Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

Summary

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung von Spotiton, einem neuartigen Robotersystem, um zwei interessante Proben auf ein selbstableitendes Nanodrahtgitter zu liefern, das sich vor der Vitrifikation in flüssigem Kryogen mindestens 90 ms vermischt.

Abstract

Die Erfassung kurzlebiger molekularer Zustände, die durch die frühe Begegnung von zwei oder mehr wechselwirkenden Teilchen ausgelöst werden, ist nach wie vor eine experimentelle Herausforderung von großem Interesse für das Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). Es wurden einige methodische Strategien entwickelt, die diese "zeitaufgelösten" Studien unterstützen, von denen eine, Spotiton - ein neuartiges Robotersystem - die Dosierung von Probentröpfchen in Pikolitergröße mit präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle kombiniert. Der zeitaufgelöste Spotiton-Workflow bietet einen einzigartig effizienten Ansatz, um frühe strukturelle Umlagerungen aus minimalem Probenvolumen abzufragen. Von unabhängig kontrollierten piezoelektrischen Spendern abgefeuert, landen zwei Proben und mischen sich schnell auf einem Nanodraht-EM-Gitter, während es in Richtung des Kryogens stürzt. Potenziell können Hunderte von Gittern in schneller Folge aus nur wenigen Mikrolitern einer Probe hergestellt werden. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll des Betriebs des Spotiton-Systems vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Behebung spezifischer Probleme liegt, die während der Netzvorbereitung auftreten.

Introduction

Das Potenzial für Kryo-EM, transiente Konformationszustände von Proteinen auf der Zeitskala unter einer Sekunde (zeitaufgelöste Kryo-EM) zu erfassen und aufzudecken, wurde von mehreren Gruppen realisiert, beginnend mit Berriman und Unwin^1, deren Technik auf der von Dubochet entwickelten Standard-Tauchgefriermethode zur Herstellung von Kryo-EM-Gittern²aufbaute. Sie fügten einen Zerstäuber direkt über dem Kryogenbecher hinzu, der komprimiertes Stickstoffgas verwendete, um einen feinen Nebel einer zweiten Probe auf ein eintauchendes EM-Gitter zu sprühen, das eine erste Probe enthielt, die aufgetragen und auf eine dünne wässrige Schicht gelöscht worden war. Obwohl dieses System Mischzeiten von nur 1 ms erreichen konnte, erforderte es dennoch das manuelle Löschen der ersten Probe durch den Benutzer - eine technisch anspruchsvolle Aufgabe - und ein relativ hohes Volumen der zweiten Probe. Darüber hinaus war es in der Praxis schwierig zu wissen, wo eine Vermischung der beiden Proben stattgefunden hatte, was die Verwendung von Ferritin-Nanopartikeln als treuhänderischen Marker in der gemischten Probe erforderte. Nachfolgende Bemühungen von Howard White und Mitarbeitern verbesserten die Kontrolle und Reproduzierbarkeit dieses Sprüh-Misch-Ansatzes durch die Einbeziehung der Computersteuerung der Lösch- und^{Sprühschritte 3,4}. Um zu untersuchen, wie gut und wo sich die Proben mischen, sind die gleiche Gruppe⁵ und andere^6,7,^8,9,10 zu einem Misch-Sprühansatz¹¹ übergegangen, bei dem zwei Proben entweder in schmalen Kapillarröhrchen unter dem Druck von Spritzenpumpen oder in mikrofabrizierten, mikrofluidischen Chips, die mit Stickstoffgas angetrieben werden, gemischt werden. Diese Vormischsysteme sorgen nicht nur für eine vollständige Durchmischung, sondern ermöglichen auch die Feinabstimmung der Mischzeiten, um die Auflösung zeitaufgelöser Studien zu erhöhen.

Die Einführung piezoelektrischer Dispenser als alternative Möglichkeit, Proben auf EM-Gitter im Spotiton-System aufzutragen, ermöglichte sowohl das präzise Targeting der Probenabscheidung als auch die Anforderung eines viel kleineren Probenvolumens, um ein Gitter¹²herzustellen. Später entfallen durch die Verwendung von Nanodrahtgittern und die Anwendung von Proben auf dem Weg ("On-the-fly" Spotting) die Notwendigkeit eines Löschschritts und die Anwendungs-zu-Vitrifizierungszeiten^13,14. Für den hier beschriebenen neuen Ansatz zur zeitaufgelösten Kryo-EM wurde dem Spotiton-System ein zweiter Dispenser sowie die notwendigen Steuerungshardware- und Software-Upgrades hinzugefügt, um die Lieferung einer zweiten Probe auf ein sich bewegendes Nanodrahtgitter fast unmittelbar nach der Abscheidung der ersten¹⁵zu ermöglichen. Die beiden überlappenden Proben vermischen sich auf dem Gitter, da sie vor der Vitrifikation von den Nanodrähten zu einer dünnen wässrigen Schicht geleitet werden. Mischzeiten von bis zu 90 ms können erreicht werden. Dieses Protokoll soll praktische Informationen darüber liefern, wie zeitaufgelöste Experimente mit piezoelektrischen Dosier- und Nanodrahtgittern durchgeführt werden können. Da die Hardware und Software modifiziert werden, um benutzerfreundliche, Konsistenz und Durchsatz zu verbessern, dient dieses Protokoll auch als aktuelle Beschreibung der zuvor gemeldeten Methode¹⁵.

