Summary
En protokol til dyrkning og manipulation af museembryonsk væv på en mikrofluidisk chip er tilvejebragt. Ved at anvende impulser af vejmodulatorer kan dette system bruges til eksternt at styre signalsvingninger til funktionel undersøgelse af museositogenese.
Abstract
Periodisk segmentering af den præsomitiske mesoderm af et udviklende museembryo styres af et netværk af signalveje. Signalsvingninger og gradienter menes at kontrollere henholdsvis timing og afstand mellem segmentdannelse. Mens de involverede signalveje er blevet undersøgt grundigt i løbet af de sidste årtier, har der manglet direkte beviser for funktionen af signalsvingninger til styring af somitogenese. For at muliggøre en funktionel undersøgelse af signaldynamikken er mikrofluidik et tidligere etableret værktøj til subtil modulering af disse dynamikker. Med denne mikrofluidikbaserede indsugningsmetode synkroniseres endogene signalsvingninger af impulser af vejmodulatorer. Dette muliggør modulering af f.eks. svingningsperioden eller faseforholdet mellem to oscillerende veje. Desuden kan rumlige gradienter af vejmodulatorer etableres langs vævet for at studere, hvordan specifikke ændringer i signalgradienterne påvirker somitogenese.
Den nuværende protokol er beregnet til at hjælpe med at etablere mikrofluidiske tilgange for de første gangs brugere af mikrofluidik. De grundlæggende principper og udstyr, der er nødvendige for at oprette et mikrofluidisk system, beskrives, og der leveres et chipdesign, hvormed en form til chipgenerering bekvemt kan fremstilles ved hjælp af en 3D-printer. Endelig diskuteres, hvordan man dyrker primært musevæv på en mikrofluidisk chip, og hvordan man indkapsler signalsvingninger til eksterne impulser af vejmodulatorer.
Dette mikrofluidiske system kan også tilpasses til at huse andre in vivo- og in vitro-modelsystemer såsom gastruloider og organoider til funktionel undersøgelse af signaldynamik og morfogengradienter i andre sammenhænge.
Introduction
Udviklingen styres af intercellulær kommunikation via signalveje. Der er kun et begrænset antal signalveje, der orkestrerer den komplekse dannelse af væv og korrekt celledifferentiering i rum og tid. For at regulere denne mangfoldighed af processer kan information kodes i dynamikken i en signalvej, ændringen af en vej over tid, såsom frekvensen eller varigheden af et signal1,2.
Under somitogenese segmenteres somitisk væv periodisk fra den præsomitiske mesoderm (PSM)3. PSM er rumligt organiseret efter gradienter af Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) og Retinsyresignalering. I forreste PSM på bestemmelsesfronten, hvor Wnt- og FGF-signaler er lave, grundes cellerne til differentiering i somitter. Differentiering opstår, når en bølge af transkriptionel aktivering når denne bestemmelsesfront. Inden for PSM, Wnt, FGF og Notch signalering svinger. Naboceller svinger lidt ud af fase, hvilket resulterer i bølger af oscillerende transkriptionel aktivering nedstrøms for Wnt-, FGF- og Notch-stierne, der rejser fra bageste til forreste PSM. I museembryoner når en transkriptionsbølge bestemmelsesfronten ca. hver 2. time og initierer somitdannelse. At studere somitogenese ved at forstyrre eller aktivere signalveje kan illustrere vigtigheden af disse veje4,5,6,7,8,9. For at kunne undersøge funktionen af signaldynamik i styringen af cellulær adfærd er det imidlertid vigtigt at subtilt modulere signalveje i stedet for permanent at aktivere eller hæmme dem.
For tidsmæssigt at modulere signalvejsaktivitet inden for det segmenterende museembryo har Sonnen et al. udviklet et mikrofluidisk system10. Dette system muliggør en stram kontrol af væskestrømme inden for mikrokanaler af en chip, der indeholder den biologiske prøve11. For at studere vigtigheden af signaldynamik for korrekt segmentering af PSM bruges denne mikrofluidikopsætning til at modulere signaldynamikken i musens segmenteringsur ex vivo. Ved sekventielt pulserende pathway aktivatorer eller hæmmere ind i kulturkammeret opnås ekstern kontrol af dynamikken i Wnt, FGF og Notch signalering10. For eksempel er det muligt at ændre perioden for individuelle veje og faseforholdet mellem flere oscillerende signalveje. Ved hjælp af samtidig realtidsbilleddannelse af dynamiske signalindmeldere kan effekten af indlejring på selve stierne, på differentiering og somitisk dannelse analyseres. Ved hjælp af dette niveau af kontrol over signaldynamikken blev betydningen af faseforholdet mellem Wnt- og Notch-signalveje under somitogenese fremhævet10.
