Summary
Se proporciona un protocolo para el cultivo y manipulación de tejido embrionario de ratón en un chip microfluídico. Mediante la aplicación de pulsos de moduladores de vía, este sistema se puede utilizar para controlar externamente las oscilaciones de señalización para la investigación funcional de la somitogénesis del ratón.
Abstract
La segmentación periódica del mesodermo presómico de un embrión de ratón en desarrollo está controlada por una red de vías de señalización. Se cree que las oscilaciones de señalización y los gradientes controlan el tiempo y el espaciado de la formación de segmentos, respectivamente. Si bien las vías de señalización involucradas se han estudiado ampliamente en las últimas décadas, ha faltado evidencia directa de la función de las oscilaciones de señalización en el control de la somitogénesis. Para permitir la investigación funcional de la dinámica de señalización, la microfluídica es una herramienta previamente establecida para la modulación sutil de estas dinámicas. Con este enfoque de arrastre basado en microfluídica, las oscilaciones de señalización endógenas se sincronizan mediante pulsos de moduladores de vía. Esto permite la modulación de, por ejemplo, el período de oscilación o la relación de fase entre dos vías oscilantes. Además, se pueden establecer gradientes espaciales de moduladores de vía a lo largo del tejido para estudiar cómo los cambios específicos en los gradientes de señalización afectan la somitogénesis.
El presente protocolo está destinado a ayudar a establecer enfoques microfluídicos para los usuarios primerizos de microfluídica. Se describen los principios básicos y el equipo necesario para configurar un sistema microfluídico, y se proporciona un diseño de chip, con el que se puede preparar convenientemente un molde para la generación de chips utilizando una impresora 3D. Finalmente, se discute cómo cultivar tejido primario de ratón en un chip microfluídico y cómo arrastrar las oscilaciones de señalización a pulsos externos de moduladores de vía.
Este sistema microfluídico también se puede adaptar para albergar otros sistemas modelo in vivo e in vitro , como gastruloides y organoides, para la investigación funcional de la dinámica de señalización y los gradientes de morfógenos en otros contextos.
Introduction
El desarrollo está controlado por la comunicación intercelular a través de vías de señalización. Solo hay un número limitado de vías de señalización que orquestan la formación compleja de tejidos y la diferenciación celular adecuada en el espacio y el tiempo. Para regular esta multitud de procesos, la información puede codificarse en la dinámica de una vía de señalización, el cambio de una vía a lo largo del tiempo, como la frecuencia o la duración de una señal1,2.
Durante la somitogénesis, el tejido somítico se segmenta periódicamente del mesodermo presomito (PSM)3. El PSM está organizado espacialmente por gradientes de Wnt, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y señalización de ácido retinoico. En el PSM anterior en el frente de determinación, donde las señales Wnt y FGF son bajas, las células están preparadas para la diferenciación en somitas. La diferenciación ocurre cuando una onda de activación transcripcional alcanza este frente de determinación. Dentro del PSM, la señalización Wnt, FGF y Notch oscila. Las células vecinas oscilan ligeramente fuera de fase, lo que resulta en ondas de activación transcripcional oscilatoria aguas abajo de las vías Wnt, FGF y Notch que viajan desde el PSM posterior al anterior. En embriones de ratón, una onda transcripcional alcanza el frente de determinación aproximadamente cada 2 h e inicia la formación de somita. El estudio de la somitogénesis perturbando o activando las vías de señalización puede ilustrar la importancia de estas vías4,5,6,7,8,9. Sin embargo, para poder investigar la función de la dinámica de señalización en el control del comportamiento celular, es esencial modular sutilmente las vías de señalización en lugar de activarlas o inhibirlas permanentemente.
