Summary
提供了用于在微流控芯片上培养和操作小鼠胚胎组织的方案。通过应用通路调节剂的脉冲,该系统可用于外部控制信号振荡,以研究小鼠造粒机的功能。
Abstract
发育中的小鼠胚胎的术前中胚层的周期性分割由信号通路网络控制。信号振荡和梯度被认为分别控制了段形成的时间和间距。虽然所涉及的信号通路在过去几十年中得到了广泛的研究,但缺乏信号振荡在控制造粒体中起作用的直接证据。为了能够对信号动力学进行功能研究,微流体是用于这些动力学的微妙调节的先前建立的工具。通过这种基于微流体的夹带方法,内源性信号振荡通过通路调节剂的脉冲同步。例如,这可以调制振荡周期或两个振荡路径之间的相位关系。此外,可以沿着组织建立通路调节剂的空间梯度,以研究信号梯度的特定变化如何影响体细胞生成。
本方案旨在帮助为首次使用微流体的用户建立微流体方法。描述了建立微流体系统所需的基本原理和设备,并提供了芯片设计,使用3D打印机可以方便地制备用于芯片生成的模具。最后,讨论了如何在微流体芯片上培养初级小鼠组织以及如何将信号振荡夹带到通路调节剂的外部脉冲中。
这种微流体系统还可以适应于容纳其他 体内 和 体外 模型系统,如胃类和类器官,用于在其他情况下信号动力学和形态原梯度的功能研究。
Introduction
发育由通过信号通路的细胞间通信控制。只有有限数量的信号通路在空间和时间上协调组织的复杂形成和适当的细胞分化。为了调节这众多的过程,可以将信息编码在信号通路的动态中,即通路随时间的变化,例如信号的频率或持续时间1,2。
在造粒过程中,体细胞组织周期性地从前中胚层(PSM)3中分离出来。PSM在空间上由Wnt,成纤维细胞生长因子(FGF)和视黄酸信号传导梯度组织。在测定前端的前PSM中,Wnt和FGF信号较低,细胞被准备分化成体细胞。当转录激活波到达该确定前沿时,就会发生分化。在PSM内,Wnt,FGF和Notch信号振荡。邻近细胞轻微失相振荡,导致Wnt,FGF和Notch通路下游的振荡转录激活波从后PSM传播到前PSM。在小鼠胚胎中,转录波大约每2小时到达测定前沿并启动somite形成。通过扰动或激活信号通路来研究躯体生成可以说明这些通路的重要性4,5,6,7,8,9。然而,为了能够研究信号动力学在控制细胞行为中的功能,必须巧妙地调节信号通路,而不是永久激活或抑制它们。
为了在时间上调节分段小鼠胚胎内的信号通路活性,Sonnen等人开发了一种微流体系统10。该系统允许严格控制包含生物样品的芯片微通道内的流体流动11。为了研究信号动力学对PSM正确分割的重要性,利用这种微流体设置来调制离体小鼠分割时钟的信令 动力学。通过将通路激活剂或抑制剂依次脉冲到培养室中,可以实现对Wnt,FGF和Notch信号传导动力学的外部控制10。例如,可以修改单个通路的周期和多个振荡信号通路之间的相位关系。使用动态信号报告基因的伴随实时成像,可以分析夹带对通路本身,分化和somite形成的影响。利用这种对信号动力学的控制水平,强调了造粒过程中Wnt和Notch信号通路之间相位关系的重要性10。
个性化芯片设计允许在局部环境中进行时空扰动的大量选择,例如,稳定的梯度形成12,13,14,15,脉动激活/抑制10,16,17,18或局部扰动19,20.由于实验处理的自动化,微流体还可以实现更可重复的读出和更高的通量21,22,23。目前的方案旨在将组织内的微流体和内源性信号振荡的夹带带到每个标准生命科学实验室。即使没有用于芯片生成的复杂设备,例如洁净室和软光刻设备,也可以制造微流控芯片并用于解决生物学问题。模具可以使用免费提供的计算机辅助设计(CAD)软件进行设计。用于生成微流控芯片的模具通常由聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成,可以用3D打印机打印,也可以从打印公司订购。通过这种方式,微流控芯片可以在一天内生产出来,而无需昂贵的设备24。在这里,提供了一种芯片设计,通过该芯片,可以使用3D打印机打印用于在二维(2D)离体培养物25中夹带小鼠分割时钟的模具。
