofleidingen binnendrong toen de uiteinden bij de laatste uitschakeling met methanol werden gespoeld.
2. Inspecteer de prestaties van de dispenser
   1. Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om water te testen en het patroon van druppelproductie van de twee dispensers te matchen(figuur S1).
      OPMERKING: Als een tip niet brandt als gevolg van een bel(figuur S2A)of vuil, reinigt u de uiteinden bij het wasstation(figuur S2B)met behulp van de ultrasone wasfunctie die toegankelijk is op het tabblad Aspiraat.
   2. Pas de vuuramplitude (unitless) voor elke dispenser en monster aan om een stroom discrete druppels van consistente grootte te bereiken.
   3. Bevestig visueel de equivalente druppelproductie door de twee dispensers.
      1. Druk op de opnameknop in de bovenste cameramonitor om een video op te nemen van het afvuren van Tip 1. Speel de video af van Tip 1 die in de rechter monitor afvuurt op hetzelfde moment dat Tip 2 wordt afgevuurd in de bovenste cameramonitor(Figuur S1).
         OPMERKING: Video's van elke tip worden opgenomen en opgeslagen.
   4. Dispensers zijn nu klaar om te testen-vuur op een rooster.
      OPMERKING: Dit protocol gaat ervan uit dat de juiste uitlijning van het rooster en de pipetfasen op hun respectieve duikposities is geverifieerd. Het niet bevestigen van de juiste uitlijning kan leiden tot een botsing, waardoor de tips of de robots worden beschadigd.
3. Test-vuur water op een rooster.
   1. Zorg ervoor dat robots bij de SafePosition zijn.
   2. Verwijder het pincet van de houder op de rasterrobot met behulp van de meegeleverde inbussleutel.
   3. Plaats op een nabijgelegen tafelblad een testrooster, nanodraadzijde naar boven, aan de rand van het rasterblok. Pak voorzichtig de rand van het rooster vast, plaats het pincet correct in (figuur S3) en monteer het pincet opnieuw.
   4. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera om de tips naar het gezichtsveld van de bovenste duikpadcamera(bovenste camera)te verplaatsen. Zorg ervoor dat Live is geselecteerd op de bovenste cameramonitor en dat het bovenste cameralampje is ingeschakeld (draaiknop voor de machinekast (afbeelding 1).
   5. Monteer het pincet op de rasterrobot. Plaats tip 1, zichtbaar in de bovenste cameramonitor, door met de muis in de monitor te klikken.
      OPMERKING: Alleen tip 1 is zichtbaar en wordt verplaatst naar de locatie van de klik.
   6. Klik op Raster naar camera om het raster voor de bovenste camera te plaatsen. Pas tip 1-positie aan zoals voorheen, indien nodig.
   7. Kies Tip1, Tip2of Tip1 en Tip2 om een of beide dispensers te selecteren om vuur te testen.
      OPMERKING: Wanneer u de uiteinden afzonderlijk test, gebruikt u de muis om tip 1 in de bovenste cameramonitor op verschillende laterale locaties op het raster te plaatsen. Dit deponeert vloeibare strepen van de twee uiteinden in een niet-overlappend patroon en stelt de gebruiker in staat om te bevestigen dat elke tip is geschoten.
   8. Zorg er op het tabblad Cryo voor dat Vitrify Grid niet is geselecteerd, klik op Wachtrijdoelen vervolgens op Plunge.
      OPMERKING: De pipettrap zal iets stijgen, gevolgd door de rastertrap. De rasterrobot stort het raster vervolgens langs de schietdispensers en bovenste en onderste camera's en komt net boven het dek tot rust. Een opname van een afbeelding van de bovenste camera wordt weergegeven boven een opname van de onderste camera aan de linkerkant van de gebruikersinterface.
   9. Evalueer de bovenste en onderste afbeeldingen: is elke tip gevuren toen deze werd geselecteerd? Wanneer ze samen werden gebakken, overlapte de vloeistof van de twee uiteinden volledig, waardoor een merkbaar dikkere streep ontstond dan wanneer ze afzonderlijk werden gebakken?
      1. Als een van beide tips niet kan worden gevuren, voer dan een of meerdere ultrasone wascycli uit totdat duidelijk vuren wordt waargenomen.