Para modular temporalmente la actividad de la vía de señalización dentro del embrión de ratón segmentador, Sonnen et al. han desarrollado un sistema microfluídico10. Este sistema permite un control estricto de los flujos de fluidos dentro de los microcanales de un chip que contiene la muestra biológica11. Para estudiar la importancia de la dinámica de señalización para la segmentación adecuada de PSM, esta configuración de microfluídica se utiliza para modular la dinámica de señalización del reloj de segmentación del ratón ex vivo. Mediante la pulsación secuencial de activadores o inhibidores de la vía en la cámara de cultivo, se logra el control externo de la dinámica de la señalización de Wnt, FGF y Notch10. Por ejemplo, es posible modificar el período de las vías individuales y la relación de fase entre múltiples vías de señalización oscilatoria. Utilizando imágenes concomitantes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica, se puede analizar el efecto del arrastre en las propias vías, en la diferenciación y la formación de somita. Utilizando este nivel de control sobre la dinámica de señalización, se destacó la importancia de la relación de fase entre las vías de señalización Wnt y Notch durante la somitogénesis10.
Los diseños personalizados de chips permiten una gran cantidad de opciones para perturbaciones espaciotemporales dentro del entorno local, por ejemplo, formación de gradiente estable12,13,14,15, activación/inhibición pulsátil10,16,17,18 o perturbaciones localizadas19,20 . La microfluídica también puede permitir una lectura más reproducible y un mayor rendimiento debido a la automatización del manejo experimental21,22,23. El presente protocolo está destinado a llevar la microfluídica y el arrastre de oscilaciones de señalización endógenas dentro de los tejidos a todos los laboratorios estándar de ciencias de la vida. Incluso en ausencia de equipos sofisticados para la generación de chips, como salas limpias y equipos para litografía blanda, los chips microfluídicos se pueden fabricar y utilizar para abordar cuestiones biológicas. Los moldes se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD) disponible gratuitamente. Un molde para la generación de chips microfluídicos, que generalmente consiste en polidimetilsiloxano (PDMS), se puede imprimir con una impresora 3D o pedirse a empresas de impresión. De esta manera, los chips microfluídicos se pueden producir en un día sin la necesidad de costosos equipos24. Aquí, se proporciona un diseño de chip, con el que se puede imprimir un molde para el arrastre del reloj de segmentación del mouse en cultivos bidimensionales (2D) ex vivo25 con una impresora 3D.
Los cultivos en chip y las perturbaciones precisas, habilitadas por la microfluídica, tienen un potencial excepcional para desentrañar los mecanismos moleculares de cómo las vías de señalización controlan el comportamiento multicelular. La dinámica de señalización y los gradientes de morfógenos son necesarios para muchos procesos en desarrollo. Anteriormente, los laboratorios habían cultivado células, tejidos y organismos enteros en chips microfluídicos y los protocolos para la perturbación espaciotemporal del cultivo celular principalmente 2D se proporcionan en otros lugares12,26,27,28,29. La aplicación de microfluídica para modular entornos locales en sistemas multicelulares abre nuevas perspectivas para perturbaciones espaciotemporales precisas y de alto rendimiento. El campo de la microfluídica ha llegado a un punto en el que se ha convertido en una herramienta no especializada, económica y fácilmente aplicable para los biólogos del desarrollo.
Aquí, se proporciona un protocolo para el arrastre del reloj de segmentación del mouse a los pulsos de un inhibidor de señalización Notch. Dicho experimento consta de los siguientes pasos: (1) generación de chip microfluídico, (2) preparación de tubos y recubrimiento del chip, y (3) el experimento microfluídico en sí (Figura 1A). La investigación que involucra sistemas modelo de vertebrados requiere la aprobación ética previa del comité responsable.
Protocol
La investigación presentada aquí ha sido aprobada por el comité de ética del EMBL10 y el comité holandés para la investigación animal (dierenexperimentencommissie, DEC), y sigue las directrices de Hubrecht para el cuidado de los animales.
Use guantes mientras trabaja con PDMS líquido. Cubrir superficies y equipos. Retire cualquier derrame de inmediato, ya que la limpieza se vuelve difícil una vez que se endurece.