Protocol

1. Spotiton-Maschine und -Software einrichten

1. Bereiten Sie das zu dosierende System vor (Abbildung 1).
   1. Öffnen Sie das Hauptventil am Stickstoffversorgungstank. Stellen Sie sicher, dass das Systemreservoir mit entgastem, hochreinem Wasser gefüllt ist. Schalten Sie den Computer ein. Schalten Sie das Spotiton-System an der Multioutlet-Powerstrip ein.
   2. Klicken Sie auf das Desktop-Symbol (Abbildung 2A), um die Benutzeroberfläche (UI) der Spotiton-Software zu öffnen (Abbildung 2B) . Wählen Sie im Menü Extras die Option Initialize Stages aus, um die 3-Achsen-Roboter (Gitterstufe und Pipettenstufe) und die rotierende Dispenserkopfbaugruppe (Theta-Stufe) zu initialisieren und zu hause. Stellen Sie sicher, dass die Spenderspitzen vor der Initialisierung und dem Homing nach unten zeigen.
   3. Klicken Sie im Hauptfenster auf Gehe zu SafePosition, um die Roboter an die SafePosition zu senden (Abbildung 3).
      HINWEIS: Der Wechsel zu SafePosition kann mit Robotern in jeder Position ohne Kollisionsgefahr erfolgen.
   4. Wählen Sie auf der Registerkarte Aspirieren die Option Prime aus, um die Spenderköpfe mehrmals mit Wasser aus dem Reservoir zu spülen. Fahren Sie fort, bis ununterbrochene Wasserströme aus den beiden Spitzen auftauchen können.
      HINWEIS: Dies muss möglicherweise wiederholt werden, wenn ein erhebliches Luftvolumen in die Flüssigkeitsleitungen gelangt, wenn die Spitzen bei der letzten Abschaltung mit Methanol gespült wurden.
2. Prüfen Sie die Leistung des Spenders
   1. Senden Sie auf der Registerkarte Prüfen jeden Tipp an die Inspektionskamera, um Das Löschwasser zu testen, und passen Sie das Muster der Tröpfchenproduktion aus den beiden Spendern an (Abbildung S1).
      HINWEIS: Wenn eine Spitze aufgrund einer Blase (Abbildung S2A) oder Schmutz nicht brennt, reinigen Sie die Spitzen an der Waschstation (Abbildung S2B) mit der Ultraschallwaschfunktion, auf die auf der Aspirationslasche zugegriffen wird.
   2. Passen Sie die Feueramplitude (einheitslos) für jeden Spender und jede Probe an, um einen Strom diskreter Tröpfchen von konstanter Größe zu erhalten.
   3. Bestätigen Sie visuell die äquivalente Tröpfchenproduktion durch die beiden Spender.
      1. Drücken Sie die Aufnahmetaste im oberen Kameramonitor, um ein Video von Tipp 1 aufzunehmen. Wiedergabe des Videos von Tipp 1, der auf dem rechten Monitor zur gleichen Zeit, in der Tipp 2 im oberen Kameramonitor ausgelöst wird , wieder (Abbildung S1).
         HINWEIS: Videos von jedem Tippfeuer werden aufgezeichnet und gespeichert.
   4. Spender sind jetzt bereit, auf einem Gitter zu testen.
      HINWEIS: Dieses Protokoll geht davon aus, dass die korrekte Ausrichtung der Gitter- und Pipettenstufen an ihren jeweiligen Tauchpositionen überprüft wurde. Wenn die korrekte Ausrichtung nicht bestätigt wird, kann dies zu einer Kollision führen und die Spitzen oder die Roboter beschädigen.
3. Testfeuerwasser auf einem Gitter.
   1. Stellen Sie sicher, dass sich Roboter an der SafePosition befinden.
   2. Entfernen Sie die Pinzette mit dem mitgelieferten Inbusschlüssel von der Halterung des Gitterroboters.
   3. Positionieren Sie auf einem nahe gelegenen Tisch ein Testgitter, Nanodrahtseite nach oben, am Rand des Gitterblocks. Greifen Sie vorsichtig den Rand des Gitters, positionieren Sie sich korrekt in der Pinzette (Abbildung S3) und besteigen Sie die Pinzette wieder.
   4. Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Tipp zur Kamera, um die Spitzen in das Sichtfeld der oberen Tauchpfadkamera(obere Kamera)zu verschieben. Stellen Sie sicher, dass Live im oberen Kameramonitor ausgewählt ist und das obere Kameralicht eingeschaltet ist (Zifferblatt an der Vorderseite des Maschinenschranks (Abbildung 1).
   5. Montieren Sie die Pinzette am Gitterroboter. Positionieren Sie Tipp 1, sichtbar im oberen Kameramonitor, indem Sie mit der Maus innerhalb des Monitors klicken.
      HINWEIS: Nur Tipp 1 ist sichtbar und wird an die Stelle des Klicks verschoben.
   6. Klicken Sie auf Raster zur Kamera, um das Raster vor der oberen Kamera zu positionieren. Passen Sie die Position von Tipp 1 bei Bedarf wie zuvor an.
   7. Wählen Sie entweder Tip1, Tip2oder Tip1 und Tip2 aus, um einen oder beide Spender für das Testfeuer auszuwählen.
      HINWEIS: Wenn Sie die Spitzen einzeln testen, verwenden Sie die Maus, um Tipp 1 im oberen Kameramonitor an verschiedenen seitlichen Stellen auf dem Gitter zu positionieren. Dadurch werden Flüssigkeitsstreifen von den beiden Spitzen in einem nicht überlappenden Muster abgelagert und der Benutzer kann bestätigen, dass jede Spitze ausgelöst wurde.
   8. Stellen Sie auf der Registerkarte Kryo sicher, dass Vitrify Grid nicht ausgewählt ist, klicken Sie auf Warteschlangenzielund dann auf Eintauchen.
      HINWEIS: Die Pipettenstufe steigt leicht an, gefolgt von der Gitterstufe. Der Gitterroboter taucht dann das Gitter an den Feuerspendern und den oberen und unteren Kameras vorbei und kommt direkt über dem Deck zum Stehen. Eine Bildaufnahme von der oberen Kamera wird über einer Bildaufnahme von der unteren Kamera auf der linken Seite der Benutzeroberfläche angezeigt.
   9. Bewerten Sie die oberen und unteren Bilder: Hat jede Spitze ausgelöst, wenn sie ausgewählt wurde? Überlappte sich die Flüssigkeit aus den beiden Spitzen beim zusammengefeuerten Zusammentakt vollständig und erzeugte einen merklich dickeren Streifen als beim Einzelfeuer?
      1. Wenn eine der beiden Spitzen nicht feuert, führen Sie einen oder mehrere Ultraschallwaschzyklen durch, bis ein klarer Brand beobachtet wird.
      2. Wenn sich die Probenstreifen nicht vollständig überlappen, stellen Sie die seitliche Ausrichtung eines der Spender mit einem Inbusschlüssel ein, um die seitliche Einstellschraube an einem der Spender um ein Viertel zu drehen und einen Testtauchgang durchzuführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich die Streifen vollständig überlappen.
         HINWEIS: Wenn beide Spitzen erfolgreich und wie erwartet ausgelöst wurden, ist das System bereit, Probengitter vorzubereiten.

