Summary
Ett protokoll för odling och manipulering av mus embryonal vävnad på ett mikrofluidiskt chip tillhandahålls. Genom att applicera pulser av vägmodulatorer kan detta system användas för att externt kontrollera signalerande svängningar för funktionell undersökning av mus somitogenes.
Abstract
Periodisk segmentering av presomitisk mesoderm av ett utvecklande musembryon kontrolleras av ett nätverk av signalvägar. Signalerande svängningar och gradienter tros styra tidpunkten respektive avståndet för segmentbildning. Medan de inblandade signalvägarna har studerats i stor utsträckning under de senaste decennierna, har direkta bevis för funktionen av signalering svängningar i kontrollera somitogenesis saknats. För att möjliggöra en funktionell undersökning av signaldynamiken är mikrofluidik ett tidigare etablerat verktyg för subtil modulering av dessa dynamiker. Med denna microfluidics-baserade entrainment strategi endogena signalering svängningar synkroniseras av pulser av utbildningsmodulerare. Detta möjliggör modulering av till exempel svängningsperioden eller fasförhållandet mellan två oscillerande vägar. Dessutom kan rumsliga gradienter av vägmodulatorer etableras längs vävnaden för att studera hur specifika förändringar i signalgradienterna påverkar somitogenes.
Det nuvarande protokollet är avsett att hjälpa till att fastställa mikrofluidiska metoder för första gången användare av mikrofluidik. De grundläggande principerna och utrustningen som behövs för att installera ett mikrofluidiskt system beskrivs, och en chipdesign tillhandahålls, med vilken en form för spångenerering bekvämt kan förberedas med en 3D-skrivare. Slutligen, hur man odlar primära musvävnad på ett mikrofluidiskt chip och hur man entrain signalerar svängningar till externa pulser av utbildningsmodulatorer diskuteras.
Detta mikrofluidiska system kan också anpassas för att hysa andra in vivo- och in vitro-modellsystem som gastruloider och organoider för funktionell undersökning av signaldynamik och morfengradienter i andra sammanhang.
Introduction
Utvecklingen styrs av intercellulär kommunikation via signalvägar. Det finns bara ett begränsat antal signalvägar som orkestrerar den komplexa bildandet av vävnader och korrekt celldifferentiering i tid och rum. För att reglera denna mängd processer kan information kodas i dynamiken i en signalväg, förändringen av en väg över tid, till exempel frekvensen eller varaktigheten av en signal1,2.
Under somitogenesis segmenteras somitic vävnad periodiskt bort från presomitic mesoderm (PSM)3. PSM är rumsligt organiserad av gradienter av Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) och Retinsyra signalering. I främre PSM på bestämningsfronten, där Wnt- och FGF-signaler är låga, är cellerna primade för differentiering till somiter. Differentiering sker när en våg av transkriptionsaktivering når denna bestämningsfront. Inom PSM, Wnt, FGF och Notch signalering svänger. Närliggande celler svänger något ur fas, vilket resulterar i vågor av oscillatory transkriptionell aktivering nedströms Wnt, FGF och Notch vägar som reser från bakre till främre PSM. I musembryon når en transkriptionsvåg bestämningsfronten ungefär var 2:e timme och initierar somitbildning. Att studera somitogenes genom att störa eller aktivera signalvägar kan illustrera vikten av dessa vägar4,5,6,7,8,9. Men för att kunna undersöka funktionen av signaldynamik i kontrollen av cellulärt beteende är det viktigt att subtilt modulera signalvägar istället för att permanent aktivera eller hämma dem.
För att tidsmässigt modulera signalvägsaktiviteten inom det segmenterande musembryon har Sonnen m.fl. utvecklat ett mikrofluidiskt system10. Detta system möjliggör tät kontroll av vätskeflöden i mikrokanaler i ett chip som innehåller det biologiska provet11. För att studera vikten av signaldynamik för korrekt segmentering av PSM används denna mikrofluidikinställning för att modulera signaldynamiken hos mussegmenteringsklockan ex vivo. Genom sekventiellt pulserande vägaktivatorer eller hämmare in i kulturkammaren uppnås extern kontroll av dynamiken hos Wnt- och FGF- och Notch-signalering10. Det är till exempel möjligt att ändra perioden för enskilda vägar och fasförhållandet mellan flera oscillatoriska signalvägar. Med hjälp av samtidig realtidsavbildning av dynamiska signalreportrar kan effekten av entrainment på själva vägarna, på differentiering och somitbildning analyseras. Med hjälp av denna nivå av kontroll över signalering dynamik, vikten av fas förhållandet mellan Wnt- och Notch-signalering vägar under somitogenesis betonades10.