由微流体实现的片上培养和精确扰动在揭示信号通路如何控制多细胞行为的分子机制方面具有突出的潜力。信令动力学和形态原梯度是开发中的许多过程所必需的。以前,实验室已经在微流控芯片中培养细胞,组织和整个生物体,并且在其他地方提供了主要用于2D细胞培养的时空扰动的方案12,26,27,28,29。应用微流体来调节多细胞系统中的局部环境,为高通量和精确的时空扰动开辟了新的视角。微流体领域现在已经达到了一个地步,它已成为发育生物学家的非专业,廉价且易于应用的工具。
这里,提供了一种将小鼠分割时钟夹带到Notch信号抑制剂脉冲的协议。这样的实验包括以下步骤:(1)微流控芯片的生成,(2)芯片的管材和涂层的制备,以及(3)微流控实验本身(图1A)。涉及脊椎动物模型系统的研究需要事先获得负责委员会的伦理批准。
Protocol
这里介绍的研究已获得EMBL伦理委员会10 和荷兰动物研究委员会(dierenexperimentencommissie,DEC)的批准,并遵循Hubrecht动物护理指南。
使用液体PDMS时戴上手套。覆盖表面和设备。立即清除任何溢出物,因为一旦硬化,清洁就会变得困难。
1. 芯片的产生
注:微流控芯片是通过在模具中铸造PDMS(聚二甲基硅氧烷)而产生的。可以使用CAD软件(例如uFlow或3DμF30)设计模具。麻省理工学院(Metafluidics.org)提供了免费设计库。模具要么用3D打印机打印,要么可以使用包含所需设计的光掩模通过软光刻生成(有关更多信息,请参见,例如,Qin等人,201031)。在这里,提供了一种模具设计,该模具可以用3D打印机打印,用于小鼠胚胎组织的片上培养(图1B,C,补充文件1和2)。为了允许使用较低分辨率的3D打印机进行打印,与之前发布的one10相比,该设计已经过修改。提供没有气泡捕集器的模具和带气泡捕集器的模具(分别为补充文件1和2 )。由于打印过程取决于可用的打印机,因此不会描述打印的详细信息。但是,必须确保完全去除所有未聚合的树脂。通常需要用溶剂进行额外的洗涤,以从微流体室内的小<200μm孔中除去未聚合的树脂。这些孔将形成PDMS柱,以在实验过程中将胚胎组织捕获在芯片内。PDMS通常用于微流体,因为它便宜,生物相容性,透明,并且具有低自发荧光。固化后,PDMS芯片从模具中切出并粘合到载玻片上。玻璃和PDMS芯片的等离子体处理激活表面,并在接触时形成共价键。
- 通过将单体与催化剂以9:1的比例(w:w)混合以诱导聚合来制备所需量的PDMS。使用一次性工具进行混合,例如塑料杯和叉子。确保正确实现混合。
- 将PDMS混合物置于干燥器中,并真空约30分钟,以从PDMS混合物中除去空气。由于干燥器内的真空,空气将从PDMS混合物中除去。
注意:用纸巾覆盖干燥器的内部,以防PDMS流过。 - 将PDMS混合物倒入芯片模具中(约3-5毫米的PDMS层就足够了)。
- 将充满PDMS的模具放回干燥器中,并施加真空以除去任何剩余的气泡。确保从模具的所有较小结构中除去空气。