Personlige chipdesign giver mulighed for en overflod af muligheder for spatiotemporale forstyrrelser i det lokale miljø, f.eks. Stabil gradientdannelse12,13,14,15, pulserende aktivering/hæmning10,16,17,18 eller lokaliserede forstyrrelser19,20 . Mikrofluidik kan også muliggøre en mere reproducerbar udlæsning og højere gennemstrømning på grund af automatisering af eksperimentel håndtering21,22,23. Den nuværende protokol er beregnet til at bringe mikrofluidik og indlejring af endogene signalsvingninger i væv til hvert standard biovidenskabeligt laboratorium. Selv i mangel af sofistikeret udstyr til chipgenerering, såsom renrum og udstyr til blød litografi, kan mikrofluidiske chips fremstilles og bruges til at løse biologiske spørgsmål. Forme kan designes ved hjælp af frit tilgængelig COMPUTERSTØTTET DESIGN (CAD) SOFTWARE. En form til generering af mikrofluidiske chips, der normalt består af polydimethylsiloxan (PDMS), kan udskrives med en 3D-printer eller bestilles fra trykkerier. På denne måde kan mikrofluidiske chips produceres inden for en dag uden krav om dyrt udstyr24. Her er der tilvejebragt et chipdesign, hvormed en form til indlejring af musesegmenteringsuret i todimensionelle (2D) ex vivo-kulturer25 kan udskrives med en 3D-printer.
On-chip-kulturer og præcise forstyrrelser, muliggjort af mikrofluidik, har et enestående potentiale i at optrævle de molekylære mekanismer for, hvordan signalveje styrer flercellet adfærd. Signaldynamik og morfogengradienter er nødvendige for mange processer under udvikling. Tidligere havde laboratorier dyrket celler, væv og hele organismer i mikrofluidiske chips, og protokoller til spatiotemporal forstyrrelse af primært 2D-cellekultur leveres andre steder12,26,27,28,29. Anvendelse af mikrofluidik til at modulere lokale miljøer i multicellulære systemer åbner nye perspektiver for høj gennemstrømning og præcise spatiotemporale forstyrrelser. Området for mikrofluidik har nu nået et punkt, hvor det er blevet et ikke-specialiseret, billigt og let anvendeligt værktøj for udviklingsbiologer.
Her tilvejebringes en protokol til indlejring af musesegmenteringsuret til impulser af en Notch-signalhæmmer. Et sådant eksperiment består af følgende trin: (1) generering af mikrofluidisk chip, (2) fremstilling af slanger og belægning af chippen og (3) selve det mikrofluidiske eksperiment (figur 1A). Forskning, der involverer hvirveldyrs modelsystemer, kræver forudgående etisk godkendelse fra det ansvarlige udvalg.
Protocol
Den forskning, der præsenteres her, er godkendt af EMBL's etiske komité10 og den hollandske komité for dyreforskning (dierenexperimentencommissie, DEC) og følger Hubrechts retningslinjer for dyrepleje.
Brug handsker, mens du arbejder med flydende PDMS. Dæk overflader og udstyr. Fjern eventuelt spild med det samme, da rengøring bliver vanskelig, når det er hærdet.
1. Generering af chippen
BEMÆRK: Mikrofluidiske chips genereres ved at støbe PDMS (Polydimethylsiloxan) i en form. Forme kan designes ved hjælp af CAD-software (f.eks. uFlow eller 3DμF30). Et lager af gratis designs leveres af MIT (Metafluidics.org). Forme udskrives enten med en 3D-printer eller kan genereres ved blød litografi ved hjælp af en fotomaske, der indeholder det ønskede design (for yderligere information se f.eks. Qin et al., 201031). Her leveres et design til en form, der kan udskrives med en 3D-printer til on-chip-kulturen af museembryovæv (figur 1B, C, supplerende filer 1 og 2). For at tillade udskrivning med 3D-printere med lavere opløsning er designet blevet ændret i forhold til det tidligere offentliggjorte one10. Der er tilvejebragt en form uden luftboblefælder og en med luftboblefælder (henholdsvis supplerende filer 1 og 2 ). Da proceduren for udskrivning afhænger af den tilgængelige printer, vil detaljerne for udskrivning ikke blive beskrevet. Man skal dog sørge for, at al ikke-polymeriseret harpiks fjernes helt. Det er ofte nødvendigt at udføre ekstra vask med opløsningsmidler for at fjerne upolymeriseret harpiks fra de små huller i < 200 μm i det mikrofluidiske kammer. Disse huller vil danne PDMS-søjler for at fange det embryonale væv i chippen under eksperimentet. PDMS bruges generelt til mikrofluidik, da det er billigt, biokompatibelt og gennemsigtigt og har lav autofluorescens. Efter hærdning skæres PDMS-chippen ud af formen og limes på et glasglas. Plasmabehandling af både glasset og PDMS-chippen aktiverer overfladerne og tillader dannelse af kovalente bindinger, når de bringes i kontakt.
- Forbered den krævede mængde PDMS ved at blande monomeren med katalysatoren i et 9: 1-forhold (w: w) for at inducere polymerisation. Brug engangsværktøjer til at blande, såsom plastikkopper og gafler. Sørg for, at blandingen opnås korrekt.
- Anbring PDMS-blandingen i en tørressikkator, og påfør vakuum i ca. 30 minutter for at fjerne luft fra PDMS-blandingen. På grund af vakuummet i tørremaskinen fjernes luft fra PDMS-blandingen.
BEMÆRK: Dæk indersiden af tørressikkatoren med væv, hvis PDMS flyder over. - Hæld PDMS-blandingen i spånformen (et PDMS-lag på ca. 3-5 mm er nok).
- Anbring formen fyldt med PDMS tilbage i tørremaskinen, og påfør vakuum for at fjerne eventuelle resterende bobler. Sørg for, at luft fjernes fra alle mindre strukturer i formen.