Personliga chipdesigner möjliggör en mängd alternativ för spatiotemporala störningar i den lokala miljön, t.ex. stabil gradientbildning12,13,14,15, pulsatil aktivering / hämning10,16,17,18 eller lokaliserade stör19,20 . Mikrofluidik kan också möjliggöra en mer reproducerbar avläsning och högre genomströmning på grund av automatisering av experimentell hantering21,22,23. Det nuvarande protokollet är avsett att föra mikrofluidics och entrainment av endogena signalering svängningar inom vävnader till varje standard livsvetenskap labb. Även i avsaknad av sofistikerad utrustning för spångenerering, såsom renrum och utrustning för mjuklitografi, kan mikrofluidiska chips tillverkas och användas för att ta itu med biologiska frågor. Formar kan utformas med hjälp av fritt tillgänglig datorstödd design (CAD) programvara. En form för generering av mikrofluidiska chips, vanligtvis bestående av polydimethylsiloxan (PDMS), kan skrivas ut med en 3D-skrivare eller beställas från tryckerier. På så sätt kan mikrofluidiska chips produceras inom en dag utan krav på dyr utrustning24. Här tillhandahålls en chipdesign, med vilken en form för entrainment av musen segmentering klocka i tvådimensionella (2D) ex vivo kulturer25 kan skrivas ut med en 3D-skrivare.
On-chip kulturer och exakta stör, möjliggjort av mikrofluidics, har enastående potential i att nysta upp de molekylära mekanismerna för hur signalvägar styr multicellulärt beteende. Signaldynamik och morfengradienter krävs för många processer under utveckling. Tidigare hade laboratorier odlade celler, vävnader och hela organismer i mikrofluidiska chips och protokoll för spatiotemporal perturbation av främst 2D-cellkultur tillhandahålls någon annanstans12,26,27,28,29. Genom att använda mikrofluidik för att modulera lokala miljöer i multicellulära system öppnas nya perspektiv för hög genomströmning och exakta spatiotemporala störningar. Området mikrofluidik har nu nått en punkt där det har blivit ett icke-specialiserat, billigt och lätt tillämpligt verktyg för utvecklingsbiologer.
Här tillhandahålls ett protokoll för entrainment av mussegmenteringsklockan till pulser av en Hack-signalhämmare. Ett sådant experiment består av följande steg: 1) generering av mikrofluidiskt chip, (2) beredning av slangar och beläggning av chipet och (3) själva det mikrofluidiska experimentet (figur 1A). Forskning som involverar ryggradsdjursmodellsystem kräver förhandsetiskt godkännande från ansvarig kommitté.
Protocol
Forskningen som presenteras här har godkänts av EMBL:s etikkommitté10 och den nederländska kommittén för djurforskning (dierenexperimentencommissie, DEC), och följer Hubrechts riktlinjer för djurvård.
Använd handskar när du arbetar med flytande PDMS. Täck ytor och utrustning. Ta bort eventuella spill omedelbart, eftersom rengöringen blir svår när den är härdad.
1. Generering av chipet
OBS: Mikrofluidiska spånor genereras genom gjutning av PDMS (Polydimethylsiloxan) i en form. Formar kan utformas med CAD-programvara (t.ex. uFlow eller 3DμF30). Ett arkiv med gratis design tillhandahålls av MIT (Metafluidics.org). Formar skrivs antingen ut med en 3D-skrivare eller kan genereras av mjuk litografi med hjälp av en fotomask som innehåller önskad design (för ytterligare information se t.ex. Qin m.fl., 201031). Här tillhandahålls en design för en form som kan skrivas ut med en 3D-skrivare för on-chip-kulturen av musembryonvävnad (figur 1B, C, kompletterande filer 1 och 2). För att tillåta utskrift med 3D-skrivare med lägre upplösning har designen ändrats jämfört med den tidigare publicerade 10. En form utan luftbubbla fällor och en med luftbubbla fällor tillhandahålls (Kompletterande filer 1 respektive 2). Eftersom utskriftsproceduren är beroende av vilken skrivare som är tillgänglig kommer informationen för utskrift inte att beskrivas. Man måste dock se till att allt ofpolymeriserat harts är helt borttaget. Det är ofta nödvändigt att utföra extra tvätt med lösningsmedel för att avlägsna ofpolymeriserat harts från de små < 200 μm hålen i den mikrofluidiska kammaren. Dessa hål kommer att bilda PDMS-pelare för att fånga den embryonala vävnaden i chipet under experimentet. PDMS används vanligtvis för mikrofluidik, eftersom det är billigt, biokompatibelt och transparent och har låg autofluorescens. Efter härdning skärs PDMS-chipet ut ur formen och binds på en glasrutschbana. Plasmabehandling av både glaset och PDMS-chipet aktiverar ytorna och möjliggör bildandet av kovalenta bindningar när de kommer i kontakt.
- Förbered den erforderliga mängden PDMS genom att blanda monomeren med katalysatorn i ett 9:1-förhållande (w:w) för att inducera polymerisation. Använd engångsverktyg för att blanda, till exempel plastmuggar och gafflar. Se till att blandningen uppnås på rätt sätt.
- Placera PDMS-blandningen i en desiccator och applicera vakuum i cirka 30 minuter för att avlägsna luft från PDMS-blandningen. På grund av vakuumet i avsiccatorn kommer luft att avlägsnas från PDMS-blandningen.