2. Zwei-Proben-Mischgitter vorbereiten

1. Aktualisieren Sie die Beschleunigungs-, Verzögerungs- und Geschwindigkeitswerte in der XML-Datei Maschinenparameter, um die interessierende Mischzeit zu erreichen.
   HINWEIS: Tabellen, die diese Werte mit Mischzeiten korrelieren, wurden bereits¹⁵gemeldet.
2. Bereiten Sie die Probe und die Raster vor.
   HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt des Protokolls verstreichen 20-30 Minuten, bevor das erste Gitter vorbereitet wird, und die Proben sollten während dieses Zeitintervalls auf einer angemessenen Temperatur gehalten werden.
   1. Verdünnen Sie zwei Proben (d. h. Protein und Ligand oder einen anderen interagierenden Partner) mit einem geeigneten Puffer auf die gewünschten Konzentrationen, idealerweise für beide gleich.
      HINWEIS: Spotiton-Gitter benötigen 1,5-2 mal höhere Proteinkonzentrationen als typischerweise für automatische Tauchgefriergeräte. Dies kann auf die minimale Zeit zurückzuführen sein, die das Protein während eines Sturzes in einer dünnen wässrigen Schicht auf der Gitteroberfläche verbringt, wodurch die Partikel weniger Gelegenheit haben, sich an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu konzentrieren.
   2. Füllen Sie die Kryogenschüssel mit flüssigem Stickstoff.
   3. Plasma reinigen 3-4 Nanodrahtgitter. Verwenden Sie 5 W, Wasserstoff und Sauerstoff, 1,5 min als Ausgangspunkt.
      HINWEIS: Die effektivste Plasmareinigungsdauer und -rezeptur kann sich von Tag zu Tag ändern, basierend auf Umgebungstemperatur und -feuchtigkeit und der Charge der verwendeten Nanodrahtgitter. Alternative Gasgemische oder ein Glühentladungsmittel können ebenfalls wirksam sein, wurden aber nicht für diesen Zweck getestet. Da Wasser und Protein in Pufferlösung oft mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch Nanodrähte geleitet werden, ist es am besten, den Docht der Gitter zu bewerten, die an diesem Tag bei einem Tauchgang verwendet werden sollen, bei dem die eigentliche Probe abgegeben wird.
3. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit im System ein.
   HINWEIS: Zusätzlich zu den Bedingungen, die zur Herstellung und Plasmareinigung der Gitter verwendet werden, ist feuchtigkeit ein weiterer Hauptfaktor, der die Dochtgeschwindigkeit von Nanodrahtgittern beeinflusst. Obwohl die prozentuale Zielfeuchte für eine bestimmte Sitzung empirisch für jeden Tag und jede Charge von Gittern bestimmt wird, sind 90-95% ein guter Ausgangspunkt.
   1. Stellen Sie sicher, dass der Vernebler ausreichend mit Reinstwasser gefüllt ist. Schließen Sie den Vernebler an und beobachten Sie, wie der Dampf den zentralen Anschluss an der Verneblerkappe verlässt.
   2. Beobachten Sie den Live-Feuchtigkeitsmonitor im Hauptfenster oder öffnen Sie den Umgebungsfeuchte-Tracker unter Berichte | Umgebungstemperatur (Abbildung S4). Überprüfen Sie die Luftfeuchtigkeit in den beiden Zonen: Kammer und Grabtuch.
      HINWEIS: Die Kammer umfasst alle Bereiche innerhalb des Spotiton-Gehäuses. Shroud ist der Bereich, der unmittelbar die "at camera" -Positionen des Gitters und der Spenderspitzen umfasst. Das schwarze Harzgehäuse hält die eingestellte Luftfeuchtigkeit aufrecht, wenn die Gehäusetüren geöffnet werden, um ein Gitter zu laden.
   3. Sobald die Zielfeuchtewerte erreicht sind, behalten Sie diese Werte entweder automatisch oder manuell über die Registerkarte Luftfeuchtigkeit bei. Wählen Sie Automatische Steuerungund wählen Sie einen Sollwert und einen Schwellenwert aus, um den Sollwert innerhalb des gewählten Schwellenwerts beizubehalten. Alternativ können Sie Manuelle Steuerungwählen und die Luftfeuchtigkeit mit den beiden Lüftersteuerungen Kammerlüfter und Gehäuselüftereinstellen.
      HINWEIS: Das Einschalten des Kammerlüfters zieht den Dampf durch einen Filter im linken Anschluss und verhindert, dass größere Wassertröpfchen in die Kammer gelangen, wodurch eine weitere Erhöhung der Umgebungsfeuchtigkeit verhindert wird. Solange die Kammertüren geschlossen bleiben, stabilisiert sich die Luftfeuchtigkeit im gewünschten Prozentsatz. Durch das Einschalten des Gehäuselüfters wird der Dampf durch den rechten Anschluss in das Gehäuse gezogen. Dies reduziert sowohl die Dampffreisetzung in die Kammer als auch die Luftfeuchtigkeit innerhalb der Hülle.
4. Laden Sie die Probe in die Spender.
   1. Geben Sie 5 μL jeder Probe in die Probenbecher.
      HINWEIS: Um das Einbringen von Blasen zu vermeiden, geben Sie das Volumen sehr vorsichtig auf die innere Seitenwand des Bechers und schütteln Sie es dann nach unten, um die Probe auf den Boden der Tasse zu zwingen.