- 通过将模具置于65°C(或更低的温度取决于模具材料)烤箱中过夜来固化模具。使用手术刀将芯片从模具中切出。将硬化的PDMS从模具中切割出来,在设计周围留出足够的空间(1-2厘米),以便以后粘合。确保完全切断PDMS,以防止取出时芯片破裂。小心地抬起PDMS芯片,首先用手术刀的钝端,如果可能的话,用手。
- 打孔和出气孔,从微流体室内部开始,使用1 mm活检冲头。
- 用压缩空气短暂清洁PDMS芯片,并在两侧贴上胶带,以清除任何卡住的PDMS碎片和灰尘,并保持清洁,直到进一步使用。
注意:芯片可以保持如下,直到进一步使用。 - 用压缩空气清洁载玻片。注意不要损坏。从 PDMS 芯片上取下胶带。
- 使用等离子烤箱将芯片粘合到载玻片上。以下说明针对空气等离子体进行了优化。
注意:请参阅实验室等离子烘箱的手册,并针对特定实验优化程序。- 将芯片和载玻片放入等离子烤箱中,其两侧朝上粘合。
- 将盖子放在等离子烤箱上,并在施加真空的同时将其固定到位,然后等待真空建立。
- 按下 Gas 按钮打开 气体 ,等待约 1 分钟(压力应在 0.37 mbar 左右)。
- 通过压制 发电机 产生等离子体(功率:9.0,时间:1分钟)。
- 完成后,关闭泵和气体;通风并打开门。
- 通过将激活的表面相互放置并均匀施加压力,将芯片粘合到玻璃上。小心玻璃不会破裂。
注意:可以进行水测试以确认等离子体处理是否有效。在玻璃表面上滴一滴水。如果等离子体处理有效,水应立即扩散而不是形成液滴。
- 将粘合的芯片置于65°C的烘箱中5分钟。
- 用胶带密封芯片的外露面,以防止灰尘进入入口。
注:芯片可以保留直至使用。在此之前,应用胶带封闭开口。
2. 准备微流体实验
注意:进行微流体实验需要以下准备步骤:首先,在执行微流体实验时,从入口到出口产生流体流动。由于入口的压力积聚,芯片中的任何孔都将用作出口。因此,必须关闭所有未使用的孔;例如,用于将组织加载到芯片上的孔。如果这些没有闭合,组织可能会随液体流出。为了关闭这些孔,使用PDMS填充的管子。PDMS填充的管子可以无限期保存,因此不需要为每个微流体实验单独制备,而是可以大批量生产。其次,在微流体实验开始之前,准备并进行UV灭菌的管子,PDMS填充的管子和实验所需的芯片。最后,芯片必须涂覆纤连蛋白,以便胚胎组织可以附着在玻璃上25。
- 制作充满PDMS的卡套管。
- 取±1米的油管。通过采用多块卡套管,可以用PDMS填充更多的管子。
- 通过将单体与催化剂以9:1的比例(w:w)混合以诱导聚合来制备所需量的PDMS。
注意:使用一次性工具混合,如塑料杯和叉子。正确混合。 - 将PDMS混合物置于干燥器中,并真空约30分钟,以从PDMS混合物中除去空气。
注意:用纸巾覆盖干燥器的内部,以防PDMS流过。 - 在 3 mL 注射器中加入 PDMS。小心填充以防止混合物中形成气泡。
- 使用镊子将22 G针的尖端插入管子。
注意:注意不要用针刺穿管子或手指。 - 通过针头将管子连接到PDMS填充的注射器上。使用注射泵填充管道,流速约为500μL / h。注意不要施加太高的压力,以防止泵破裂。
- 一旦管道完全充满PDMS,将其放入15厘米的培养皿中并在室温下固化(至少过夜)。
- 为实验准备管材和芯片。
注意:实验需要以下管道:首先,每个出口约50厘米的管道,其次,每个入口约2-3米(确切尺寸取决于稍后使用的泵,培养箱或显微镜的空间组织)。入口管需要很长,以使培养基在实验过程中与CO2 平衡以进行胚胎培养。- 以45°角切割管子,以形成尖头;这将使将管子插入芯片的孔中变得更加容易。将一根针连接到每个进气管。请参阅步骤 2.1.5。