      2. Als de monsterstrips elkaar niet volledig overlappen, past u de zijdelingse uitlijning van een van de dispensers aan met behulp van een inbussleutel om de laterale stelschroef op een van de dispensers een kwart keer te draaien en een testduik uit te voeren. Herhaal dit totdat de strepen elkaar volledig overlappen.
         OPMERKING: Als beide tips met succes en zoals verwacht zijn afgevuurd, is het systeem klaar om monsterroosters voor te bereiden.

2. Bereid gemengde roosters met twee monsters

1. Werk de versnellings-, vertragings- en snelheidswaarden in het XML-bestand Machineparameters bij om de mengtijd van belang te bereiken.
   OPMERKING: Tabellen die deze waarden correleren met mengtijden zijn eerder gemeld¹⁵.
2. Maak het monster en de rasters klaar.
   OPMERKING: Vanaf dit punt in het protocol verstrijkt 20-30 minuten voordat het eerste raster wordt voorbereid en moeten monsters gedurende dit tijdsinterval op een geschikte temperatuur worden bewaard.
   1. Verdun twee monsters (d.w.z. eiwit en ligand of een andere interagerende partner) tot de gewenste concentraties met een geschikte buffer, idealiter hetzelfde voor beide.
      OPMERKING: Spotiton-roosters vereisen 1,5-2 keer hogere concentraties eiwit dan meestal wordt gebruikt voor automatische dompelvriezers. Dit kan te wijten zijn aan de minimale tijd die het eiwit tijdens een duik in een dunne waterige laag op het rasteroppervlak doorbrengt, waardoor deeltjes minder gelegenheid hebben om zich te concentreren op het lucht-water-grensvlak.
   2. Vul de cryogene kom met vloeibare stikstof.
   3. Plasma reinigen 3-4 nanodraad roosters. Gebruik 5 W, waterstof en zuurstof, 1,5 min als uitgangspunt.
      OPMERKING: De meest effectieve plasmareinigingsduur en recept kan van dag tot dag veranderen op basis van omgevingstemperatuur en vochtigheid en de gebruikte partij nanodraadroosters. Alternatieve gasmengsels of een gloedafscheider kunnen ook effectief zijn, maar zijn niet voor dit doel getest. Omdat water en eiwit in bufferoplossing vaak met verschillende snelheden door nanodraden worden ontvoerd, is het het beste om de afvoer van de roosters te evalueren die die dag moeten worden gebruikt bij een duik waarin het eigenlijke monster wordt opgegeven.
3. Stel de vochtigheidsgraad in het systeem in.
   OPMERKING: Naast de omstandigheden die worden gebruikt om de roosters te reinigen en plasma te reinigen, is vochtigheid een andere primaire factor die van invloed is op de afvoersnelheid van nanodraadroosters. Hoewel het streefpercentage vochtigheid voor een bepaalde sessie empirisch wordt bepaald voor elke dag en batch roosters, is 90-95% een goed startpunt.
   1. Zorg ervoor dat de vernevelaar voldoende gevuld is met ultrapijn water. Sluit de vernevelaar aan en observeer de damp die de centrale poort op de verneveldingsdop verlaat.
   2. Observeer de live vochtigheidsmonitor in het hoofdvenster of open de omgevingsvochtigheidstracker onder Rapporten | Omgevingstemperatuur (figuur S4). Controleer de luchtvochtigheid in de twee zones: Kamer en Lijkwade.
      OPMERKING: Kamer omvat alle gebieden binnen de Spotiton-behuizing. Shroud is het gebied dat onmiddellijk de "at camera" -posities van het rooster en de dispensertips omvat. De zwarte harsmantel handhaaft de ingestelde vochtigheidsgraad wanneer de behuizingsdeuren worden geopend om een rooster te laden.
   3. Zodra de streefwaarden voor vochtigheid zijn bereikt, handhaaft u deze waarden automatisch of handmatig vanaf het tabblad Vochtigheid. Selecteer Automatisch besturingselementen kies een instelpunt en drempelwaarde om het instelpunt binnen de gekozen drempelwaarde te houden. U kunt ook Handmatige bedieningselecteren en de vochtigheidsgraad aanpassen met behulp van de twee ventilatorregelaars: kamerventilator en lijkwadeventilator.