   2. Legen Sie die Probenbecher in die Auffangschale, die Probe für Tipp 1 links, für Tipp 2 rechts. Schieben Sie das Tablett zurück in die Maschine, bis es Platz hat.
   3. Wählen Sie auf der Registerkarte Aspirat 3 μL für das Volumen aus, das von jeder Spitze aspiriert werden soll. Stellen Sie sicher, dass das Probenfach sicher sitzt, klicken Sie dann auf Aspirate und beobachten Sie, wie der Pipettenstand die Spenderköpfe in die Probenbecher bewegt.
   4. Überprüfen Sie die erfolgreiche Aspiration beider Proben, indem Sie die Probenbecher entfernen und einen Abfall des Flüssigkeitsstandes beobachten.
   5. Senden Sie auf der Registerkarte Prüfen jeden Tipp an die Inspektionskamera, um die ungehinderte Dosierung zu bestätigen. Passen Sie die Amplitude nach Bedarf an, um die Tröpfchenbildung von jeder Spitze anzupassen (siehe Abschnitt 1.2).
      HINWEIS: Die Amplitude muss wahrscheinlich für die Spitze erhöht werden, die die Proteinprobe abgibt.
   6. Das System ist nun bereit, ein Probenraster vorzubereiten.
5. Probengitter einfrieren
   1. Laden Sie ein frisch plasmageputztes Gitter in die Pinzette, montieren Sie die Pinzette aber noch nicht. Stellen Sie sicher, dass die Luftfeuchtigkeit erhöht ist, ~ 90-95%. Füllen Sie den Ethanbecher.
   2. Führen Sie einen abschließenden Testbrand beider Spitzen vor der Inspektionskamera durch und bestätigen Sie, dass keine Behinderung besteht. Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Tipp zur Kamera.
   3. Ethanbecher füllen. Wenn sich Ethaneis bildet, schmelzen Sie nach Bedarf mit zusätzlichem Ethangas.
      HINWEIS: Die Schritte 2.5.4 und 2.5.5 sollten relativ schnell (<20 s) abgeschlossen werden, um (i) die Sättigung der Nanodrähte in der hohen Luftfeuchtigkeit der Kammer und (ii) die Wahrscheinlichkeit, dass die Spitze, die die Proteinprobe abfeuert, verstopft, zu minimieren.
   4. Montieren Sie die Pinzette mit dem Gitter auf der Gitterbühne. Klicken Sie auf der Registerkarte Kryo auf Raster zur Kamera. Stellen Sie sicher, dass Tipp 1 korrekt im oberen Kameramonitor positioniert ist (siehe Schritte 1.3.4-1.3.5).
   5. Klicken Sie auf Vitrify Grid, Queue Target, dann Plunge. Klicken Sie auf OK, wenn Sie aufgefordert werden, dem Gitterroboter zu befehlen, das Gitter von Ethan in flüssigen Stickstoff zu hüpfen und es in das untergetauchte Regal freizugeben.
      HINWEIS: Die Pinzette steigt dann wieder in die Kammer auf. Nach dem Sprung zu flüssigem Stickstoff erscheint eine Aufforderung, ob das Gitter von der Pinzette gefallen ist. Wenn es nicht fallen gelassen wurde, klicken Sie auf Nein, und die Pinzette öffnet und schließt sich mehrmals, um das Gitter zu lösen.
   6. Untersuchen Sie die Bilder des Rasters (Abbildung S5), um zu entscheiden, ob es beibehalten oder verworfen werden soll.
   7. Wenn Sie das Gitter beibehalten, übertragen Sie es in die vorgekühlte Gitterbox. Alternativ können Sie nachfolgende Gitter erkennen und dann alle Gitter auf einmal in die Gitterbox übertragen, wobei darauf zu achten ist, dass jedes Gitter durch seine Position im Ruhebereich identifiziert werden kann.
   8. Um das Gitter in eine Gitterbox zu übertragen, kühlen Sie die feinspitzige Zette vor, greifen Sie das Gitter vorsichtig an der Kante und legen Sie es in einen Gitterkastenschlitz, beginnend mit dem ersten Steckplatz links von der Notch, der im Uhrzeigersinn geht.
   9. Wenn alle Gitter geladen sind, befestigen Sie den Deckel der Gitterbox am Deckelwerkzeug und vorkühlen Sie ihn in flüssigem Stickstoff. Schrauben Sie den Deckel auf die Gitterbox und ziehen Sie sie mit einem Deckelwerkzeug oder einem vorgekühlten Schraubendreher fest.
   10. Verwenden Sie eine große Handette, um die geschlossene Gitterbox schnell in einen kleinen Dewar für die Bildgebung oder Langzeitlagerung zu übertragen.
6. Bewerten Sie die Netztauglichkeit für die nachgelagerte EM-Bildgebung.
   1. Beobachten Sie die Bilder der kameras mit dem oberen und unteren Tauchpfad, die unmittelbar nach dem Eintauchen eines Rasters auf der linken Seite der Benutzeroberfläche angezeigt werden. Verwenden Sie diese Bilder, um die Dochtgeschwindigkeit, das erfolgreiche Abfeuern beider Spitzen und das Ausmaß der Überlappung der beiden Probenstreifen zu bewerten.
   2. Überprüfen und vergleichen Sie die Rasterbilder der oberen und unteren Kameras zusammen mit den Maschineneinstellungen und Feuchtigkeitsmessungen zum Zeitpunkt des Tauchgangs mit dem Experiment-Viewer: Reports | ExperimentierenSie .
   3. Wählen Sie Gitter für die Bildgebung im Elektronenmikroskop aus, die Hinweise auf einen guten Docht zeigen.