- 将充满 PDMS 的管道切成 ±1 cm 的插头。以45°角切割,以创建尖头;这将使将管子插入芯片的孔中变得更加容易。需要足够的塞子来填充未连接到任何管道的每个孔。
- 从芯片上取下胶带。
- 将所有连接有针头的管子,芯片和插头放入培养皿中,并通过暴露在紫外线下±15分钟进行灭菌。可以使用任何具有紫外线杀菌可能性的细胞培养罩。
- 用纤连蛋白涂覆芯片。
注意:对于后PSM的2D 离体 培养物,用纤连蛋白涂覆芯片。- 将芯片放入室温下含有PBS + 1%青霉素/链霉素的烧杯中。确保芯片完全被PBS覆盖。用PBS冲洗芯片,用P200移液器除去空气。
注意:在实验开始之前,芯片的所有进一步处理都将在此烧杯中完成,以防止空气进入芯片。小心不要破坏芯片的载玻片。 - 在PBS中准备2毫升1:20纤连蛋白,然后放入烧杯中。
- 为芯片的每个腔室装入3 mL注射器。使用镊子,将22 G针插入出口管中。将针头连接到含有纤连蛋白的注射器上。
- 将注射器连接到注射器泵。冲洗管子,直到管子里没有空气。
- 将出口管连接到芯片的出口。确保将管子一直推到底部。设置低流速以涂覆芯片。所有其他开口都可以保持打开状态。让注射泵运行至少2小时,也可以运行一夜。
- 停止泵。在针头之后立即切断管子。其余的管道将在以后的实验中用作出口。
- 将芯片放入室温下含有PBS + 1%青霉素/链霉素的烧杯中。确保芯片完全被PBS覆盖。用PBS冲洗芯片,用P200移液器除去空气。
3. 微流体实验
注意:这里,提出了一种通过应用Notch信号抑制剂DAPT的脉冲在2D 离体 培养物中夹带小鼠分割时钟的方案。应用周期为130分钟的脉冲,接近小鼠分割时钟的自然周期(137 min25),可以有效地夹带。施加100分钟培养基和30分钟2μM DAPT的脉冲(图2A)。使用荧光染料监测芯片内药物的存在。这种染料和荧光信号报告基因的激发光谱和发射光谱必须足够不同,以防止在荧光实时成像过程中渗漏。当黄色荧光蛋白用作信号报告时,例如Notch信号报告器LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe),可以应用Cascade Blue染料。为了鉴定荧光染料和报告者的其他可能组合,可以使用免费提供的光谱查看器。夹带效应可以通过动态信令报告者的实时成像来检测5,10,32。每个芯片有两个孵育室。这允许直接比较药物脉冲(DAPT)以控制脉冲(DMSO)。
- 制作介质和脱气。
- 在实验当天,准备50mL培养基(DMEM-F12补充0.5mM葡萄糖,2mM谷氨酰胺和1%BSA,以进一步了解小鼠尾芫培养物的信息,请参阅25)。
- 准备充满培养基的注射器进行实验。在烧杯中制备培养基:为了夹带Notch信号振荡,准备6mL培养基与1.2μLDMSO + 10μM级联蓝;6 mL培养基,2 μM DAPT + 10 μM级联蓝;两个试管,每个试管含有 6 mL 培养基。每个注射器至少使用6毫升培养基。将注射器与培养基一起加载。确保在含有药物和DMSO的注射器上贴上标签。
- 在PBS内对芯片和干燥器中含有介质的注射器进行脱气。将注射器放入烧杯中,尖端朝上,以便空气可以在顶部逸出。芯片可能会漂浮并且仍然充满气泡。这些将随后被删除。
- 尝试使用P200移液器冲洗/吸走芯片中的大部分气泡。如果残留了一些空气,将在以下实验中将其清除。
- 在泵中安装注射器,并将入口管连接到注射器上。要夹带Notch信号,请使用两个注射器泵,一个携带中等注射器,一个携带药物/ DMSO注射器。让它以更高的流速(0.5 mL / h)运行,直到实验开始,以从管道中除去气泡。小心在泵中正确设置注射器细节(直径)。