- Hærd formen ved at placere den i en ovn på 65 °C (eller lavere afhængigt af formmaterialet) natten over. Skær chippen ud af formen ved hjælp af en skalpel. Skær den hærdede PDMS ud af formen med tilstrækkelig plads (1-2 cm) omkring designet til at muliggøre senere limning. Sørg for at skære PDMS helt for at forhindre brud på chippen, når du tager den ud. Løft PDMS-chippen forsigtigt af, først med den stumpe ende af skalpellen og om muligt med hænderne.
- Stans indløbs- og udløbshuller, startende fra indersiden af det mikrofluidiske kammer ved hjælp af en 1 mm biopsistans.
- Rengør PDMS-chippen kortvarigt med trykluft, og sæt tape på begge sider for at fjerne eventuelle fastlåste stykker PDMS og støv og holde den ren indtil videre brug.
BEMÆRK: Chippen kan opbevares sådan indtil videre brug. - Rengør glasrutsjebanen med trykluft. Pas på, at det ikke går i stykker. Fjern tape fra PDMS-chippen.
- Lim chippen til glasglideren ved hjælp af en plasmaovn. Følgende instruktioner er optimeret til luftplasma.
BEMÆRK: Se manualen til laboratoriets plasmaovn og optimer proceduren for det specifikke eksperiment.- Anbring chippen og glasslidningen ind i plasmaovnen med siderne, der skal limes, med ansigtet nedad.
- Placer låget på plasmaovnen, og hold det på plads, mens du påfører vakuum, og vent, indtil vakuummet er etableret.
- Tænd for gassen ved at trykke på gasknappen, og vent i ca. 1 minut (trykket skal være på ca. 0,37 mbar).
- Generer plasma ved at trykke på Generator (Effekt: 9.0, Tid: 1 min).
- Når du er færdig, skal du slukke for pumpen og gassen; ventilere og åbne døren.
- Lim chippen til glasset ved at placere de aktiverede overflader på hinanden og påføre tryk jævnt. Pas på, at glasset ikke går i stykker.
BEMÆRK: En vandtest kan udføres for at bekræfte, at plasmabehandling har fungeret. Placer en dråbe vand på glasoverfladen. Hvis plasmabehandling har virket, skal vandet straks spredes ud i stedet for at danne en dråbe.
- Anbring den bundne chip i en ovn ved 65 °C i 5 minutter.
- Forsegl den udsatte side af chippen med tape for at forhindre støv i at komme ind i indløbene.
BEMÆRK: Chippen kan opbevares indtil brug. Åbninger skal lukkes med tape indtil da.
2. Forberedelse af mikrofluidik eksperiment
BEMÆRK: Følgende forberedende trin er nødvendige for at udføre mikrofluidikeksperimentet: For det første, når der udføres mikrofluidikeksperimentet, skabes der en væskestrøm fra indløbene til udløbene. Eventuelle huller i chippen fungerer som udløb på grund af trykopbygningen fra indløbene. Derfor skal alle huller, der ikke bruges, lukkes; for eksempel huller, der bruges til at indlæse væv på chippen. Hvis disse ikke er lukket, kan vævet strømme ud med væsken. For at lukke disse huller anvendes PDMS-fyldt slange. Den PDMS-fyldte slange kan opbevares på ubestemt tid og behøver derfor ikke at blive forberedt til hvert mikrofluidikeksperiment separat, men kan fremstilles i større partier. For det andet, inden starten af det mikrofluidiske eksperiment, fremstilles slanger, PDMS-fyldte slanger og den chip, der kræves til eksperimentet, og UV-steriliseres. Endelig skal chippen overtrækkes med fibronectin, så det embryonale væv kan sætte sig fast på glasset25.
- Fremstilling af PDMS-fyldt slange.
- Tag ±1 m slange. Flere slanger kan fyldes med PDMS ved at tage flere stykker slanger.
- Forbered den krævede mængde PDMS ved at blande monomeren med katalysatoren i et 9: 1-forhold (w: w) for at inducere polymerisation.
BEMÆRK: Brug engangsværktøj til at blande, såsom plastikkopper og gafler. Bland ordentligt. - Anbring PDMS-blandingen i en tørressikkator, og påfør vakuum i ca. 30 minutter for at fjerne luft fra PDMS-blandingen.
BEMÆRK: Dæk indersiden af tørressikkatoren med væv, hvis PDMS flyder over. - Fyld en 3 ml sprøjte med PDMS. Fyld forsigtigt for at forhindre dannelse af luftbobler i blandingen.
- Brug tang til at indsætte spidsen af en 22 G nål i slangen.
BEMÆRK: Pas på ikke at punktere slangen eller fingrene med nålen. - Fastgør slangen til den PDMS-fyldte sprøjte via nålen. Brug sprøjtepumpen til at fylde slangen med en strømningshastighed på ca. 500 μL/t. Pas på ikke at anvende for højt tryk for at forhindre brud på pumpen.
- Når slangen er helt fyldt med PDMS, skal du placere den i en 15 cm skål og hærde ved stuetemperatur (mindst natten over).
- Forbered slangen og chippen til eksperimentet.