Representative Results

Abbildung 4 zeigt Bilder von Gittern, die während einer einzigen zeitaufgelösten Spotiton-Sitzung durch Mischen von RNA-Polymerase und einem 105 bp DNA-Oligomer mit einer Promotorsequenz für 150 ms vor der Vitrifikation hergestellt wurden¹⁵. In der Abbildung sind Bilder zu sehen, die von den beiden Hochgeschwindigkeitskameras von sechs Gittern zu zwei Zeitpunkten nach der Beispielanwendung aufgenommen wurden. Diese Kameras, einzigartig unter den Tauchgefrierschränken, ermöglichen es dem Benutzer, sofort zu entscheiden, ob er ein Gitter behalten oder entsorgen möchte, basierend auf dem beobachteten Ausmaß des Dochts durch die Nanodrähte und der Wahrscheinlichkeit, dass die flüssigen Proben in eine wässrige Schicht gezogen wurden, die dünn genug für die EM-Bildgebung ist. Obwohl ein einzelnes Gitter ausreichend Eis für einen vollständigen Datensatz liefern kann, werden nach Erreichen optimaler Bedingungen mehrere Gitter vorbereitet, um für den Fall, dass eines oder mehrere verloren gehen oder kontaminiert werden, zur Verfügung zu bleiben. Von den sechs in dieser Sitzung vorbereiteten Rastern zeigen die Bildaufnahmen nur eines mit suboptimalem Docht (Abbildung 4F).

Die gezeigten Gitter wurden nacheinander über einen Zeitraum von 40 min nach einer Stunde vorbereitet (Schritte 2.5.1 bis 2.5.8), um die Proben und die Maschine wie im Protokoll beschrieben vorzubereiten (Schritte 1.1.1 bis 2.4.6). Von den sechs Rastern wurden zwei für die Datenerfassung verwendet, und der Rest wurde für die spätere Analyse bei Bedarf gespeichert. Das Eismuster auf einem verglasten Gitter (Abbildung 5C) stimmt eng mit dem Muster der abgelagerten Flüssigkeit überein, das im oberen Kamerabild zu sehen ist (Abbildung 5B). Ein effektiver Docht der gemischten Proben, der durch das Fehlen eines sichtbaren Flüssigkeitsstreifens im unteren Kamerabild (Abbildung 5A) deutlich wird, erfolgt entlang der mit Nanodrähten bedeckten Gitterstäbe, und die Probe läuft selten in Quadrate über, die an diejenigen angrenzen, in denen sie gelandet sind. Innerhalb von eisgefüllten Quadraten ist das Eis typischerweise am dicksten in Löchern in der Mitte des Quadrats und wird dünner in Löchern, die näher an den Gitterbalken sind (Abbildung 5E). Oft sind Löcher unmittelbar neben den Gitterstäben aufgrund der Nähe zu den Nanodrähten leer (Abbildung 5F).