OBS: Täck insidan av desiccatorn med vävnader om PDMS flyter över. - Häll PDMS-blandningen i spånformen (ett PDMS-lager på cirka 3-5 mm räcker).
- Placera formen fylld med PDMS tillbaka i avsickatorn och applicera vakuum för att ta bort eventuella återstående bubblor. Se till att luft avlägsnas från alla mindre strukturer i formen.
- Härda formen genom att placera den i en ugn på 65 °C (eller lägre beroende på mögelmaterialet) över natten. Skär ut spånet ur formen med en skalpell. Skär ut det härdade PDMS ur formen med tillräckligt med utrymme (1-2 cm) runt designen för att möjliggöra senare bindning. Se till att skära pdms helt för att förhindra att chipet bryts när du tar ut det. Lyft försiktigt av PDMS-chippet, först med skalpellens trubbiga ände och när det är möjligt med händerna.
- Stans inlopp och utloppshål, med början från insidan av den mikrofluidiska kammaren med en 1 mm biopsistans.
- Rengör PDMS-chippet kort med tryckluft och fäst tejp på båda sidor för att ta bort eventuella fastnade bitar av PDMS och damm och hålla det rent tills vidare.
OBS: Chipet kan behållas så här tills vidare. - Rengör glasrutschbanan med tryckluft. Var försiktig så att den inte går sönder. Ta bort tejpen från PDMS-chippet.
- Bind chipet till glasrutschbanan med hjälp av en plasmaugn. Följande instruktioner är optimerade för luftplasma.
OBS: Se handboken för labbets plasmaugn och optimera proceduren för det specifika experimentet.- Placera spånet och glasrutschbanan i plasmaugnen med sidorna som ska bindas uppåt.
- Placera locket på plasmaugnen och håll det på plats medan du applicerar vakuum och vänta tills vakuumet har etablerats.
- Slå på gasen genom att trycka på gasknappen och vänta i cirka 1 min (trycket ska vara cirka 0,37 mbar).
- Generera plasma genom att trycka på generator ( effekt: 9.0, Tid: 1 min).
- Stäng av pumpen och gasen när pumpen är klar. ventilera och öppna dörren.
- Bind chipet till glaset genom att placera de aktiverade ytorna på varandra och applicera trycket jämnt. Var försiktig så att glaset inte går sönder.
OBS: Ett vattentest kan utföras för att bekräfta att plasmabehandlingen har fungerat. Placera en droppe vatten på glasytan. Om plasmabehandlingen har fungerat ska vattnet spridas ut omedelbart istället för att bilda en droppe.
- Placera det bundna spånet i en ugn vid 65 °C i 5 min.
- Försegla den exponerade sidan av spånet med tejp för att förhindra att damm kommer in i inloppen.
OBS: Chipet kan förvaras tills det används. Öppningarna ska stängas med tejp tills dess.
2. Förbereda mikrofluidikexperiment
OBS: Följande förberedande steg är nödvändiga för att utföra mikrofluidikexperimentet: För det första, när man utför mikrofluidikexperimentet skapas ett vätskeflöde från inloppen till utloppen. Eventuella hål i chipet kommer att fungera som utlopp på grund av tryckuppbyggnaden från inloppen. Därför måste alla hål som inte används stängas; till exempel hål som används för att ladda vävnad på chipet. Om dessa inte är stängda kan vävnaden flöda ut med vätskan. För att stänga dessa hål används PDMS-fyllda slangar. De PDMS-fyllda slangarna kan förvaras på obestämd tid och behöver därför inte förberedas för varje mikrofluidikexperiment separat utan kan tillverkas i större partier. För det andra, före början av det mikrofluidiska experimentet, är slangar, PDMS-fyllda slangar och chipet, som krävs för experimentet, beredda och UV-steriliserade. Slutligen måste chipet beläggas med fibronectin, så att den embryonala vävnaden kan fästa på glaset25.
- Gör PDMS-fyllda slangar.
- Ta ±1 m slangar. Mer slangar kan fyllas med PDMS genom att ta flera bitar av slangar.
- Förbered den erforderliga mängden PDMS genom att blanda monomeren med katalysatorn i ett 9:1-förhållande (w:w) för att inducera polymerisation.
OBS: Använd engångsverktyg för att blanda, till exempel plastmuggar och gafflar. Blanda ordentligt. - Placera PDMS-blandningen i en desiccator och applicera vakuum i cirka 30 minuter för att avlägsna luft från PDMS-blandningen.
OBS: Täck insidan av desiccatorn med vävnader om PDMS flyter över. - Fyll en 3 ml-spruta med PDMS. Fyll försiktigt för att förhindra bildandet av luftbubblor i blandningen.
- Använd tång för att föra in spetsen på en 22 G nål i slangen.
OBS: Var försiktig så att du inte punkterar slangen eller fingrarna med nålen. - Fäst slangen på den PDMS-fyllda sprutan via nålen. Använd sprutpumpen för att fylla slangen med en flödeshastighet på cirka 500 μL/h. Var försiktig så att du inte trycker för högt för att förhindra att pumpen går sönder.
- När slangen är helt fylld med PDMS, placera den i en 15 cm skål och härda vid rumstemperatur (minst över natten).