BEMÆRK: Følgende slange er påkrævet til forsøget: For det første ca. 50 cm slange pr. udløb og for det andet ca. 2-3 m pr. Indløb (den nøjagtige størrelse afhænger af den rumlige organisering af pumperne, inkubatoren eller mikroskopet, der anvendes senere). Indløbsslangen skal være lang, for at dyrkningsmediet kan udligne med CO2 til embryokultur under forsøget.- Skær slangen i en 45 ° vinkel, så der skabes spidse ender; dette vil gøre det lettere at indsætte slangen i hullerne i chippen. Fastgør en nål til hver af indløbsslangerne. Se trin 2.1.5.
- Skær PDMS-fyldt slange i ±1 cm stik. Skær i en 45 ° vinkel, så der skabes spidse ender; dette vil gøre det lettere at indsætte slangen i hullerne i chippen. Der er brug for nok stik til at fylde hvert hul, der ikke er fastgjort til nogen slange.
- Fjern klæbebåndet fra chippen.
- Placer alle slangerne med nåle fastgjort, chippen og propperne i et fad og steriliser ved at udsætte for UV-lys i ±15 min. Enhver cellekulturhætte med mulighed for UV-sterilisering kan anvendes.
- Belægning af chip med fibronectin.
BEMÆRK: Til dyrkning af 2D ex vivo-kulturer af bageste PSM skal du belægge chippen med fibronectin.- Anbring chippen i et bægerglas, der indeholder PBS + 1 % penicillin/Streptomycin ved stuetemperatur. Sørg for, at chippen er helt dækket af PBS. Skyl chippen med PBS for at fjerne luft med en P200-pipette.
BEMÆRK: Al yderligere håndtering af chippen vil ske i dette bægerglas indtil eksperimentets start for at forhindre indførning af luft i chippen. Pas på ikke at bryde chippens glasglider. - Forbered 2 ml 1:20 fibronectin i PBS og fyld i et bægerglas.
- Læg en 3 ml sprøjte til hvert kammer i chippen. Indsæt en 22 G-nål i udløbsslangen med tang. Fastgør nålen til sprøjten indeholdende fibronectin.
- Tilslut sprøjten til sprøjtepumpen. Skyl slangen, indtil der ikke er luft tilbage i slangen.
- Fastgør udløbsslangen til chippens udløb. Sørg for at skubbe slangen helt til bunden. Indstil en lav strømningshastighed for at belægge chippen. Alle andre åbninger kan forblive åbne. Lad sprøjtepumpen køre i mindst 2 timer, kan også køre natten over.
- Stop pumpen. Skær slangen af lige efter nålen. Den resterende slange vil fungere som udløb under eksperimentet senere.
- Anbring chippen i et bægerglas, der indeholder PBS + 1 % penicillin/Streptomycin ved stuetemperatur. Sørg for, at chippen er helt dækket af PBS. Skyl chippen med PBS for at fjerne luft med en P200-pipette.
3. Mikrofluidik eksperiment
BEMÆRK: Her præsenteres en protokol til indlejring af musesegmenteringsuret i 2D ex vivo-kulturer ved at anvende impulser af Notch-signalhæmmeren DAPT. Anvendelse af impulser med en periode på 130 min, tæt på den naturlige periode af musesegmenteringsuret (137 min25), muliggør effektiv indlejring. Impulser på 100 min medium og 30 min 2 μM DAPT påføres (figur 2A). Tilstedeværelsen af lægemiddel i chippen overvåges ved hjælp af et fluorescerende farvestof. Excitations- og emissionsspektrene for dette farvestof og den fluorescerende signalindberetter skal være forskellige nok til at forhindre gennemblødning under fluorescensbilleddannelse i realtid. Når gule fluorescerende proteiner bruges som signalreporter, såsom Notch-signalreporteren LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), kan farvestoffet, Cascade Blue, påføres. For at identificere andre mulige kombinationer af fluorescerende farvestof og reporter kan frit tilgængelige spektrefremviser anvendes. Effekten af indlejring kan detekteres ved billeddannelse i realtid af dynamiske signalindlysningsreportere5,10,32. Hver chip har to inkubationskamre. Dette gør det muligt direkte sammenligning af lægemiddelimpulser (DAPT) at kontrollere impulser (DMSO).
- Lav medium og afgas.
- På forsøgsdagen skal du forberede 50 ml dyrkningsmedium (DMEM-F12 suppleret med 0,5 mM glucose, 2 mM glutamin og 1% BSA for yderligere information om musehalebudkultur se25).
- Forbered sprøjter fyldt med mediet til eksperimentet. Forbered kulturmedium i bægerglas: For at indkapsle Notch-signalsvingninger skal du forberede 6 ml medium med 1,2 μL DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 ml kulturmedium med 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; to rør med 6 ml medium hver. Brug mindst 6 ml medium pr. Sprøjte. Læg sprøjter med mediet. Sørg for at mærke sprøjterne, der indeholder lægemiddel og DMSO.
- Afgas chippen i PBS og sprøjterne indeholdende medium i en ekssikkator. Placer sprøjterne i et bægerglas med spidsen vendt op, så luften kan slippe ud øverst. Det kan forekomme, at chippen flyder og stadig er fyldt med bobler. Disse vil blive fjernet efterfølgende.
- Prøv at skylle ud/suge de fleste luftbobler op fra chippen ved hjælp af en P200-pipette. Hvis der er noget luft tilbage, fjernes dette under det følgende eksperiment.