Abbildung 1: Das zeitaufgelöste Spotiton-System. 1. Arbeitsplatz des Bedieners; 2. Umweltkammer; 3. Stickstoffversorgung; 4. Ethanversorgung 5. Hintergrundbeleuchtungssteuerung für obere Tauchpfadkamera 6. Piezoelektrische Dispenser-Controller; 7. Spritzenpumpen; 8. Vakuumpumpe; 9. Waschen Sie Wasserversorgung und Abfallflaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Benutzeroberfläche der Spotiton-Software. (A) Desktop-Symbol und Begrüßungsbildschirm. (B) Die Hauptbenutzeroberfläche besteht aus sechs Bereichen: 1. Anzeigebereich für den oberen Tauchpfad ("obere") und Spitzeninspektionskameras; 2. Anzeigebereich für Kamera mit niedrigerem Tauchpfad ("niedriger"); 3. Wiedergabebereich für Spitzeninspektionsvideos; 4. Multifunktions-Registerkartenbereich; 5. Live-Feuchtigkeitsmonitor; 6. Live-System-Logdatei. Abkürzung: UI = Benutzeroberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Innenansicht der Spotiton-Kammer (Roboter in SafePosition). 1. Gitterroboter (rot); 2. Spenderroboter (gelb); 3. Obere Tauchpfadkamera (rosa); 4. Kamera mit niedrigerem Tauchpfad (hellblau); 5. Tip Inspektionskamera (orange); 6. Feuchtigkeitsverkleidung (grün); 7. Probenschale; 8. Vernebler-Montage (dunkelblau); 9. SystemReservoir und Wasserleitungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4:Repräsentative Systemkamerabilder aus einer zeitaufgelösten Spotiton-Rastererstellungssitzung. (A -F) Obere (links) und untere (rechts) Tauchpfadkamerabilder von sechs Gittern, auf die RNA-Polymerase und eine Promotor-DNA-Sequenz mit Spotiton aufgebracht wurden. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Muster der Eisablagerung auf einem von Spotiton vorbereiteten Gitter. Teile der (A) unteren und (B) oberen Kamerabilder und (C) Atlas des Rasters in Abbildung 4F. Ungefähre Positionen von Eis, die durch Probenablagerung und -mischung entstehen, sind lavendelfarben. Bereiche innerhalb des Quadrats, die mit einer gelben Pfeilspitze markiert sind, sind in (E- G)abgebildet. Der in (E) angezeigte Bereich ist gelb in (D) eingefeldt. Repräsentative quadratische (E), Loch (F) und (G) Belichtungsbilder, die aus dem in (A-D) gezeigtenRaster gesammelt wurden. Die Box-Bereiche in den quadratischen und Lochbildern entsprechen den Loch- bzw. Belichtungsbildern. Skalenbalken = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung S1: Inspektion des Spitzenfeuers. Eine Live-Ansicht des Schießens von Tipp 2 ist auf dem oberen Kameramonitor auf der linken Seite der Benutzeroberfläche zu sehen, während eine zuvor von Tipp 1 gemachte Aufnahme auf einer Schleife zum Vergleich im Videowiedergabebereich auf der rechten Seite abgespielt wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S2: Ultraschallreinigung von Spenderspitzen. Eine Luftblase in der (A) Spitze stört die Tröpfchenbildung und verhindert das Abfeuern der Spitze. (B) An der Ultraschallreinigungsstation in Wasser getauchte Spitzen zum Entfernen einer Luftblase oder eines klaren getrockneten Proteins, das die Spitzenöffnung blockiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S3: Ladegitter in Pinzette. (A) Ein Gitter, das mit der Nanodrahtseite nach oben am Rand des Gitterblocks platziert wird. (B) Ein Gitter, das korrekt in der selbstschließenden Pinzette positioniert ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S4: Feuchtigkeits-Tracker. Die prozentuale relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer (dunkelblau) und im Leichentuch (hellblau), wie sie während einer typischen Gitterherstellungssitzung aufgezeichnet wurde. Die Zeiten der Rastereinstürzen (grüne Quadrate) werden im Diagramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung S5: Wicking auf Nanodrahtgittern während eines Tauchgangs. Repräsentative obere (A, C, E) und untere (B, D, F) Tauchpfadkamerabilder von Docht auf Nanodrahtgittern, die zu langsam (A, B), ideal (C, D) und zu schnell (E, F) sind. Eine leichte Verdickung (weiße Pfeilspitzen) weist auf Gitterbalken mit Nanodrähten hin, die durch Probe gesättigt wurden. Quadrate in diesen Regionen enthalten typischerweise Eis von geeigneter Dicke für elektronenmikroskopische Bildgebung. Maßstabsleiste = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des Spotiton-Robotersystems zur Vorbereitung von Gittern für die Kryo-EM-Bildgebung, die zwei Proben tragen, im Allgemeinen ein Protein von Interesse und einen aktivierenden Liganden, die für 90-500 ms gemischt wurden. Obwohl der Workflow einfach ist, gibt es einige Überlegungen, die der Benutzer beachten muss, um eine produktive Grid-Making-Sitzung sicherzustellen. Erstens ist es nicht ungewöhnlich, dass eine der piezoelektrischen Spenderspitzen verstopft oder blockiert wird, um das Feuern zu verhindern. Ein solcher Fehler führt zu einem Flüssigkeitsstreifen, der auf Bildaufnahmen der oberen oder unteren Kamera zu sehen ist, der sichtbar schmaler ist als der, der nach dem Abfeuern beider Spitzen zu sehen ist. Eine Blockade könnte durch eine Luftblase in der Spitze entstehen, die die Tröpfchenbildung stört, oder durch eine Proteinprobe, die ausgetrocknet und die schmale Spitzenöffnung versiegelt hat. Obwohl die Aspirierte dabei verloren geht, können beide Probleme durch eine Ultraschallwäsche der Spitzen und eine erneute Atmung der Probe gelöst werden. Um nachfolgende Verstopfungen und Probenabfälle zu vermeiden, ist es wichtig, die Flüssigkeitsleitungen vor der Probenabsaugung gründlich zu grundieren (zu spülen) und eine hohe und konstante Luftfeuchtigkeit in der Kammer und dem Mantel aufrechtzuerhalten. Zusätzlich kann eine Proteinprobe mit einer besonders hohen Konzentration trotz gut erhaltener Luftfeuchtigkeit das Spitzenfeuern beeinflussen. Obwohl eine Erhöhung der Feueramplitude auf der Inspect-Lasche das schwache Brennen aufgrund hoher Proteinkonzentration teilweise ausgleichen kann, verbessert eine Verdünnung der Probe mindestens 1:2 das Spitzenfeuern und vermeidet Verstopfungen.