- 将组织加载到芯片上。
- 解剖小鼠胚胎组织。解剖尾巴(尾花)的最后端。将解剖的组织放入培养基+ 25μM HEPES中。
- 使用P200用培养基+ 25μMHEPES冲洗芯片以除去PBS。
- 使用P200移液器将组织加载到芯片中(图1C)。确保不要将气泡引入芯片。
注意:高效装载需要一些练习。如果组织的方向不正确,可以通过小心地吸出并再次冲洗来翻转它。然而,这通常会导致细胞快速死亡。 - 在每个组织加载步骤之后,使用一块PDMS填充的管子关闭相应的组织加载入口。确保使用钝镊子将插头充分推到芯片底部。
- 装载完所有样品后,使用钝钳用PDMS填充的管子关闭任何未使用的入口/出口。
- 微流体装置的组装。
- 降低微流体泵的流速。60-100 μL/h适用于小鼠胚胎尾芽。在较高的流速下,观察到细胞死亡 - 可能是由于细胞剪切过高。在给定时间,多个泵的累积流量不应超过每个微流体室60-100μL / h。
- 将管子连接到微流控芯片上。这样做不会在芯片内部产生气泡(这可以通过确保管子末端存在一滴介质来实现)。纤连蛋白涂层的出口仍然存在(见2.3)。
- 一旦所有管子都连接到芯片上,将其从烧杯中取出,适当干燥,将其放入培养皿中,然后将其与约1.5m的入口管一起放入培养箱(37°C,20%O2,5%CO 2)中过夜培养。管道是透气的;这将允许介质中O2 和CO2 的平衡。或者,对于同步荧光实时成像,将芯片和约1.5 m的进气管直接放入显微镜中。该芯片的支架适合标准的 96 孔板支架,在 补充文件 3 中提供。
注意:在孵育过程中,请确保湿度足够高。如有必要,将湿组织添加到成像室或培养箱中,以防止微流体设置中的蒸发。如果显微镜培养箱中的湿度过低,则会导致管道和微流控芯片中形成气泡。然后可以使用封闭的成像盒,其中放置芯片和管子。制作这种成像盒的最简单方法是在芯片上放置一个大盖子并添加湿纸巾,而不必完全关闭。确保泵和切屑之间的高度差不会太大,如有必要,请缓慢改变高度,以防止由于重力作用而形成气泡。 - 让所有泵以20μL/h的流速流动20分钟,在设置放置到其最终位置后。由于腔室和泵的高度很可能已经移动,因此这对于在管道中重新建立正确的压力是必要的。
- 关闭药物泵,仅让培养基泵以60μL / h的速度运行,直到实验/实时成像开始。
- 实验开始。
- 启动实验的计划泵送计划。为了夹带Notch信号传导,使用100分钟培养基和30分钟药物脉冲的泵送程序,重复直到实验结束,通常持续24小时。
注:可以使用任何可编程微流体泵。在最简单的格式中,泵可以手动编程和启动。或者,泵可以通过计算机软件进行控制。 - 如果执行实时成像,请在至少30分钟后开始成像。这将允许芯片的温度调整到培养箱内的温度,并防止成像过程中出现过强的漂移。自动对焦仍然是有益的。
- 使用倒置显微镜通过芯片的载玻片执行标准共聚焦成像。使用10分钟的成像间隔来充分检测130分钟周期的信号振荡。
- 对于较短的时间段,请缩短间隔以获得足够的采样。包括用于检测Cascade Blue的低分辨率成像轨迹,以可视化芯片上是否存在药物。
- 对于Venus报告者的激发,请使用波长为960nm的515nm激光或2光子激光。
- 通过 20 倍平面物镜(分辨率 512 x 512 像素,1.38 μm/像素)获取距离为 8 μm 的 6-8 个平面的 z 堆栈。使用电动载物台对一个实验中的多个样品进行成像。
- 用405 nm激光激发级联蓝,每10分钟采集一个z平面(分辨率32 x 32像素,22.14μm/像素)。