- Installer sprøjter i pumperne, og fastgør indløbsslangen til sprøjterne. For at indkapsle Notch-signalering skal du bruge to sprøjtepumper, en der bærer de mellemstore sprøjter, en der bærer lægemidlet / DMSO-sprøjterne. Lad dette køre med en højere strømningshastighed (0,5 ml/t) indtil eksperimentets start for at fjerne luftbobler fra slangen. Vær forsigtig med at indstille sprøjtedetaljerne (diameteren) korrekt i pumpen.
- Indlæsning af væv på chippen.
- Dissekere musens embryovæv. Disseker den bageste spids af halen (tailbud). Anbring det dissekerede væv i dyrkningsmedium + 25 μM HEPES.
- Skyl chippen med kulturmedium + 25 μM HEPES ved hjælp af en P200 for at fjerne PBS.
- Læg vævet i chippen ved hjælp af en P200-pipette (figur 1C). Sørg for ikke at indføre luftbobler i chippen.
BEMÆRK: Effektiv indlæsning kræver lidt øvelse. Hvis vævet ikke er orienteret ordentligt, kan det være muligt at dreje det ved forsigtigt at suge ud og skylle ind igen. Dette resulterer dog ofte i hurtig celledød. - Efter hvert vævsbelastningstrin lukkes det tilsvarende vævsbelastningsindløb ved hjælp af et stykke PDMS-fyldt slange. Sørg for, at stikkene er tilstrækkeligt skubbet ned til bunden af chippen ved hjælp af stump pincet.
- Når alle prøver er indlæst, skal du lukke eventuelle ubrugte indløb/udløb med stykker PDMS-fyldt slange ved hjælp af stump tang.
- Samling af mikrofluidisk opsætning.
- Sænk strømningshastigheden for de mikrofluidiske pumper. 60-100 μL/h fungerer godt for musefobryo tailbuds. Ved højere strømningshastigheder blev celledød observeret - formodentlig på grund af for høj celleforskydning. Den kumulative strømningshastighed for flere pumper bør ikke overstige disse 60-100 μL/h pr. mikrofluidisk kammer på et givet tidspunkt.
- Fastgør slangen til den mikrofluidiske chip. Gør dette uden at få luftbobler inde i chippen (dette kan opnås ved at sikre, at der er en dråbe medium til stede i slutningen af slangen). Udløb er stadig til stede fra fibronectinbelægningen (se 2.3).
- Når alle slanger er fastgjort til chippen, skal du tage den ud af bægerglasset, tørre den ordentligt, placere den i et fad og sætte den sammen med ca. 1,5 m indløbsrør i en inkubator (37 °C, 20 % O2, 5 % CO2) til dyrkning natten over. Slangen er gasgennemtrængelig; dette vil muliggøre ligevægt mellem O2 og CO2 i mediet. Alternativt placeres chippen og ca. 1,5 m indløbsrør direkte i mikroskopet til samtidig fluorescensbilleddannelse i realtid. En holder til chippen, der passer ind i standard 96-brøndpladeholdere, findes i supplerende fil 3.
BEMÆRK: Sørg for, at luftfugtigheden er høj nok under inkubation. Tilsæt om nødvendigt et fugtigt væv til billedkammeret eller inkubatoren for at forhindre fordampning i mikrofluidikopsætningen. Hvis luftfugtigheden i mikroskopinkubatoren er for lav, resulterer dette i dannelse af luftbobler i slangen og den mikrofluidiske chip. En lukket billedbehandlingsboks, hvor chip og slange er placeret, kan derefter bruges. Den enkleste måde at fremstille en sådan billedbehandlingsboks på er ved at placere et stort låg over chippen og tilføje et vådt væv, det behøver ikke at blive lukket helt af. Sørg for, at højdeforskellen mellem pumpe og chip ikke er for stor, og skift om nødvendigt højder langsomt for at forhindre dannelse af luftbobler på grund af tyngdekraften. - Lad alle pumper flyde med en strømningshastighed på 20 μL/h i 20 minutter, efter at opsætningen er placeret på sin endelige placering. Fordi kammeret og pumpen sandsynligvis har bevæget sig i højden, er dette nødvendigt for at genetablere det korrekte tryk i slangen.
- Sluk for lægemiddelpumpen, lad kun mediumpumpen køre ved 60 μL / t indtil starten af eksperimentet / realtidsbilleddannelsen.
- Start af eksperimentet.
- Start det planlagte pumpeprogram til eksperimentet. For at indskrænke Notch-signalering skal du bruge et pumpeprogram på 100 min medium og 30 min lægemiddelimpulser, som gentages indtil eksperimentets afslutning, typisk i 24 timer.
BEMÆRK: Enhver programmerbar mikrofluidisk pumpe kan bruges. I det enkleste format kan pumperne programmeres og startes manuelt. Alternativt kan pumperne styres af en computersoftware. - Hvis der udføres billeddannelse i realtid, skal du starte billeddannelsen efter en periode på mindst 30 minutter. Dette vil gøre det muligt for chippens temperatur at tilpasse sig temperaturen i inkubatoren og forhindre en for stærk drift under billeddannelse. Autofokus er stadig gavnligt.
- Udfør standard konfokal billeddannelse via chippens glasglider ved hjælp af et omvendt mikroskop. Brug et billedinterval på 10 minutter til tilstrækkeligt at detektere signalsvingninger med en periode på 130 minutter.