      OPMERKING: Als u de kamerventilator inschakelt, wordt de damp door een filter in de linkerpoort getrokken en wordt voorkomen dat grotere waterdruppels de kamer binnenkomen, waardoor een verdere toename van de omgevingsvochtigheid wordt voorkomen. Zolang de kamerdeuren gesloten blijven, stabiliseert de luchtvochtigheid zich op het gewenste percentage. Als u de lijkwadeventilator inschakelt, wordt de damp door de rechterpoort in de lijkwade getrokken. Dit vermindert zowel de dampafgifte in de kamer als verhoogt de luchtvochtigheid in de lijkwade.
4. Plaats het monster in de dispensers.
   1. Voeg 5 μL van elk monster toe aan de monsterbekers.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat er bubbels worden geïntroduceerd, geeft u het volume heel voorzichtig af op de binnenste zijwand van de beker en schudt u vervolgens naar beneden om het monster naar de bodem van de beker te dwingen.
   2. Plaats de monsterbekers in de opberglade, het monster voor tip 1 aan de linkerkant en voor tip 2 aan de rechterkant. Duw de lade terug in het apparaat totdat deze zit.
   3. Selecteer op het tabblad Aspiraat 3 μL voor het volume dat door elke punt moet worden aangezogen. Zorg ervoor dat de monsterlade goed is geplaatst, klik vervolgens op Aspirate en observeer hoe de pipettrap de dispenserkoppen in de monsterbekers beweegt.
   4. Controleer de succesvolle aspiratie van beide monsters door de monsterbekers te verwijderen en een daling van het vloeistofniveau te observeren.
   5. Stuur op het tabblad Inspecteren elke tip naar de inspectiecamera om de onbelemmerde afgifte te bevestigen. Pas de amplitude zo nodig aan om de druppelvorming van elke punt te evenaren (zie rubriek 1.2).
      OPMERKING: Amplitude moet waarschijnlijk worden verhoogd voor de punt die het eiwitmonster afgeeft.
   6. Het systeem is nu klaar om een monsterrooster voor te bereiden.
5. Voorbeeldrasters bevriezen
   1. Laad een vers plasma gereinigd rooster in het pincet, maar monteer het pincet nog niet. Zorg ervoor dat de luchtvochtigheid verhoogd is, ~ 90-95%. Vul de ethaanbeker.
   2. Voer een laatste test-fire van beide tips uit voor de inspectiecamera, waarbij wordt bevestigd dat er geen obstakels zijn. Klik op het tabblad Cryo op Tip naar camera.
   3. Vul ethaanbeker. Als ethaanijs zich vormt, smelt dan indien nodig met extra ethaangas.
      OPMERKING: Stap 2.5.4 en 2.5.5 moeten relatief snel worden voltooid (<20 s) om (i) verzadiging van de nanodraden in de hoge luchtvochtigheid van de kamer te minimaliseren en (ii) de waarschijnlijkheid dat de punt die het eiwitmonster afvuurt, verstopt raakt.
   4. Monteer het pincet met het rooster op de rastertrap. Klik op het tabblad Cryo op Raster naar camera. Zorg ervoor dat tip 1 correct is geplaatst in de bovenste cameramonitor (zie stappen 1.3.4-1.3.5).
   5. Klik op Vitrify Grid, Queue Targeten vervolgens plunge. Klik op OK wanneer u wordt gevraagd de rasterrobot opdracht te geven om het raster van ethaan in vloeibare stikstof te hoppen en op de ondergedompelde plank vrij te geven.
      OPMERKING: Het pincet stijgt dan terug in de kamer. Na de hop naar vloeibare stikstof verschijnt er een prompt met de vraag of het rooster uit het pincet is gevallen. Als het niet is gedaald, klikt u op Neeen het pincet gaat meerdere keren open en dicht om het rooster los te maken.
   6. Onderzoek afbeeldingen van het raster (figuur S5) om te beslissen of het moet worden bewaard of weggegooid.
   7. Als u het rooster bewaart, breng het dan over naar de voorgekoelde rasterdoos. U kunt ook volgende rasters plaatsen en vervolgens alle rasters tegelijk overbrengen naar de rasterbox, waarbij u ervoor zorgt dat elk raster kan worden geïdentificeerd aan de lichting op zijn positie in het rustgebied.
   8. Om het raster over te brengen naar een rasterdoos, koelt u de tang met fijne punt vooraf af, pakt u het raster voorzichtig bij de rand vast en plaatst u het in een rastervaksleuf, te beginnen met de eerste sleuf links van de inkeping met de klok mee.