注:有关成像和图像分析的更多信息在代表性结果中提供,可在参考文献中找到10。
- 启动实验的计划泵送计划。为了夹带Notch信号传导,使用100分钟培养基和30分钟药物脉冲的泵送程序,重复直到实验结束,通常持续24小时。
Representative Results
利用该协议,提出了一种使用微流体对小鼠分割时钟的信令振荡进行外部夹带的方法。通过应用Notch信号抑制剂的脉冲,独立胚胎培养物中的信号振荡彼此同步10。应用该系统研究分段时钟功能的先决条件是,片上仍然存在信令动态和分段。先前已经表明,尽管培养基流动恒定,并且外周2D培养物中物理边界形成仍然存在,但Wnt和Notch信号动力学都得以维持,代表前PSM10。
为了确认信号振荡与外部药物脉冲的夹带,在微流体实验期间,对表达黄色荧光蛋白Venus的Notch信号报告人LuVeLu5进行了实时成像。由于芯片上2D培养物的方向难以控制,因此分析了前组织中的信号振荡。可以可重复地检测2D培养物的外围。芯片上组织切片的方向不能随意控制,芯片的整个内表面都涂有纤连蛋白。因此,偶尔会发生文化附着在芯片的侧面或天花板上的情况。如果样本移出视野(在x,y和z方向)或它们与尾巴的后端朝下相连,通常这些样本被排除在外。
为了进一步分析,将多个这样的夹带实验组合在一起。独立实验可以使用染料Cascade Blue在大约400nm处可视化的药物脉冲的时间相互对齐。为了分析和可视化同步,可以去趋势化量化振荡(图2B,D),然后显示为平均和标准偏差或振荡的相位。这允许分析独立后胚胎培养物相互振荡以及与外部药物脉冲之间的相位关系(图2C,E)。基于python的程序pyBOAT33 是一个简单易用的工具,用于确定此类信号振荡的周期,相位和幅度。例如,为了确认夹带,可以确定内源性信号振荡的周期。当施加周期为130分钟的脉冲时,Notch信号振荡也显示130分钟(图2F)10。此外,使用Cascade Blue脉冲,具有不同信令报告基因的独立实验可以相互对齐。通过这种方式,可以间接确定多个信令报告程序振荡之间的相位关系10。
因此,所呈现的微流体系统允许控制发育中的小鼠胚胎的离体培养物中的信号振荡。结合用于片段形成和分化的标记物的成像,该系统现在可以应用于剖析分割时钟的信号通路如何相互作用以及它们如何控制somite形成。
图1:微流体协议的示意图概述。(A)芯片模具可以使用计算机辅助设计(CAD)软件进行设计。提供一种芯片设计,用于在小鼠造粒发生的离体模型中夹带信号振荡。例如,模具可以通过3D打印或订购来生成。微流控芯片是通过PDMS的成型生产的。使用等离子炉将硬化的PDMS芯片切出并共价粘合到载玻片上。芯片内的玻璃表面涂有纤连蛋白,以允许解剖的组织附着。胚胎组织通过装载入口加载到芯片上,随后被关闭。具有不同介质条件的泵连接到芯片的入口处,并初始化流量程序。在实验过程中,可以使用共聚焦显微镜对组织进行成像。(Kymographs改编自Sonnen等人,201810。根据知识共享署名 CC BY-NC-ND 4.0 从 Cell 转载和修改。(B)小鼠后胚胎组织片上培养模具设计示意图。微流体通道的高度为500μm,足以培养后胚小鼠尾巴。用于打印此模具的文件在补充文件1中提供,替代文件2中给出替代方案。(C)由片上PDMS柱子包围的E10.5切片鼠标尾部的明场图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图2:微流体实验的代表性结果(A)使用介质和药物泵夹带实验的示意图。