1. Generación del chip
NOTA: Los chips microfluídicos se generan mediante la fundición de PDMS (polidimetilsiloxano) en un molde. Los moldes se pueden diseñar utilizando software CAD (por ejemplo, uFlow o 3DμF30). Un repositorio de diseños libres es proporcionado por el MIT (Metafluidics.org). Los moldes se imprimen con una impresora 3D o se pueden generar mediante litografía suave utilizando una fotomáscara que contiene el diseño deseado (para obtener más información, consulte, por ejemplo, Qin et al., 201031). Aquí, se proporciona un diseño para un molde que se puede imprimir con una impresora 3D para el cultivo en chip de tejido embrionario de ratón (Figura 1B, C, Archivos complementarios 1 y 2). Para permitir la impresión con impresoras 3D de menor resolución, el diseño se ha modificado en comparación con el publicado anteriormente10. Se proporciona un molde sin trampas de burbujas de aire y uno con trampas de burbujas de aire (Archivos complementarios 1 y 2, respectivamente). Como el procedimiento para imprimir depende de la impresora disponible, no se describirán los detalles para la impresión. Sin embargo, uno debe asegurarse de que toda la resina no polimerizada se elimine por completo. A menudo se requiere realizar un lavado adicional con solventes para eliminar la resina no polimerizada de los pequeños orificios de <200 μm dentro de la cámara microfluídica. Estos agujeros formarán pilares PDMS para atrapar el tejido embrionario dentro del chip durante el experimento. PDMS se usa generalmente para microfluídica, ya que es barato, biocompatible y transparente, y tiene baja autofluorescencia. Después del curado, el chip PDMS se corta del molde y se adhiere a un portaobjetos de vidrio. El tratamiento con plasma tanto del vidrio como del chip PDMS activa las superficies y permite la formación de enlaces covalentes, cuando se ponen en contacto.
- Prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de 9:1 (w:w) para inducir la polimerización. Use herramientas desechables para mezclar, como vasos de plástico y tenedores. Asegúrese de que la mezcla se logra correctamente.
- Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire de la mezcla PDMS. Debido al vacío dentro del desecador, el aire se eliminará de la mezcla PDMS.
NOTA: Cubra el interior del desecador con tejidos en caso de que PDMS fluya. - Vierta la mezcla pdms en el molde del chip (una capa PDMS de aproximadamente 3-5 mm es suficiente).
- Coloque el molde lleno de PDMS de nuevo en el desecador y aplique vacío para eliminar las burbujas restantes. Asegúrese de que el aire se elimine de todas las estructuras más pequeñas del molde.
- Cure el molde colocándolo en un horno de 65 ° C (o menos dependiendo del material del molde) durante la noche. Corta el chip del molde con un bisturí. Corte el PDMS endurecido del molde con suficiente espacio (1-2 cm) alrededor del diseño para permitir una unión posterior. Asegúrese de cortar el PDMS por completo para evitar la rotura del chip al sacarlo. Levante el chip PDMS con cuidado, primero con el extremo romo del bisturí y, cuando sea posible, con las manos.
- Perforar los orificios de entrada y salida, comenzando desde el interior de la cámara microfluídica utilizando una punción de biopsia de 1 mm.
- Limpie brevemente el chip PDMS con aire comprimido y cinta adhesiva adhesiva adhesiva en ambos lados para eliminar los trozos atascados de PDMS y polvo y mantenerlo limpio hasta su uso posterior.
NOTA: El chip se puede mantener así hasta su uso posterior. - Limpie el portaobjetos de vidrio con aire comprimido. Tenga cuidado de que no se rompa. Retire la cinta adhesiva del chip PDMS.
- Une el chip al portaobjetos de vidrio con un horno de plasma. Las siguientes instrucciones están optimizadas para el plasma de aire.
NOTA: Consulte el manual del horno de plasma del laboratorio y optimice el procedimiento para el experimento específico.- Coloque el chip y el portaobjetos de vidrio en el horno de plasma con los lados a unir hacia arriba.
- Coloque la tapa en el horno de plasma y manténgala en su lugar mientras aplica el vacío y espere hasta que se haya establecido el vacío.
- Encienda el gas presionando el botón Gas y espere aproximadamente 1 minuto (la presión debe estar en alrededor de 0.37 mbar).
- Generar plasma presionando Generador (Potencia: 9.0, Tiempo: 1 min).
- Cuando termine, apague la bomba y el gas; ventilar y abrir la puerta.