- Förbered slangen och chipet för experimentet.
OBS: Följande slang krävs för experimentet: för det första cirka 50 cm slang per utlopp och andra, cirka 2-3 m per inlopp (den exakta storleken beror på pumparnas, inkubatorns eller mikroskopets rumsliga organisation som används senare). Inloppsslangen måste vara lång för att odlingsmediet ska kunna balansera med co2 för embryokultur under experimentet.- Skär slangen i 45° vinkel så att spetsiga ändar skapas; Detta gör det lättare att sätta in slangen i hålen i chipet. Fäst en nål på var och en av inloppsslangarna. Se steg 2.1.5.
- Skär PDMS-fyllda slangar i ±1 cm pluggar. Skär i 45° vinkel så att spetsiga ändar skapas; Detta gör det lättare att sätta in slangen i hålen i chipet. Tillräckligt med pluggar behövs för att fylla varje hål som inte är fastsatt på några slangar.
- Ta bort tejpen från chipet.
- Placera alla slangar med nålar fästa, chipet och pluggarna i en skål och sterilisera genom att utsättas för UV-ljus i ±15 min. Alla cellodlingshuv med möjlighet till UV-sterilisering kan användas.
- Beläggning av chip med fibronectin.
OBS: För kultur av 2D ex vivo kulturer av bakre PSM, belägga chipet med fibronectin.- Placera chipet i en bägare som innehåller PBS + 1% Penicillin/Streptomycin vid rumstemperatur. Se till att chipet är helt täckt med PBS. Spola chipet med PBS för att avlägsna luft med en P200-pipett.
OBS: All ytterligare hantering av chipet kommer att ske i denna bägare fram till experimentets början för att förhindra att luft kommer in i chipet. Var försiktig så att du inte bryter chipets glasrutschbana. - Förbered 2 ml 1:20 Fibronectin i PBS och fyll i en bägare.
- Ladda en 3 ml-spruta för varje kammare i chipet. För in en 22 G-nål i utloppsslangen med tång. Fäst nålen på sprutan som innehåller fibrokectin.
- Anslut sprutan till sprutpumpen. Spola slangen tills det inte finns någon luft kvar i slangen.
- Fäst utloppsslangen på chipets utlopp. Se till att trycka slangen hela vägen till botten. Ställ in en låg flödeshastighet för att täcka chipet. Alla andra öppningar kan förbli öppna. Låt sprutpumpen gå i minst 2 timmar, kan också köras över natten.
- Stoppa pumpen. Skär av slangen direkt efter nålen. Den återstående slangen kommer att fungera som utlopp under experimentet senare.
- Placera chipet i en bägare som innehåller PBS + 1% Penicillin/Streptomycin vid rumstemperatur. Se till att chipet är helt täckt med PBS. Spola chipet med PBS för att avlägsna luft med en P200-pipett.
3. Mikrofluidikexperiment
OBS: Här presenteras ett protokoll för entrainment av musen segmentering klocka i 2D ex vivo kulturer genom att tillämpa pulser av Notch signaleringshämmare DAPT. Genom att applicera pulser med en period på 130 min, nära den naturliga perioden av mussegmenteringsklockan (137 min25), möjliggör effektiv entrainment. Pulser på 100 min medium och 30 min av 2 μM DAPT appliceras (figur 2A). Förekomsten av läkemedel i chipet övervakas med hjälp av ett fluorescerande färgämne. Excitation och emissionsspektra av detta färgämne och den fluorescerande signalreportern måste vara tillräckligt olika för att förhindra blödning under fluorescens realtidsavbildning. När gula fluorescerande proteiner används som signalreporter, såsom Notch-signalreportern LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic frans), kan färgämnet Cascade Blue appliceras. För att identifiera andra möjliga kombinationer av fluorescerande färgämne och reporter kan fritt tillgänglig spektravisare användas. Effekten av entrainment kan detekteras genom realtidsavbildning av dynamiska signalreportrar5,10,32. Varje chip har två inkubationskammare. Detta gör det möjligt att direkt jämföra läkemedelspulser (DAPT) för att styra pulser (DMSO).
- Gör medium och degas.
- På dagen för experimentet, förbered 50 ml odlingsmedium (DMEM-F12 kompletterat med 0,5 mM glukos, 2 mM glutamin och 1% BSA, för ytterligare information om mus tailbud kultur se25).
- Förbered sprutor fyllda med mediet för experimentet. Förbered odlingsmedium i bägare: För att entrain Notch signalerar svängningar, förbered 6 ml medium med 1,2 μL DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 ml odlingsmedium med 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; två rör med 6 ml medium vardera. Använd minst 6 ml medium per spruta. Ladda sprutor med mediet. Var noga med att märka sprutorna som innehåller läkemedel och DMSO.
- Avgasa chipet inom PBS och sprutorna som innehåller medium i en desiccator. Placera sprutorna i en bägare med spetsen uppåt, så att luften kan komma ut på toppen. Det kan hända att chipet flyter och fortfarande är fyllt med bubblor. Dessa kommer att tas bort senare.