- I kortere perioder forkortes intervallet for tilstrækkelig prøveudtagning. Inkluder et billedbehandlingsspor med lav opløsning til påvisning af Cascade Blue for at visualisere tilstedeværelsen af lægemiddel på chippen.
- Til excitation af en Venus-reporter skal du bruge en 515 nm laser eller en 2-foton laser ved en bølgelængde på 960 nm.
- Anskaf en z-stak på 6-8 planer med en afstand på 8 μm gennem et 20x planmål (opløsning 512 x 512 pixels, 1,38 μm/pixel). Brug et motoriseret trin til at afbilde flere prøver inden for et eksperiment.
- Excite Cascade Blue med en 405 nm laser og få et enkelt z plan hvert 10. minut (opløsning 32 x 32 pixel, 22,14 μm/pixel).
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om billedbehandling og billedanalyse findes i de repræsentative resultater og kan findes i reference10.
- Start det planlagte pumpeprogram til eksperimentet. For at indskrænke Notch-signalering skal du bruge et pumpeprogram på 100 min medium og 30 min lægemiddelimpulser, som gentages indtil eksperimentets afslutning, typisk i 24 timer.
Representative Results
Med denne protokol præsenteres en metode til ekstern indlejring af signalsvingninger af musesegmenteringsuret ved hjælp af mikrofluidik. Ved at anvende impulser af Notch-signalhæmmer synkroniseres signalsvingninger i uafhængige embryokulturer med hinanden10. En forudsætning for anvendelsen af dette system til at studere funktionaliteten af segmenteringsuret er, at signaldynamik og segmentering stadig er til stede på chippen. Det blev tidligere vist, at både Wnt- og Notch-signaldynamikken opretholdes på trods af konstant medium flow, og fysisk grænsedannelse fortsætter i perifere 2D-kulturer, der repræsenterer forreste PSM10.
For at bekræfte indtrængen af signalsvingninger til eksterne lægemiddelimpulser udføres realtidsbilleddannelse af for eksempel Notch-signalreporteren LuVeLu5, der udtrykker det gule fluorescerende protein Venus, under det mikrofluidiske eksperiment. Da orientering af 2D-kulturerne på chip er vanskelig at kontrollere, analyseres signalsvingninger i forreste væv. Periferien af 2D-kulturen kan reproducerbart detekteres. Orientering af vævssektionerne på chippen kan ikke kontrolleres efter behag, og hele den indre overflade af chippen bliver belagt med fibronectin. Derfor sker det lejlighedsvis, at kulturer fastgøres til siderne eller loftet på chippen. Hvis prøverne bevæger sig ud af synsfeltet (i x-, y- og z-retning), eller de fastgøres med den bageste ende af halen nedad, er disse prøver generelt udelukket.
Til yderligere analyse kombineres flere af sådanne indlejringseksperimenter. Uafhængige eksperimenter kan justeres til hinanden ved hjælp af timingen af lægemiddelimpulserne visualiseret af farvestoffet, Cascade Blue, ved ca. 400 nm. For at analysere og visualisere synkronisering kan kvantificerede svingninger detrendes (figur 2B,D) og derefter enten vises som middelværdi, og standardafvigelse eller faser af svingningerne kan beregnes. Dette gør det muligt at analysere faseforholdet mellem svingninger af uafhængige bageste embryokulturer til hinanden og til de eksterne lægemiddelimpulser (figur 2C,E). Det python-baserede program pyBOAT33 er et ligetil og brugervenligt værktøj til at bestemme periode, fase og amplitude af sådanne signalsvingninger. For at bekræfte indtrængen kan man f.eks. bestemme perioden for de endogene signalsvingninger. Ved påføring af impulser med en periode på 130 min viser Notch-signalsvingninger også en periode på 130 min (figur 2F)10. Derudover kan uafhængige eksperimenter med forskellige signalreportere ved hjælp af Cascade Blue-impulser justeres til hinanden. På denne måde kan faseforholdet mellem svingninger mellem flere signalindlysere indirekte bestemmes10.
Således tillader det præsenterede mikrofluidiske system styring af signalsvingninger i ex vivo-kulturer af det udviklende museembryo. I kombination med billeddannelse af markører til segmentdannelse og differentiering kan dette system nu anvendes til at dissekere, hvordan signalveje for segmenteringsuret interagerer, og hvordan de styrer somitisk dannelse.