- Une el chip al vidrio colocando las superficies activadas unas sobre otras y aplicando presión uniformemente. Tenga cuidado de que el vidrio no se rompa.
NOTA: Se puede realizar una prueba de agua para confirmar que el tratamiento con plasma ha funcionado. Coloque una gota de agua sobre la superficie del vidrio. Si el tratamiento con plasma ha funcionado, el agua debe extenderse inmediatamente en lugar de formar una gota.
- Coloque el chip adherido en un horno a 65 °C durante 5 min.
- Selle el lado expuesto del chip con cinta adhesiva para evitar que el polvo entre en las entradas.
NOTA: El chip se puede conservar hasta su uso. Las aberturas deben cerrarse con cinta adhesiva hasta entonces.
2. Preparación del experimento de microfluídica
NOTA: Los siguientes pasos preparatorios son necesarios para realizar el experimento de microfluídica: Primero, al realizar el experimento de microfluídica, se crea un flujo de fluido desde las entradas hasta las salidas. Cualquier agujero en el chip funcionará como salidas debido a la acumulación de presión de las entradas. Por lo tanto, todos los orificios que no se utilizan deben cerrarse; por ejemplo, agujeros que se utilizan para cargar tejido en el chip. Si estos no están cerrados, el tejido puede fluir con el líquido. Para cerrar estos agujeros, se utilizan tubos llenos de PDMS. Los tubos llenos de PDMS se pueden mantener indefinidamente y, por lo tanto, no será necesario prepararlos para cada experimento de microfluídica por separado, sino que se pueden hacer en lotes más grandes. En segundo lugar, antes del inicio del experimento microfluídico, se preparan tubos, tubos llenos de PDMS y el chip, necesario para el experimento, y se esterilizan por UV. Finalmente, el chip tiene que ser recubierto con fibronectina, para que el tejido embrionario pueda adherirse al vidrio25.
- Fabricación de tubos rellenos de PDMS.
- Tome ±1 m de tubo. Se pueden llenar más tubos con PDMS tomando varias piezas de tubos.
- Prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de 9:1 (w:w) para inducir la polimerización.
NOTA: Use herramientas desechables para mezclar, como vasos de plástico y tenedores. Mezclar adecuadamente. - Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire de la mezcla PDMS.
NOTA: Cubra el interior del desecador con tejidos en caso de que PDMS fluya. - Llene una jeringa de 3 ml con PDMS. Llene con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire en la mezcla.
- Use fórceps para insertar la punta de una aguja de 22 G en el tubo.
NOTA: Tenga cuidado de no perforar el tubo o los dedos con la aguja. - Conecte el tubo a la jeringa llena de PDMS a través de la aguja. Utilice la bomba de jeringa para llenar el tubo, con un caudal de aproximadamente 500 μL/h. Tenga cuidado de no aplicar una presión demasiado alta para evitar la rotura de la bomba.
- Una vez que el tubo esté completamente lleno de PDMS, colóquelo en un plato de 15 cm y cure a temperatura ambiente (al menos durante la noche).
- Prepare el tubo y el chip para el experimento.
NOTA: Se requiere el siguiente tubo para el experimento: primero, aproximadamente 50 cm de tubo por salida y segundo, aproximadamente 2-3 m por entrada (el tamaño exacto depende de la organización espacial de las bombas, incubadora o microscopio utilizados más adelante). El tubo de entrada debe ser largo para permitir que el medio de cultivo se equilibre con CO2 para el cultivo de embriones durante el experimento.- Cortar el tubo en un ángulo de 45° para que se creen extremos puntiagudos; esto hará que sea más fácil insertar el tubo en los orificios del chip. Coloque una aguja en cada uno de los tubos de entrada. Consulte el paso 2.1.5.
- Corte los tubos llenos de PDMS en tapones de ±1 cm. Corte en un ángulo de 45 ° para que se creen extremos puntiagudos; esto hará que sea más fácil insertar el tubo en los orificios del chip. Se necesitan suficientes tapones para llenar cada orificio que no está unido a ningún tubo.
- Retire la cinta adhesiva del chip.