信号通路调节剂的脉冲应用于小鼠胚胎的离体培养物,并且信号振荡可以通过动态信号报告程序(例如,Notch信号报告仪LuVeLu5和Wnt信号报告程序Axin2T2A10)的实时成像来可视化。虚线表示一段时间内用于分析的区域。(B-F)LuVeLu报告振荡由Notch信号抑制剂DAPT的周期性脉冲夹带。(B,D)使用DAPT或DMSO对照定量夹带时前PSM中的Notch信号振荡。(C,E)陷波信号振荡相位与外部DAPT/DMSO脉冲时序之间的相位关系图。在夹带的情况下,建立稳定的相关系。(F) 量化报告振荡的平均周期和扫描电镜,比较夹带DMSO和DAPT脉冲的样品。(图改编自Sonnenet al.,201810。根据知识共享署名 CC BY-NC-ND 4.0 从 Cell 转载和修改。请点击此处查看此图的放大版本。
问题 | 建议的解决方案 |
PDMS 不会粘合到玻璃上。 | - 确保PDMS和玻璃都很干净。 |
- 确保腔室周围有足够的PDMS用于粘合。 | |
- 优化等离子烤箱的设置。 | |
我的芯片上有气泡。 | - 检查泵是否已打开。 |
- 在将组织装载到芯片上之前对芯片进行脱气。 | |
- 在实验开始前对介质进行脱气。 | |
- 确保孵育室中的湿度足够高。 | |
组织在实验开始时死亡。 | - 在加载和组装芯片时将HEPES添加到介质中。 |
- 在装载过程中,不要太频繁地冲洗纸巾。 | |
- 检查流速是否不太高。 | |
组织在成像过程中死亡。 | - 确保成像中没有光毒性 |
- 确保没有污染。 | |
- 流速不应过高。 | |
成像过程中焦点会发生变化。 | - 在成像过程中使用自动对焦来调整成像载玻片的漂移。 |
- 让芯片在显微镜内平衡至温度至少30分钟。 | |
出口/入口分离。 | - 将所有管子完全向下推到底部。 |
芯片的玻璃破碎了。 | - 要更加小心,玻璃非常脆弱。 |
- 薄玻璃仅用于成像。如果不进行成像,可以使用普通的较厚的载玻片。 | |
- 如果断裂在芯片之外,这可能不是问题。如果芯片的玻璃密封破损,液体会泄漏出来,空气会进入。 | |
我的芯片上有污染。 | - 在培养基中加入抗生素。 |
- 对所有设备和管道进行消毒。 | |
- 工作快速和干净。 |
表 1:故障排除
补充文件 1: STL文件,用于使用3D打印机打印模具。该模具用于生成微流控芯片,用于后胚胎组织的片上培养(设计如图 1所示)。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2: STL文件,用于用3D打印机打印模具,以生成微流体芯片,用于后胚胎组织的片上培养。与 补充文件1 和 图1所示的设计相比,该设计在所有入口处都包含气泡陷阱,以防止少量空气进入主微流体室。 请点击此处下载此文件。
补充文件 3: 设计用于生成支架的设计文件,用于将芯片放入显微镜中。该支架的尺寸与96孔板相同,应适合大多数显微镜的标准支架。 请点击此处下载此文件。
Discussion
信号动力学如何控制多细胞系统一直是该领域长期存在的问题。功能研究带来了一个关键挑战,因为必须对这些动态进行微妙的调制才能实现这一点11。原则上,这种对通路扰动的时间控制可以通过光遗传学来实现,这也实现了高空间控制34。然而,光遗传学需要建立复杂的遗传工具来分析所讨论的每个信号通路。这里描述的当前协议为任何信号通路的扰动提供了一种高度通用的工具。微流体实验允许应用时间控制的药物脉冲来功能性地研究组织培养物中信号通路的动力学。在这里,重点是研究 离体 培养物中的造粒体,但该协议可以适应任何其他模型系统。