- Försök att spola ut/suga upp de flesta luftbubblorna från chipet med en P200-pipett. Om lite luft finns kvar kommer detta att tas bort under följande experiment.
- Montera sprutor i pumparna och fäst inloppsslangarna på sprutorna. För att entrain Notch signalering, använd två sprutpumpar, en som bär medelsprutorna, en som bär drogen / DMSO sprutor. Låt detta köras med ett högre flöde (0,5 ml/h) tills experimentet börjar för att avlägsna luftbubblor från slangen. Var noga med att ställa in sprutdetaljerna (diametern) ordentligt i pumpen.
- Lastning av vävnad på chipet.
- Dissekera musembryonvävnad. Dissekera den mest bakre spetsen av svansen (svansknopp). Placera den dissekerade vävnaden i odlingsmediet + 25 μM HEPES.
- Spola chipet med odlingsmedium + 25 μM HEPES med en P200 för att ta bort PBS.
- Ladda vävnaden i chipet med en P200-pipett (bild 1C). Se till att inte föra in luftbubblor i chipet.
OBS: Effektiv inläsning kräver viss övning. Om vävnaden inte är korrekt orienterad kan det vara möjligt att vrida den genom att försiktigt suga ut och spola in igen. Detta resulterar dock ofta i snabb celldöd. - Efter varje vävnadsbelastningssteg stänger du motsvarande vävnadsbelastningsinlopp med hjälp av en bit PDMS-fyllda slangar. Se till att pluggarna är tillräckligt nedtryckta till botten av chipet med trubbiga pincett.
- När alla prover har laddats, stäng alla oanvända inlopp / uttag med bitar av PDMS-fyllda slangar med trubbiga tång.
- Montering av mikrofluidisk installation.
- Sänk flödet på de mikrofluidiska pumparna. 60-100 μL/h fungerar bra för musembryon tailbuds. Vid högre flöde observerades celldöd – förmodligen på grund av för hög cellskjuvning. Det kumulativa flödet för flera pumpar bör inte överstiga dessa 60–100 μL/h per mikrofluidkammare vid en given tidpunkt.
- Fäst slangar på det mikrofluidiska chipet. Gör detta utan att få luftbubblor inuti chipet (detta kan uppnås genom att se till att det finns en droppe medium närvarande i slutet av slangen). Utlopp finns fortfarande från fibronectinbeläggningen (se 2.3).
- När alla slangar är fästa vid chipet, ta ut det ur bägaren, torka det ordentligt, placera det i en skål och sätt ihop detta med cirka 1,5 m inloppsrör i en inkubator (37 °C, 20% O2, 5% CO2) för över natten kultur. Slangen är gasgenomsläpplig; Detta kommer att möjliggöra jämvikt mellan O2 och CO2 i mediet. Alternativt, för samtidig fluorescens realtidsavbildning, placeras chipet och cirka 1,5 m inloppsrör direkt i mikroskopet. En hållare för chipet, som passar i standard 96-brunnsplåthållare, finns i kompletterande fil 3.
OBS: Se till att luftfuktigheten är tillräckligt hög under inkubationen. Tillsätt vid behov en fuktig vävnad i bildkammaren eller inkubatorn för att förhindra avdunstning i mikrofluidikuppsättningen. Om luftfuktigheten i mikroskopinkubatorn är för låg resulterar detta i luftbubblabildning i slangen och det mikrofluidiska chipet. En sluten bildbox, där spån och slangar placeras, kan sedan användas. Det enklaste sättet att göra en sådan bildbox är genom att placera ett stort lock över chipet och lägga till en våt vävnad, det behöver inte stängas helt. Se till att höjdskillnaden mellan pump och chip inte är för stor och vid behov ändra höjder långsamt för att förhindra bildandet av luftbubblor på grund av gravitationen. - Låt alla pumpar flöda med en flödeshastighet på 20 μL/h i 20 minuter, efter att installationen har placerats på sin slutliga plats. Eftersom kammaren och pumpen troligen har rört sig i höjd är detta nödvändigt för att återställa rätt tryck i slangen.
- Stäng av läkemedelspumpen, låt endast medelpumpen köras vid 60 μL/h tills experimentet/realtidsavbildningen påbörjas.
- Början på experimentet.
- Starta det planerade pumpprogrammet för experimentet. För att entrain Notch signalering, använd ett pumpningsprogram på 100 min medium och 30 min drogpulser, som upprepas fram till slutet av experimentet, vanligtvis för 24 h.
OBS: Alla programmerbara mikrofluidiska pumpar kan användas. I enklaste format kan pumparna programmeras och startas manuellt. Alternativt kan pumparna styras av en datorprogramvara. - Om avbildning i realtid utförs, börja avbildning efter en period på minst 30 min. Detta gör det möjligt för chipets temperatur att anpassa sig till temperaturen i inkubatorn och förhindra en för stark drift under avbildning. Autofokus är fortfarande fördelaktigt.
- Utför standardkonfokal avbildning via chipets glasrutschbana med hjälp av ett inverterat mikroskop. Använd ett bildintervall på 10 min för att detektera signalsvängningar med en period på 130 min.