- Coloque todos los tubos con agujas unidas, el chip y los tapones en un plato y esterilice exponiendo a la luz UV durante ±15 min. Se puede utilizar cualquier campana de cultivo celular con posibilidad de esterilización UV.
- Recubrimiento de chip con fibronectina.
NOTA: Para el cultivo de cultivos 2D ex vivo de PSM posterior, cubra el chip con fibronectina.- Coloque el chip en un vaso de precipitados que contenga PBS + 1% de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente. Asegúrese de que el chip esté completamente cubierto con PBS. Enjuague el chip con PBS para eliminar el aire con una pipeta P200.
NOTA: Todo el manejo posterior del chip se realizará en este vaso de precipitados hasta el inicio del experimento para evitar la entrada de aire en el chip. Tenga cuidado de no romper la diapositiva de vidrio del chip. - Prepare 2 ml de fibronectina 1:20 en PBS y llénelo en un vaso de precipitados.
- Cargue una jeringa de 3 ml para cada cámara del chip. Con fórceps, inserte una aguja de 22 G en el tubo de salida. Conecte la aguja a la jeringa que contiene fibronectina.
- Conecte la jeringa a la bomba de la jeringa. Enjuague el tubo hasta que no quede aire en el tubo.
- Conecte el tubo de salida a la salida del chip. Asegúrese de empujar el tubo hasta el fondo. Establezca un caudal bajo para recubrir el chip. Todas las demás aberturas pueden permanecer abiertas. Deje que la bomba de la jeringa funcione durante al menos 2 h, también puede funcionar durante la noche.
- Detenga la bomba. Corte el tubo justo después de la aguja. El tubo restante servirá como salida durante el experimento más adelante.
- Coloque el chip en un vaso de precipitados que contenga PBS + 1% de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente. Asegúrese de que el chip esté completamente cubierto con PBS. Enjuague el chip con PBS para eliminar el aire con una pipeta P200.
3. Experimento de microfluídica
NOTA: Aquí se presenta un protocolo para el arrastre del reloj de segmentación del ratón en cultivos 2D ex vivo mediante la aplicación de pulsos del inhibidor de señalización Notch DAPT. La aplicación de pulsos con un período de 130 min, cerca del período natural del reloj de segmentación del ratón (137 min25), permite un arrastre eficiente. Se aplican pulsos de 100 min de medio y 30 min de 2 μM DAPT (Figura 2A). La presencia de fármaco dentro del chip se controla mediante un tinte fluorescente. Los espectros de excitación y emisión de este tinte y el informador de señalización fluorescente deben ser lo suficientemente diferentes como para evitar el sangrado durante las imágenes en tiempo real de fluorescencia. Cuando se utilizan proteínas fluorescentes amarillas como reporteras de señalización, como el reportero de señalización Notch LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), se puede aplicar el tinte, Cascade Blue. Para identificar otras posibles combinaciones de tinte fluorescente y reportero, se puede utilizar el visor de espectros disponible gratuitamente. El efecto del arrastre puede detectarse mediante imágenes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica5,10,32. Cada chip tiene dos cámaras de incubación. Esto permite la comparación directa de pulsos de fármacos (DAPT) para controlar pulsos (DMSO).
- Hacer medio y degasificar.
- El día del experimento, preparar 50 ml de medio de cultivo (DMEM-F12 suplementado con 0,5 mM de glucosa, 2 mM de glutamina y 1% de BSA, para obtener más información sobre el cultivo de tailbud de ratón ver25).
- Prepare jeringas llenas con el medio para el experimento. Preparar medio de cultivo en vasos de precipitados: Para arrastrar las oscilaciones de señalización Notch, prepare 6 mL de medio con 1.2 μL de DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 mL de medio de cultivo con 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; dos tubos con 6 mL de medio cada uno. Use al menos 6 ml de medio por jeringa. Cargue las jeringas con el medio. Asegúrese de etiquetar las jeringas que contienen medicamentos y DMSO.
- Desgasificar el chip dentro de PBS y las jeringas que contienen el medio en un desecador. Coloque las jeringas en un vaso de precipitados con la punta hacia arriba, para que el aire pueda escapar en la parte superior. Puede ocurrir que el chip flote y todavía esté lleno de burbujas. Estos serán eliminados posteriormente.