   9. Wanneer alle roosters zijn geladen, bevestigt u het deksel van de roosterdoos aan het dekselgereedschap en koelt u voor in vloeibare stikstof. Schroef het deksel op de roosterdoos en draai vast met een dekselgereedschap of een voorgekoelde schroevendraaier.
   10. Gebruik een grote tang om de gesloten rasterdoos snel over te brengen naar een kleine dewar voor beeldvorming of langdurige opslag.
6. Evalueer de geschiktheid van het raster voor downstream EM-beeldvorming.
   1. Bekijk de beelden van de bovenste en onderste duikpadcamera's die aan de linkerkant van de gebruikersinterface worden weergegeven onmiddellijk nadat een raster is gedompeld. Gebruik deze afbeeldingen om de vochtafvoersnelheid, het succesvol afvuren van beide uiteinden en de mate van overlap van de twee monstersstrepen te evalueren.
   2. Bekijk en vergelijk de rasterbeelden van de bovenste en onderste camera's samen met de machine-instellingen en vochtigheidsmetingen op het moment van de duik met behulp van de experimentviewer: Rapporten | Experimenteer.
   3. Selecteer rasters voor beeldvorming in de elektronenmicroscoop die bewijs van goede wicking aantonen.

Representative Results

Figuur 4 toont beelden van rasters die tijdens een enkele tijd-opgeloste Spotiton-sessie zijn voorbereid door RNA-polymerase en een 105 bp DNA-oligomeer te mengen met een promotorsequentie gedurende 150 ms voorafgaand aan vitrificatie¹⁵. In de figuur zijn beelden te zien die zijn gemaakt door de twee hogesnelheidscamera's van zes rasters op twee tijdstippen na monstertoepassing. Deze camera's, uniek onder de vriezers in plunge-stijl, stellen de gebruiker in staat om onmiddellijk te beslissen of hij een raster wil behouden of weggooien op basis van de waargenomen mate van wicking door de nanodraden en de waarschijnlijkheid dat de vloeibare monsters in een waterige laag zijn getrokken die dun genoeg is voor EM-beeldvorming. Hoewel een enkel raster voldoende ijs kan leveren voor een volledige dataset, zijn, zodra optimale omstandigheden zijn bereikt, verschillende rasters voorbereid om bij de hand te houden in het geval dat een of meer verloren gaan of verontreinigd zijn. Van de zes rasters die in deze sessie zijn voorbereid, tonen de beeldopnamen er slechts één met suboptimale afvoer(figuur 4F).

De getoonde roosters werden (stappen 2.5.1 tot en met 2.5.8) na elkaar voorbereid gedurende een periode van 40 minuten na een uur om de monsters en de machine klaar te maken zoals beschreven in het protocol (stappen 1.1.1 tot en met 2.4.6). Van de zes rasters werden er twee gebruikt voor het verzamelen van gegevens en de rest werd opgeslagen voor latere analyse indien nodig. Het patroon van ijs op een verglaasd raster (figuur 5C) komt nauw overeen met het patroon van afgezette vloeistof dat te zien is in het bovenste camerabeeld (figuur 5B). Effectieve afvoer van de gemengde monsters, duidelijk gemaakt door het ontbreken van een zichtbare vloeistofstreep in het onderste camerabeeld (figuur 5A), vindt plaats langs de met nanodraad bedekte rasterbalken en het monster stroomt zelden over in vierkanten naast die waarin het landde. Binnen met ijs gevulde vierkanten is het ijs meestal het dikst in gaten in het midden van het vierkant en wordt het dunner in gaten dichter bij de rasterbalken (Figuur 5E). Vaak zijn gaten direct naast de rasterbalken leeg door de nabijheid van de nanodraden(figuur 5F).