Figur 1: Skematisk oversigt over mikrofluidikprotokollen. (A) Chipforme kan designes ved hjælp af CAD-software (computer aided-design). Et chipdesign til at indkapsle signalsvingninger i ex vivo-modeller af museositogenese er tilvejebragt. Forme kan f.eks. genereres ved 3D-print eller bestilles. Mikrofluidiske chips fremstilles ved støbning af PDMS. En hærdet PDMS-chip skæres ud og kovalent bindes til et glasglas ved hjælp af en plasmaovn. Glasoverfladen i chippen er belagt med fibronectin for at tillade dissekeret væv at fastgøre. Embryonalt væv lægges på chippen via indløb, som efterfølgende lukkes. Pumper med forskellige mediebetingelser er fastgjort til chippens indløb, og et flowprogram initialiseres. Væv kan afbildes ved hjælp af et konfokalmikroskop under eksperimentet. (Kymografer tilpasset fra Sonnen et al., 201810. Genoptrykt og ændret fra Cell i henhold til Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) B) Skematisk tegning af et formdesign til on-chip-dyrkning af bageste museembryonvæv. Højden af de mikrofluidiske kanaler er 500 μm, tilstrækkelig til dyrkning af bageste embryonale musehaler. Filen til udskrivning af denne form findes i supplerende fil 1, og et alternativ er angivet i supplerende fil 2. (C) Brightfield-billede af en E10.5-snittet musehale omgivet af PDMS-søjler på chip. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater fra et mikrofluidikseksperiment. (A) Skematisk repræsentation af indlejringseksperiment med medium og lægemiddelpumpe. Impulser af signalvejsmodulator anvendes på ex vivo-kulturer af museembryoner, og signalsvingninger kan visualiseres ved realtidsbilleddannelse af dynamiske signalindmøddere (for eksempel Notch-signalreporteren LuVeLu5 og Wnt-signalreporteren Axin2T2A10). Stiplede linjer angiver det område, der bruges til analyser over tid. (B-F) LuVeLu-reporteroscillationer er indkapslet af periodiske impulser af Notch-signalhæmmeren DAPT. (B,D) Kvantificeringer af Notch-signalsvingninger i forreste PSM ved indlejring ved hjælp af DAPT eller en DMSO-kontrol. (C,E) Fase-fase-relation plots mellem fasen af Notch-signalsvingninger og timingen af eksterne DAPT/DMSO-impulser. I tilfælde af indlejring etableres et stabilt faseforhold. F) Kvantificering af gennemsnitsperioden og SEM for indberettersvingninger, der sammenligner prøver, der er indkapslet med DMSO- og DAPT-impulser. (Figur tilpasset fra Sonnenet al., 201810. Genoptrykt og modificeret fra Cell i henhold til Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Problem | Løsningsforslag |
| PDMS binder sig ikke til glasset. | - Sørg for, at både PDMS og glas er rene. |
| - Sørg for, at der er nok PDMS omkring kammeret til limning. | |
| - Optimer plasmaovnens indstillinger. | |
| Der er luftbobler på min chip. | - Kontroller, om pumpen var tændt. |
| - Afgas chippen, inden du lægger væv på chippen. | |
| - Afgas mediet inden eksperimentets start. | |
| - Sørg for, at luftfugtigheden i inkubationskammeret er høj nok. | |
| Vævet dør i begyndelsen af eksperimentet. | - Tilsæt HEPES til mediet, når du lægger og samler chippen. |
| - Skyl ikke vævet ind og ud for ofte under pålæsning. | |
| - Kontroller, at strømningshastigheden ikke er for høj. | |
| Vævet dør under billeddannelse. | - Sørg for, at der ikke er nogen fototoksicitet fra billeddannelsen |
| - Sørg for, at der ikke er forurening. | |
| - Strømningshastigheden bør ikke være for høj. | |
| Fokus ændres under billeddannelse. | - Brug autofokus under billeddannelse til at justere for afdrift af billeddiaset. |
| - Lad chippen udligne til temperaturen i mikroskopet i mindst 30 minutter. | |
| Udløb/indløb løsnes. | - Skub alle slanger helt ned til bunden. |
| Spånens glas går i stykker. | - Vær mere forsigtig, glasset er meget skrøbeligt. |
| - Det tynde glas er kun nødvendigt til billeddannelse. Hvis billeddannelse ikke udføres, kan der anvendes et normalt tykkere glasglas. | |
| - Hvis bruddet er uden for chippen, er det måske ikke et problem. Hvis glasforseglingen til chippen er brudt, lækker væske ud, og der kommer luft ind. | |
| Der er en forurening på min chip. | - Tilsæt antibiotika til kulturmediet. |
| - Steriliser alt udstyr og slanger. | |
| - Arbejd hurtigt og rent. |
Tabel 1: Fejlfinding
Supplerende sag 1: STL-fil til udskrivning af en form med en 3D-printer. Denne form bruges til at generere en mikrofluidisk chip til on-chip-kulturen af bageste embryonale væv (design vist i figur 1). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sagsmappe 2: STL-fil til udskrivning af en form med en 3D-printer for at generere en mikrofluidisk chip til on-chip-kulturen af bageste embryonale væv. I modsætning til supplerende fil 1 og designet vist i figur 1 indeholder dette design boblefælder ved alle indløb for at forhindre små mængder luft i at komme ind i det vigtigste mikrofluidiske kammer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sagsmappe 3: Designfil til generering af en holder til at placere chippen i mikroskopet. Denne holder har dimensionerne på en 96-brønds plade og skal passe ind i standardholdere af de fleste mikroskoper. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Hvordan signaldynamik styrer flercellede systemer har været et langvarigt spørgsmål på området. Funktionel undersøgelse udgør en central udfordring, fordi disse dynamikker skal moduleres subtilt for at muliggøre dette11. En sådan tidsmæssig kontrol over vejforstyrrelser kan i princippet opnås med optogenetik, hvilket også muliggør en høj rumlig kontrol34. Optogenetik kræver imidlertid, at der etableres sofistikerede genetiske værktøjer til analyse af hver enkelt signalvej. Den nuværende protokol, der er beskrevet her, giver et meget alsidigt værktøj til forstyrrelse af enhver signalvej. Mikrofluidikeksperimentet gør det muligt at anvende tidsmæssigt kontrollerede lægemiddelimpulser til funktionelt at undersøge dynamikken i signalveje i vævskulturer. Her er fokus på studiet af somitogenese i ex vivo-kulturer , men protokollen kan tilpasses, så den passer til alle andre modelsystemer.