- För kortare perioder, förkorta intervallet för tillräcklig provtagning. Inkludera ett lågupplöst bildspår för detektion av Cascade Blue för att visualisera närvaron av läkemedel på chipet.
- För excitation av en Venus reporter, använd en 515 nm laser eller en 2-fotonlaser vid en våglängd på 960 nm.
- Skaffa en z-stack med 6-8 plan med ett avstånd på 8 μm genom ett 20x planmål (upplösning 512 x 512 pixlar, 1,38 μm/pixel). Använd ett motoriserat steg för att avbilda flera exempel i ett experiment.
- Excite Cascade Blue med en 405 nm laser och skaffa ett enda z-plan var 10:e minut (upplösning 32 x 32 pixel, 22,14 μm/pixel).
OBS: Mer information om bildbehandling och bildanalys finns i representativa resultat och finns i referens10.
- Starta det planerade pumpprogrammet för experimentet. För att entrain Notch signalering, använd ett pumpningsprogram på 100 min medium och 30 min drogpulser, som upprepas fram till slutet av experimentet, vanligtvis för 24 h.
Representative Results
Med detta protokoll presenteras en metod för extern entrainment av signalerande svängningar av musen segmentering klocka med hjälp av mikrofluidics. Genom att applicera pulser av Notch-signalhämmare synkroniseras signalerande svängningar i oberoende embryokulturer med varandra10. En förutsättning för tillämpningen av detta system för att studera funktionaliteten hos segmenteringsklockan är att signaldynamik och segmentering fortfarande finns på chip. Det visades tidigare att både Wnt och Notch signalering dynamik upprätthålls trots konstant medium flöde och fysiska gränsbildning kvarstår i perifera 2D kulturer, representerar främre PSM10.
För att bekräfta entrainment av signalerande svängningar till externa läkemedelspulser utförs realtidsavbildning av till exempel Notch-signalreportern LuVeLu5, som uttrycker det gula fluorescerande proteinet Venus, under det mikrofluidiska experimentet. Eftersom orientering av 2D-kulturerna på chip är svårt att kontrollera, analyseras signalerande svängningar i främre vävnad. Periferin i 2D-kulturen kan reproduceras. Orienteringen av vävnadssektionerna på chipet kan inte kontrolleras efter behag och hela insidan av chipet blir belagd med Fibronectin. Därför händer det ibland att kulturer fäster vid chipets sidor eller tak. Om proverna rör sig ut ur synfältet (i x-, y- och z-riktning) eller om de fäster med svansens bakre ände vänd nedåt, är dessa prover i allmänhet uteslutna.
För ytterligare analys kombineras flera av sådana entrainment experiment. Oberoende experiment kan anpassas till varandra med hjälp av tidpunkten för läkemedelspulserna som visualiseras av färgämnet Cascade Blue vid cirka 400 nm. För att analysera och visualisera synkronisering kan kvantifierade svängningar detrenderas (figur 2B,D) och sedan antingen visas som medelvärde och standardavvikelse eller faser av svängningarna kan beräknas. Detta gör det möjligt att analysera fasförhållandet mellan svängningar av oberoende bakre embryokulturer till varandra och till de yttre läkemedelspulserna (figur 2C,E). Det python-baserade programmet pyBOAT33 är ett enkelt och användarvänligt verktyg för att bestämma period, fas och amplitud för sådana signaleringssvängningar. För att bekräfta entrainment kan man till exempel bestämma perioden för de endogena signal svängningarna. Vid applicering av pulser med en period på 130 min visar Notch-signaleringssvängningar också en period på 130 min (figur 2F)10. Dessutom, med Hjälp av Cascade Blue pulser, kan oberoende experiment med olika signalreportrar anpassas till varandra. På så sätt kan fasförhållandet mellan svängningar av flera signalreportrar indirekt bestämmas10.
Således tillåter det presenterade mikrofluidiska systemet kontroll av signalerande svängningar i ex vivo-kulturer i det utvecklande musembryon. I kombination med avbildning av markörer för segmentbildning och differentiering kan detta system nu tillämpas för att dissekera hur signalvägar i segmenteringsklockan interagerar och hur de kontrollerar somitbildning.