Figuur 1: Het tijd-opgeloste Spotiton systeem. 1. De werkplek van de exploitant; 2. Milieukamer; 3. Stikstofvoorziening; 4. Ethaanvoorziening 5. Backlight controle voor bovenste duikpad camera 6. Piëzo-elektrische dispenserregelaars; 7. Spuitpompen; 8. Vacuümpomp; 9. Waswatervoorziening en afvalflessen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Spotiton software user interface. (A) Bureaublad pictogram en welkomstscherm. (B)De hoofdgebruikersinterface bestaat uit zes gebieden: 1. weergavegebied voor bovenste duikpad ("bovenste") en tipinspectiecamera's; 2. weergavegebied voor lagere duikpad ("lagere") camera; 3. Afspeelgebied voor tipinspectievideo's; 4. Multifunctioneel tabbladgebied; 5. Live vochtigheidsmonitor; 6. Live systeemlogbestand. Afkorting: UI = user interface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Binnenaanzicht van Spotiton kamer (robots in SafePosition). 1. Grid robot (rood); 2. Dispenser robot (geel); 3. Bovenste duikpadcamera (roze); 4. Onderste duikpad camera (lichtblauw); 5. Tip inspectie camera (oranje); 6. Vochtigheidsmantel (groen); 7. monsterlade; 8. Vernevelaar montage (donkerblauw); 9. Systeemreservoir en waterleidingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve systeemcamerabeelden van een tijdsopoeste Spotiton-rastersessie. (Een -F) Bovenste (links) en onderste (rechts) plunge path camerabeelden van zes rasters waarop RNA polymerase en een promotor DNA-sequentie werden aangebracht met behulp van Spotiton. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Patroon van ijsafzetting op een door Spotiton geprepareerd raster. Delen van de (A) onderste en (B) bovenste camerabeelden en (C) atlas van het raster weergegeven in figuur 4F. Geschatte locaties van ijs als gevolg van monsterafzetting en mengen zijn gekleurde lavendel. Gebieden binnen het vierkant gemarkeerd met een gele pijlpunt zijn afgebeeld in (E-G). Het gebied dat in (E) wordt weergegeven, is geel ingepakt in (D). Representatieve vierkants- (E), gat (F) en (G) belichtingsbeelden verzameld uit het raster weergegeven in (A-D). De ingepakte gebieden in de vierkante en holeafbeeldingen komen overeen met respectievelijk de hole- en belichtingsafbeeldingen. Schaalstaven = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1: Inspectie van het stoken van de punt. Een live weergave van Tip 2-afvuren is te zien in de bovenste cameramonitor aan de linkerkant van de gebruikersinterface, terwijl een opname die eerder is gemaakt van Tip 1-afvuren wordt afgespeeld op een lus ter vergelijking in het videoweergavegebied aan de rechterkant. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S2: Ultrasoon reinigen van dispensertips. Een luchtbel in de (A) punt zal de druppelvorming verstoren en tipvuren voorkomen. (B)Tips ondergedompeld in water bij het ultrasone reinigingsstation om een luchtbel of helder gedroogd eiwit te verwijderen dat de tipopening blokkeert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S3: Laadrooster in pincet. (A) Een raster geplaatst nanodraadzijde omhoog op de rand van het rasterblok. (B) Een rooster dat correct in het zelfsluitende pincet is geplaatst. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S4: Vochtigheid tracker. Het percentage relatieve vochtigheid in de kamer (donkerblauw) en lijkwade (lichtblauw) zoals geregistreerd tijdens een typische rastersessie. De tijden van rasterduiken (groene vierkanten) zijn uitgezet op de grafiek. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur S5: Wicking op nanodraadroosters tijdens een duik. Representatieve bovenste (A, C, E) en onderste (B, D, F) dompelpad camerabeelden van wicking op nanodraadroosters die te langzaam (A, B), ideaal (C, D) en te snel (E, F) is. Een lichte verdikking (witte pijlpunten) duidt op rasterbalken met nanodraden die verzadigd zijn door monster. Vierkanten in deze regio's bevatten meestal ijs van de juiste dikte voor elektronenmicroscopische beeldvorming. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol schetst het gebruik van het Spotiton-robotsysteem om rasters voor cryo-EM-beeldvorming voor te bereiden die twee monsters dragen, over het algemeen een eiwit van belang en een activerend ligand, die gedurende 90-500 ms zijn gemengd. Hoewel de workflow eenvoudig is, zijn er een paar overwegingen die de gebruiker in gedachten moet houden om een productieve sessie voor het maken van rasters te garanderen. Ten eerste is het niet ongebruikelijk dat een van de piëzo-elektrische dispensertips verstopt raakt of geblokkeerd raakt, waardoor deze niet kan vuren. Zo'n storing zal resulteren in een vloeibare streep, te zien op beeldopnamen van de bovenste of onderste camera, die zichtbaar smaller is dan die gezien nadat beide tips zijn afgevuurd. Een verstopping kan het gevolg zijn van een luchtbel in de punt, waardoor de vorming van druppels wordt verstoord, of van eiwitmonster dat is uitgedroogd en de smalle puntopening heeft afgesloten. Hoewel het aangezogen monster tijdens het proces verloren gaat, kunnen beide problemen worden opgelost door een ultrasone wassing van de uiteinden en heraspiratie van het monster. Om daaropvolgende verstopping en monsterverspilling te voorkomen, is het van cruciaal belang om de vloeistofleidingen grondig te primen (spoelen) voorafgaand aan de monsteraspiratie en om een hoge en consistente luchtvochtigheid in de kamer en de lijkwade te handhaven. Bovendien kan een eiwitmonster met een bijzonder hoge concentratie het bakken van de punt beïnvloeden, ondanks een goed onderhouden vochtigheid. Hoewel het verhogen van de stookamplitude op het tabblad Inspect gedeeltelijk kan compenseren voor zwak vuren als gevolg van een hoge eiwitconcentratie, zal het verdunn van het monster ten minste 1: 2 het bakken van de punt verbeteren en verstopping voorkomen.