Visse trin i protokollen er afgørende for at udføre et vellykket mikrofluidikeksperiment (opsummeret i tabel 1). Nøglepunkter diskuteres som følger. På grund af medium flow i løbet af eksperimentet oplever vævskulturen forskydningsstress. Eksponering af modelsystemet for kontinuerlig strømning kan forårsage cellestress og i ekstreme tilfælde celledød på grund af forskydningseffekt. For ex vivo-vævskulturer af musehaleknopper og det nuværende chipdesign viste det sig, at en strømningshastighed på 60 μL/h (højst 100 μL/h) fungerede godt med minimal forskydningseffekt. Når flere pumper tændes samtidigt for den samme chip, skal strømningshastigheden for de enkelte pumper justeres i overensstemmelse hermed for ikke at forårsage en stigning i den samlede strømningshastighed. Når den nuværende protokol er tilpasset andre modelsystemer og chipdesign, skal strømningshastigheden optimeres. Alternativt er det muligt ikke at skylle medium kontinuerligt, men med jævne mellemrum skifte medium på chippen35. En sådan opsætning kan også anvendes til at styre signalsvingninger i musesomiogenese (ikke offentliggjort, data ikke vist). Desuden kan man også forestille sig en opsætning, hvor vævskulturer ikke udsættes for direkte væskestrøm, men lægemidler når vævet ved diffusion fra en nabokanal. Sådanne systemer er blevet anvendt med succes til at anvende gradienter af vækstfaktorer på in vitro-modeller for ESC-differentiering14,36.
Et stort problem med mikrofluidiske eksperimenter er forekomsten af luftbobler på chip under eksperimentet. Luftbobler i chippen eller slangen kan forstyrre ensartet væskestrøm på chippen og kan føre til fjernelse af embryokulturen fra dens placering. For at forhindre tilstedeværelsen af luftbobler er forskellige trin i protokollen uundværlige. For det første skal dyrkningsmediet i sprøjterne og selve mikrofluidchippen afgasses ved hjælp af en ekssikkator (trin 3.1.3). For det andet skal man, når man lægger prøver i lasteindløbene, være forsigtig med ikke at pipetere luft ind i spånen sammen med prøven (trin 3.2.3). For det tredje, når slangen fyldes med medium, skal alle luftbobler pumpes ud, inden chippen fastgøres (trin 3.3.2). Ellers vil disse bobler blive skubbet ind i hovedchippen under eksperimentet. Endelig er mediet under eksperimentet ligestillet i billeddannelseskammeret eller inkubatoren på grund af den semipermeable slange. Slangens permeabilitet muliggør også fordampning af mediet, så sørg for, at fugtigheden reguleres under eksperimentet for at forhindre dannelse af nye bobler i slangen.
Generelt er mikrofluidik et meget alsidigt værktøj, der kan tilpasses forskerens specifikke spørgsmål. Den nuværende designtilgang giver mulighed for at afbilde op til 12 ex vivo-kulturer parallelt pr. Chip. Dette antal er hovedsageligt begrænset af antallet af embryoner pr. forsøg og den tid, det tager at afbilde hver embryokultur med tilstrækkelig opløsning. Hvis flere betingelser skal sammenlignes i et enkelt eksperiment, kan flere chips monteres på et enkelt glasglas. Der leveres et chipdesign, som er ideelt til billeddannelse af flere vævseksplanter parallelt, men personlige designs kan overvinde begrænsninger i prøveantal for at muliggøre analyse med høj gennemstrømning og øge kombinationen af flere betingelser inden for et enkelt eksperiment16,17. Mikrofluidik er begrænset til modeller, der kan dyrkes på en chip, og on-chip-kulturen skal optimeres for hvert modelsystem individuelt27,37,38.
I løbet af de sidste 5-10 år er mikrofluidik blevet anvendt til at løse forskellige biologiske spørgsmål på grund af dets potentiale for tilgange med høj gennemstrømning og subtile moduleringer af signaldynamik og gradienter. I dag er mikrofluidik blevet et let anvendeligt, billigt og alsidigt værktøj, som laboratorier let kan etablere. Her er den nuværende protokol optimeret til en bestemt applikation, nemlig at studere signaldynamik, der styrer somitogenese. Det er ligetil at tilpasse denne protokol og design, så den passer til individuelle forskningsspørgsmål inden for vævsbiologi.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Yang Li og Jos Malda fra UMC Utrecht for hjælp til 3D-udskrivning af forme, Karen van den Anker fra Sonnen-gruppen for meget nyttig feedback på protokollen og Tjeerd Faase fra det mekaniske værksted på Hubrecht Institute for indehaveren af mikrofluidiske chips i mikroskopet. Vi vil gerne takke hele Sonnen-gruppen for kritisk læsning af manuskriptet og korrekturlæserne for deres konstruktive feedback. Dette arbejde modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd i henhold til en EFR-startbevillingsaftale nr. 850554 til K.F.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
References
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding - From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