该协议中的某些步骤对于成功进行微流体实验至关重要(总结在 表1中)。要点讨论如下。由于实验过程中的培养基流动,组织培养物会经历剪切应力。模型系统暴露于连续流动会导致细胞应激,在极端情况下,由于剪切效应会导致细胞死亡。对于小鼠尾芽的 离体 组织培养物和当前的芯片设计,发现60μL / h(最大100μL / h)的流速在最小的剪切效应下效果良好。当同一芯片同时打开多个泵时,需要相应地调整单个泵的流量,以免导致总流量增加。当当前协议适应其他模型系统和芯片设计时,应优化流速。或者,可以不连续冲洗介质,而是定期更换芯片上的介质35。这种设置也可以应用于控制小鼠造粒中的信号振荡(未发表,数据未显示)。此外,还可以设想一种设置,其中组织培养物不暴露于直接流体流动,但药物通过从相邻通道扩散到达组织。这种系统已成功用于将生长因子的梯度应用于ESC分化的 体外 模型14,36。
微流体实验的一个主要问题是实验过程中芯片上气泡的发生。芯片或管内气泡会干扰芯片上的均匀液体流动,并可能导致胚胎培养物从其位置移除。为了防止气泡的存在,协议的各个步骤是必不可少的。首先,注射器内的培养基和微流控芯片本身必须使用干燥器进行脱气(步骤3.1.3)。其次,当将样品装入装样口时,必须注意不要将空气与样品一起移入芯片中(步骤3.2.3)。第三,当用介质填充管道时,在连接芯片之前必须泵出所有气泡(步骤3.3.2)。否则,这些气泡将在实验过程中被推入主芯片。最后,在实验过程中,由于半渗透管,培养基在成像室或培养箱内保持平衡。管道的渗透性也允许介质蒸发,因此请确保在实验过程中调节湿度,以防止在管道中形成新的气泡。
一般来说,微流体是一种高度通用的工具,可以适应研究人员的具体问题。目前的设计方法允许每个芯片并行成像多达12个 离体 培养物。这个数字主要受到每个实验的胚胎数量以及以足够分辨率对每个胚胎培养物进行成像所需的时间的限制。如果需要在单个实验中比较多个条件,则可以将多个芯片安装在单个载玻片上。该芯片设计非常适合并行成像多个组织外植体,但个性化设计可以克服样品数量的限制,从而实现高通量分析,并在单个实验中增加更多条件的组合16,17。微流体仅限于可以在芯片上培养的模型,并且必须针对每个模型系统单独优化片上培养27,37,38。
在过去的5-10年中,微流体已被应用于解决各种生物学问题,因为它具有高通量方法的潜力以及信号动力学和梯度的微妙调节。如今,微流体已成为实验室可以轻松建立的一种易于应用,便宜且多功能的工具。在这里,当前的方案针对特定应用进行了优化,即研究控制造粒产生的信号动力学。调整该协议和设计以适应组织生物学中的个人研究问题是很简单的。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢UMC乌得勒支的Yang Li和Jos Malda在模具3D打印方面的帮助,来自Sonnen小组的Karen van den Anker对协议提供了非常有用的反馈,以及来自Hubrecht研究所机械车间的Tjeerd Faase,用于显微镜内微流体芯片的支架。我们要感谢整个Sonnen小组对手稿的批判性阅读,并感谢审稿人的建设性反馈。这项工作获得了欧洲研究理事会的资助,根据ERC开始资助协议,第850554号K.F.S.。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
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