Ten tweede kan het moeilijk zijn om de ideale afvoersnelheid te bereiken die nodig is om ijs van optimale dikte te genereren voor de beoogde mengduur. Over het algemeen vereisen snellere mengtijden een snellere afvoer, langzamere mengtijden vereisen een langzamere afvoer. Voor het idealiter slechte raster is een vloeibare streep duidelijk waarneembaar in het bovenste camerabeeld, terwijl in de onderste camera slechts een zeer lichte verdikking van de rasterbalken op de locatie van de streep zichtbaar blijft. Langzame wicking, aangegeven door een donkere streep op het onderste camerabeeld, laat over het algemeen ijs achter dat te dik is voor beeldvorming. Afwezigheid van een streep op beide afbeeldingen duidt op een snelle afvoer die mogelijk geen water in de gaten heeft achtergelaten(figuur S5). Verschillende factoren zoals nanodraaddichtheid, plasmareinigingsinstellingen en -duur en tijd van blootstelling aan en ingestelde kamervochtigheid kunnen de afvoersnelheid beïnvloeden. Slechte (langzame) afvoer kan het gevolg zijn van een schaarse coating van nanodraden op het rooster. Door de tijd van blootstelling aan de nanodraadoplossing licht te verdunnen en te verlengen¹⁶, zal de dichtheid en dekking van nanodraden op de roosterbalken toenemen, waardoor snellere afvoer mogelijk wordt. Als de nanodraaddichtheid voldoende is, zal het verhogen van de wattage-instelling of de duur van plasmareiniging ook de afvoer verbeteren. De instellingen die hier worden aanbevolen, zijn relatief laag vermogen en lange duur, maar kunnen indien nodig worden gewijzigd.

Als echter zowel de specifieke batch roosters als plasmareinigingsinstellingen goed hebben gewerkt in een eerdere sessie, kunnen langzame afvoerprestaties het gevolg zijn van overmatige blootstelling van de nanodraden aan een hoge luchtvochtigheid in de kamer, wat leidt tot hun verzadiging met vocht en verminderde vloeistofvasthoudende capaciteit. Het rasterverzadigende effect van de luchtvochtigheid in de kamer kan worden verminderd door de verstreken tijd tussen pincetmontage en roosterduiken te minimaliseren of door de luchtvochtigheid van het systeem voorafgaand aan een duik te verlagen. Opgemerkt moet echter worden dat dit laatste het bijbehorende risico met zich meebrengt dat de tip geladen met eiwitmonster verstopt zal zijn. Om dit risico te compenseren, kan het vasthouden van de uiteinden in de lijkwade waar een hoge luchtvochtigheid wordt gehandhaafd, de toegestane hoeveelheid tijd verlengen om een pincet te monteren met een nieuw rooster. Ten slotte moet worden opgemerkt dat een kortere duiktijd (bereikt door het verhogen van de netversnelling en / of maximale snelheid) kan resulteren in rasters met dunner ijs zonder de afvoerkarakteristieken van het raster daadwerkelijk te veranderen. Omdat de mengtijd van de twee monsters echter ook zal worden verkort, is de duiktijd geen factor die meestal wordt gewijzigd om langzame wicking aan te pakken. Om de afvoer aan te pakken die te snel is, met ijs tot gevolg dat te dun of afwezig is in de roostergaten, kan het tegenovergestelde van de hierboven geschetste maatregelen worden genomen.