Bild 1: Schematisk översikt över mikrofluidikprotokollet.A) Spånformar kan utformas med hjälp av CAD-programvara (Computer-Aided-Design). En chip design för att entrain signalering svängningar i ex vivo modeller av mus somitogenesis tillhandahålls. Formar kan till exempel genereras genom 3D-utskrift eller beställas. Mikrofluidiska chips produceras genom gjutning av PDMS. Ett härdat PDMS-chip skärs ut och kovalent binds till en glasrutschbana med hjälp av en plasmaugn. Glasytan i chipet är belagd med fibronectin så att dissekerad vävnad kan fästas. Embryonal vävnad laddas på chipet via lastning av inlopp, som därefter stängs. Pumpar med olika medieförhållanden är fästa vid chipets inlopp och ett flödesprogram initieras. Vävnad kan avbildas med hjälp av ett konfokalt mikroskop under experimentet. (Kymographs anpassade från Sonnen m.fl., 201810. Omtryckt och modifierad från cell enligt Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Schematisk ritning av en mögeldesign för jordschipskultur av bakre musembryonvävnad. Höjden på de mikrofluidiska kanalerna är 500 μm, tillräcklig för kulturen av bakre embryonala mussvansar. Filen för att skriva ut denna form finns i kompletterande fil 1, och ett alternativ ges i kompletterande fil 2. (C) Brightfield-bild av en E10.5-sektionerad mussvans omgiven av PDMS-pelare på chip. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa resultat från ett mikrofluidikexperiment. Pulser av signaleringsvägsmodulator tillämpas på ex vivo-kulturer av musembryon och signalerande svängningar kan visualiseras genom realtidsavbildning av dynamiska signalreportrar (till exempel Notch-signalreportern LuVeLu5 och Wnt-signalreportern Axin2T2A10). Streckade linjer anger den region som används för analyser över tid. (B-F) LuVeLu reporter svängningar är inträngda av periodiska pulser av Notch signalhämmare DAPT. (B,D) Kvantifieringar av Notch signalerar svängningar i främre PSM vid entrainment med DAPT eller en DMSO-kontroll. (C,E) Fasfasförhållandet mellan fasen av Notch-signaleringssvängningar och tidpunkten för externa DAPT/DMSO-pulser. Vid entrainment upprättas ett stabilt fasförhållande. F) Kvantifiering av medelvärdesperioden och SEM av reportersvängningar som jämför prover som är inbildade med DMSO- och DAPT-pulser. (Figur anpassad från Sonnenet al., 201810. Omtryckt och modifierat från cell enligt Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Problem | Föreslagen lösning |
| PDMS binder inte till glaset. | - Se till att både PDMS och glas är rena. |
| - Se till att det finns tillräckligt med PDMS runt kammaren för bindning. | |
| - Optimera inställningarna för plasmaugnen. | |
| Det finns luftbubblor på mitt chip. | - Kontrollera om pumpen var påslagen. |
| - Degas chippet innan du lastar vävnaden på chipet. | |
| - Degasa mediet innan experimentet börjar. | |
| - Se till att luftfuktigheten i inkubationskammaren är tillräckligt hög. | |
| Vävnaden dör i början av experimentet. | - Tillsätt HEPES till mediet vid lastning och montering av chipet. |
| - Spola inte in och ut vävnaden för ofta under lastning. | |
| - Kontrollera att flödet inte är för högt. | |
| Vävnaden dör under avbildning. | - Se till att det inte finns någon fototoxicitet från avbildningen |
| - Se till att det inte finns någon kontaminering. | |
| - Flödet bör inte vara för högt. | |
| Fokus ändras under avbildning. | - Använd autofokus under avbildningen för att justera för avbildningsbildens drift. |
| - Låt spånet balansera till temperaturen i mikroskopet i minst 30 minuter. | |
| Uttag/inlopp lossnar. | - Tryck ner alla slangar helt till botten. |
| Glaset på chipet går sönder. | - Var försiktigare, glaset är ömtåligt. |
| - Det tunna glaset krävs endast för avbildning. Om avbildning inte utförs kan en normal tjockare glasrutschbana användas. | |
| - Om pausen är utanför chippet kanske det inte är några problem. Om glastätningen till chipet bryts kommer vätska att läcka ut och luft kommer in. | |
| Det finns en förorening på mitt chip. | - Tillsätt antibiotika till odlingsmediet. |
| - Sterilisera all utrustning och slang. | |
| - Arbeta snabbt och rent. |
Tabell 1: Felsökning
Kompletterande akt 1: STL-fil för utskrift av en form med en 3D-skrivare. Denna form används för att generera ett mikrofluidiskt chip för on-chip-kulturen av bakre embryonal vävnad (design som visas i figur 1). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: STL fil för att skriva ut en mögel med en 3D-skrivare för att generera ett mikrofluidiskt chip för on-chip-kulturen av bakre embryonal vävnad. I motsats till kompletterande fil 1 och den design som visas i figur 1 innehåller denna design bubbelfällor vid alla inlopp för att förhindra att små mängder luft kommer in i huvudmikrofluidkammaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Designfil för generering av en hållare för att placera chipet i mikroskopet. Denna hållare har måtten på en 96-brunnsplatta och bör passa in i standardhållare i de flesta mikroskop. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Hur signaldynamiken styr multicellulära system har länge varit en fråga inom området. Funktionell undersökning utgör en viktig utmaning, eftersom dessa dynamiker måste moduleras subtilt för att tillåta detta11. Sådan temporal kontroll över vägperturbations kan i princip uppnås med optogenetik, vilket också möjliggör en hög rumslig kontroll34. Optogenetik kräver dock att sofistikerade genetiska verktyg inrättas för analys av varje signalväg i fråga. Det nuvarande protokollet som beskrivs här ger ett mycket mångsidigt verktyg för att störa alla signalvägar. Mikrofluidikexperimentet gör det möjligt att tillämpa tidskontrollerade läkemedelspulser för att funktionellt undersöka dynamiken i signalvägar i vävnadskulturer. Här ligger fokus på studier av somitogenes i ex vivo-kulturer , men protokollet kan anpassas för att passa alla andra modellsystem.