Zweitens kann es schwierig sein, die ideale Dochtgeschwindigkeit zu erreichen, die erforderlich ist, um Eis mit optimaler Dicke für die angestrebte Mischdauer zu erzeugen. Im Allgemeinen erfordern schnellere Mischzeiten einen schnelleren Docht, langsamere Mischzeiten erfordern einen langsameren Docht. Für das idealerweise böse Gitter ist im oberen Kamerabild ein flüssiger Streifen deutlich erkennbar, während bei der unteren Kamera nur eine sehr leichte Verdickung der Gitterstäbe an der Stelle des Streifens sichtbar bleibt. Langsamer Docht, der durch einen dunklen Streifen auf dem unteren Kamerabild angezeigt wird, hinterlässt im Allgemeinen Eis, das für die Bildgebung zu dick ist. Das Fehlen eines Streifens auf beiden Bildern deutet auf einen schnellen Docht hin, der möglicherweise kein Wasser in den Löchern hinterlassen hat (Abbildung S5). Mehrere Faktoren wie Nanodrahtdichte, Plasmareinigungseinstellungen und -dauer sowie Die Zeit der Exposition gegenüber und die eingestellte Kammerfeuchtigkeit können die Dochtgeschwindigkeit beeinflussen. Ein schlechter (langsamer) Docht kann das Ergebnis einer spärlichen Beschichtung von Nanodrähten auf dem Gitter sein. Durch leichte Verdünnung und Erhöhung der Expositionszeit gegenüber der Nanodrahtlösung¹⁶erhöht sich die Dichte und Abdeckung von Nanodrähten auf den Gitterstäben, was eine schnellere Wicking ermöglicht. Wenn die Nanodrahtdichte ausreichend ist, verbessert eine Erhöhung der Wattzahleinstellung oder der Dauer der Plasmareinigung auch den Docht. Die hier empfohlenen Einstellungen sind relativ geringer Stromverbrauch und lange Dauer, können aber bei Bedarf geändert werden.

Wenn jedoch sowohl die spezifische Charge von Gittern als auch die Plasmareinigungseinstellungen in einer früheren Sitzung gut funktioniert haben, kann eine langsame Dochtleistung durch übermäßige Exposition der Nanodrähte gegenüber hoher Luftfeuchtigkeit in der Kammer entstehen, was zu ihrer Sättigung mit Feuchtigkeit und einer verringerten Flüssigkeitshaltekapazität führt. Der gittersättigende Effekt der Kammerfeuchtigkeit kann reduziert werden, indem entweder die verstrichene Zeit zwischen der Pinzettenmontage und dem Gittereintauchen minimiert oder die Systemfeuchtigkeit vor einem Sturz verringert wird. Zu beachten ist allerdings, dass letzteres das damit verbundene Risiko birgt, dass die mit Proteinprobe beladene Spitze verstopft. Um dieses Risiko auszugleichen, kann das Halten der Spitzen in der Hülle, in der eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten wird, die zulässige Zeit für die Montage einer Pinzette mit einem neuen Gitter erhöhen. Schließlich ist zu beachten, dass eine reduzierte Tauchzeit (erreicht durch Erhöhung der Netzbeschleunigung und / oder der maximalen Geschwindigkeit) zu Gittern mit dünnerem Eis führen kann, ohne die Dochteigenschaften des Gitters tatsächlich zu verändern. Da jedoch auch die Mischzeit der beiden Proben reduziert wird, ist die Tauchzeit kein Faktor, der typischerweise geändert wird, um den langsamen Docht zu beheben. Um zu schnelle Dochte zu beheben, die zu Eis führen, das entweder zu dünn ist oder in den Gitterlöchern fehlt, kann das Gegenteil der oben beschriebenen Maßnahmen ergriffen werden.