Spotiton presenteert bepaalde voor- en nadelen in vergelijking met andere technieken die zijn ontwikkeld voor subseconde tijd-opgeloste studies. Aangezien de gemengde monsterstreep slechts 2-4 nL vloeistof uit elke dispenser bevat, is een enkele aliquot van 3 μL van elk monster voldoende om veel roosters te bereiden - een belangrijk voordeel wanneer het monster beperkt is. Bovendien is observatie van monsterafzetting met behulp van geïntegreerde camera's, hoewel niet helemaal uniek voor Spotiton^17,geen kenmerk van andere mengapparaten en maakt het mogelijk om ondergedompelde roosters te onderwerpen aan een ruwe pass / fail-evaluatie, waardoor de screeningstijd aanzienlijk wordt verkort. Een belangrijk nadeel van het systeem is een minimale mengtijd van 90 ms, beperkt door de fysieke beperkingen van de mechanische componenten, waardoor het ondervragen van snellere biologische reacties buiten bereik is. Ter vergelijking: tijden minder dan 10 ms worden routinematig bereikt op bestaande microfluïdische systemen. Op het op Spotiton gebaseerde, in de handel verkrijgbare kameleonsysteem hebben ontwerp- en constructieverbeteringen de minimale duiktijd teruggebracht tot 54 ms en de mogelijkheid vergroten dat toevoeging van een tweede dispenser snellere mengtijden mogelijk zou kunnen maken dan Spotiton momenteel kan bieden.

Tot op heden is een reeks experimenten uitgevoerd om vroege, kortstondige moleculaire toestanden te onderzoeken met behulp van Spotiton, waaronder assemblage van het 70S-ribosoom, calcium-geactiveerde conformatieveranderingen in een transmembraanionkanaal en vernauwing van dynamin als reactie op GTP-hydrolyse¹⁵. Sinds de publicatie van deze resultaten zijn er verschillende wijzigingen in het systeem aangebracht om de doorvoer, reproduceerbaarheid en rapportage van Spotiton-rastersessies te verbeteren. Deze omvatten onder andere het dual-zone, automatische vochtigheidsbewakings- en besturingssysteem, de experiment viewer-functie, de side-by-side tip inspectiefunctie en verschillende kleine upgrades voor de gebruikersinterface. Het verbeterde systeem zal toekomstige mengexperimenten met twee monsters beter ondersteunen die vergelijkbaar zijn met die eerder gerapporteerd, evenals snelle bindingstests, zoals tussen een therapeutisch klein molecuul en zijn eiwitdoel of zelfs de vorming van antilichaam-antigeencomplex. Hoewel de huidige en toekomstige tijd-opgeloste experimenten met twee samenwerkende partners zeker zullen doorgaan, zou de toevoeging van een derde piëzo-elektrische dispenser en bijbehorende hardware het scala aan mogelijke experimenten verder kunnen verbreden. Bijvoorbeeld, de eerste afzetting van een detergens gevolgd door het eiwit van belang, gevolgd door het interagerende of activerende ligand kan elk potentieel negatief effect van langdurige blootstelling aan het detergens wegnemen, vaak nodig om gemeenschappelijke suboptimale beeldvormingsresultaten zoals voorkeursoriëntatie te voorkomen. In het licht van zowel het reeds gepubliceerde werk als mogelijke toekomstige toepassingen, vertegenwoordigt Spotiton een belangrijk hulpmiddel voor de cryo-EM-gemeenschap om het uitvoeren van subseconde tijd-opgeloste studies te vergemakkelijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer	N/A	N/A
cryogenic grid storage boxes	EMS (Hatfield, PA; USA)	N/A
Cu/Rh 300 mesh EM grids	EMS (Hatfield, PA; USA)	EMS300-Cu-Rh	treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)
ethane gas	TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)	N/A
Grid-handling forceps	EMS (Hatfield, PA; USA)	78320-5B
liquid nitrogen	Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)	N/A
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
Picosystem	Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)	N/A	water purification system
Protein/other sample	N/A	N/A
Solarus 950 plasma cleaner	Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)	N/A