Vissa steg i protokollet är avgörande för att utföra ett framgångsrikt mikrofluidikexperiment (sammanfattat i tabell 1). Viktiga punkter diskuteras på följande sätt. På grund av medelflödet under experimentets gång upplever vävnadskulturen skjuvningsstress. Att exponera modellsystemet för kontinuerligt flöde kan orsaka cellstress och i extrema fall celldöd på grund av skjuvningseffekt. För ex vivo vävnad kulturer av mus tailbuds och den nuvarande chip design, en flödeshastighet på 60 μL/h (högst 100 μL/h) befanns fungera bra med minimal klippning effekt. När flera pumpar slås på samtidigt för samma chip måste flödeshastigheten för enskilda pumpar justeras i enlighet därmed för att inte orsaka en ökning av det totala flödet. När det aktuella protokollet är anpassat till andra modellsystem och chipkonstruktioner bör flödeshastigheten optimeras. Alternativt är det möjligt att inte spola medium kontinuerligt, men regelbundet byta medium på chip35. En sådan inställning kan också tillämpas för att styra signaleringssvängningar i mus somitogenesis (opublicerad, data visas inte). Dessutom kan en inställning också föreställas, där vävnadskulturer inte utsätts för direkt vätskeflöde, men droger når vävnaden genom diffusion från en närliggande kanal. Sådana system har framgångsrikt använts för att tillämpa gradienter av tillväxtfaktorer på in vitro-modeller av ESC-differentiering14,36.
En viktig fråga om mikrofluidiska experiment är förekomsten av luftbubblor på chip under experimentet. Luftbubblor i chipet eller slangen kan störa det enhetliga vätskeflödet på chipet och kan leda till att embryokulturen avlägsnas från dess plats. För att förhindra närvaron av luftbubblor är olika steg i protokollet oumbärliga. För det första måste odlingsmediet inom sprutor och själva mikrofluidchipet avgasas med hjälp av en desiccator (steg 3.1.3). För det andra måste man vid lastning av prover i lastinloppen vara försiktig så att man inte rör luft i spånet tillsammans med provet (steg 3.2.3). För det tredje måste alla luftbubblor pumpas ut när slangen fylls med medium innan chipet fästs (steg 3.3.2). Annars kommer dessa bubblor att skjutas in i huvudchipet under experimentet. Slutligen, under experimentet, är mediet ekvilibrerat inom bildkammaren eller inkubatorn på grund av den halvgenomsläppliga slangen. Slangens permeabilitet möjliggör också avdunstning av mediet, så se till att fuktigheten regleras under experimentet för att förhindra bildandet av nya bubblor i slangen.
I allmänhet är mikrofluidik ett mycket mångsidigt verktyg som kan anpassas till forskarens specifika fråga. Den nuvarande designmetoden möjliggör avbildning av upp till 12 ex vivo-kulturer parallellt per chip. Detta antal begränsas huvudsakligen av antalet embryon per experiment och den tid det tar att avbilda varje embryokultur med tillräcklig upplösning. Om flera villkor behöver jämföras i ett enda experiment kan flera spånor monteras på en enda glasrutschbana. En chipdesign tillhandahålls, som är idealisk för avbildning av flera vävnadsexplanter parallellt, men personliga mönster kan övervinna begränsningar i provnummer för att möjliggöra analys med hög genomströmning och öka kombinationen av fler förhållanden inom ett enda experiment16,17. Mikrofluidik är begränsad till modeller som kan odlas på ett chip och on-chip-kulturen måste optimeras för varje modellsystem individuellt27,37,38.
Under de senaste 5-10 åren har mikrofluidik tillämpats för att ta itu med olika biologiska frågor på grund av dess potential för hög genomströmningsmetoder och subtila modulering av signaldynamik och gradienter. Numera har mikrofluidik blivit ett lätt tillämpbart, billigt och mångsidigt verktyg som laboratorier enkelt kan etablera. Här är det nuvarande protokollet optimerat för en specifik applikation, nämligen att studera signaldynamik som styr somitogenesis. Det är enkelt att anpassa detta protokoll och design för att passa enskilda forskningsfrågor inom vävnadsbiologi.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Yang Li och Jos Malda från UMC Utrecht för hjälp med 3D-utskrift av formar, Karen van den Anker från Sonnen-gruppen för mycket användbar feedback på protokollet och Tjeerd Faase från den mekaniska verkstaden vid Hubrecht Institute för innehavaren för mikrofluidiska chips i mikroskopet. Vi vill tacka hela Sonnengruppen för kritisk läsning av manuskriptet och granskarna för deras konstruktiva feedback. Detta arbete fick finansiering från Europeiska forskningsrådet inom ramen för ett avtal om startbidrag från EFR nr 850554 till K.F.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
References
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding - From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