Spotiton bietet bestimmte Vor- und Nachteile im Vergleich zu anderen Techniken, die für zeitaufgelöste Studien im Subsekundenbereich entwickelt wurden. Da der gemischte Probenstreifen nur 2-4 nL Flüssigkeit aus jedem Spender enthält, reicht ein einziges Aliquot von 3 μL jeder Probe aus, um viele Gitter vorzubereiten - ein entscheidender Vorteil, wenn die Probe begrenzt ist. Darüber hinaus ist die Beobachtung der Probenablagerung mit integrierten Kameras, obwohl nicht ganz einzigartig für Spotiton^17,kein Merkmal anderer Mischgeräte und ermöglicht es, getauchte Gitter einer groben Pass/Fail-Bewertung zu unterziehen, wodurch die Screening-Zeit erheblich verkürzt wird. Ein wesentlicher Nachteil des Systems ist eine minimale Mischzeit von 90 ms, begrenzt durch die physikalischen Einschränkungen der mechanischen Komponenten, die die Abfrage schnellerer biologischer Reaktionen außer Reichweite bringt. Zum Vergleich: Auf bestehenden mikrofluidischen Systemen werden routinemäßig Zeiten von weniger als 10 ms erreicht. Auf dem Spotiton-basierten, kommerziell erhältlichen Chamäleonsystem haben Design- und Konstruktionsverbesserungen die minimale Tauchzeit auf 54 ms reduziert und die Möglichkeit erhöht, dass die Zugabe eines zweiten Spenders schnellere Mischzeiten ermöglichen könnte, als Spotiton derzeit anbieten kann.

Bis heute wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um frühe, kurzlebige molekulare Zustände mit Spotiton zu untersuchen, einschließlich der Montage des 70S-Ribosoms, kalziumgesteuerter Konformationsänderungen in einem Transmembranionenkanal und der Verengung von Dynamin als Reaktion auf die GTP-Hydrolyse¹⁵. Seit der Veröffentlichung dieser Ergebnisse wurden mehrere Änderungen in das System integriert, um den Durchsatz, die Reproduzierbarkeit und die Berichterstattung von Spotiton-Grid-Making-Sitzungen zu verbessern. Dazu gehören unter anderem das Zweizonen-, automatische Feuchtigkeitsüberwachungs- und -steuerungssystem, die Experiment-Viewer-Funktion, die Side-by-Side-Spitzeninspektionsfunktion und mehrere kleinere Upgrades der Benutzeroberfläche. Das verbesserte System wird zukünftige Zwei-Proben-Mischexperimente, ähnlich den zuvor berichteten, sowie schnelle Bindungsassays wie zwischen einem niedermolekularen Therapeutikum und seinem Proteinziel oder sogar die Bildung von Antikörper-Antigen-Komplexen besser unterstützen. Während aktuelle und zukünftige zeitaufgelöste Experimente mit zwei interagierenden Partnern sicherlich fortgesetzt werden, könnte die Hinzufügung eines dritten piezoelektrischen Dispensers und der zugehörigen Hardware das Spektrum der möglichen Experimente weiter erweitern. Zum Beispiel könnte die anfängliche Ablagerung eines Reinigungsmittels, gefolgt von dem interessierenden Protein, gefolgt vom interagierenden oder aktivierenden Liganden, alle potenziellen negativen Auswirkungen einer längeren Exposition gegenüber dem Waschmittel beseitigen, die oft notwendig sind, um häufige suboptimale Bildgebungsergebnisse wie bevorzugte Orientierung zu verhindern. Angesichts der bereits veröffentlichten Arbeiten und potenzieller zukünftiger Anwendungen stellt Spotiton ein wichtiges Werkzeug für die Kryo-EM-Community dar, um die Durchführung von zeitaufgelösten Studien im Subsekundenbereich zu erleichtern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer	N/A	N/A
cryogenic grid storage boxes	EMS (Hatfield, PA; USA)	N/A
Cu/Rh 300 mesh EM grids	EMS (Hatfield, PA; USA)	EMS300-Cu-Rh	treated to coat with nanowires as previously described (Wei et al, 2018)
ethane gas	TW Smith Corp. (Brooklyn, NY; USA)	N/A
Grid-handling forceps	EMS (Hatfield, PA; USA)	78320-5B
liquid nitrogen	Airgas, Inc. (Radnor, PA; USA)	N/A
liquid nitrogen reservoir with brass ethane cup (from FEI Vitrobot)	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA; USA)
Picosystem	Hydro System and Supplies (Durham, NC; USA)	N/A	water purification system
Protein/other sample	N/A	N/A
Solarus 950 plasma cleaner	Gatan, Inc. (Pleasanton, CA; USA)	N/A