- Trate de eliminar / aspirar la mayoría de las burbujas de aire del chip usando una pipeta P200. Si queda algo de aire, este se eliminará durante el siguiente experimento.
- Instale jeringas en las bombas y conecte los tubos de entrada a las jeringas. Para captar la señalización de Notch, use dos bombas de jeringa, una que lleve las jeringas medianas, otra que lleve las jeringas de medicamento / DMSO. Deje que esto funcione a un caudal más alto (0,5 ml / h) hasta el inicio del experimento para eliminar las burbujas de aire del tubo. Tenga cuidado de ajustar los detalles de la jeringa (diámetro) correctamente en la bomba.
- Carga de tejido en el chip.
- Diseccionar tejido embrionario de ratón. Diseccionar la punta más posterior de la cola (tailbud). Coloque el tejido diseccionado en un medio de cultivo + 25 μM HEPES.
- Enjuague el chip con medio de cultivo + 25 μM HEPES usando un P200 para eliminar PBS.
- Cargue el tejido en el chip usando una pipeta P200 (Figura 1C). Asegúrese de no introducir burbujas de aire en el chip.
NOTA: La carga eficiente requiere algo de práctica. Si el tejido no está orientado correctamente, podría ser posible girarlo succionándolo cuidadosamente y enjuagándolo nuevamente. Sin embargo, esto a menudo resulta en la muerte celular rápida. - Después de cada paso de carga de tejido, cierre la entrada de carga de tejido correspondiente con un trozo de tubo lleno de PDMS. Asegúrese de que los tapones estén suficientemente empujados hacia abajo hasta la parte inferior del chip con pinzas romas.
- Después de que se hayan cargado todas las muestras, cierre las entradas/ salidas no utilizadas con trozos de tubos llenos de PDMS con fórceps contundentes.
- Montaje de configuración microfluídica.
- Reducir el caudal de las bombas microfluídicas. 60-100 μL/h funciona bien para los tailbuds embrionarios de ratón. A tasas de flujo más altas, se observó la muerte celular, presumiblemente debido a una cizalladura celular demasiado alta. El caudal acumulado de múltiples bombas no debe exceder estos 60-100 μL/h por cámara microfluídica en un momento dado.
- Conecte el tubo al chip microfluídico. Haga esto sin obtener burbujas de aire dentro del chip (esto se puede lograr asegurándose de que haya una gota de medio presente al final del tubo). Las salidas todavía están presentes desde el recubrimiento de fibronectina (véase 2.3).
- Una vez que todos los tubos estén unidos al chip, sáquelo del vaso de precipitados, séquelo adecuadamente, colóquelo en un plato y póngalo junto con aproximadamente 1,5 m de tubo de entrada en una incubadora (37 ° C, 20% O2, 5% CO2) para el cultivo nocturno. El tubo es permeable al gas; esto permitirá equilibrar el O2 y el CO2 en el medio. Alternativamente, para imágenes simultáneas de fluorescencia en tiempo real, el chip y el tubo de entrada de aproximadamente 1,5 m se colocan directamente en el microscopio. Un soporte para el chip, que se ajusta a los soportes estándar de placa de 96 pocillos, se proporciona en el Archivo Suplementario 3.
NOTA: Asegúrese de que la humedad sea lo suficientemente alta durante la incubación. Si es necesario, agregue un tejido húmedo a la cámara de imágenes o incubadora para evitar la evaporación en la configuración de microfluídica. Si la humedad en la incubadora del microscopio es demasiado baja, esto resulta en la formación de burbujas de aire en el tubo y el chip microfluídico. A continuación, se puede utilizar una caja de imágenes cerrada, en la que se colocan chips y tubos. La forma más sencilla de hacer una caja de imágenes de este tipo es colocando una tapa grande sobre el chip y agregando un tejido húmedo, no tiene que cerrarse por completo. Asegúrese de que la diferencia de altura entre la bomba y el chip no sea demasiado grande y, si es necesario, cambie las alturas lentamente para evitar la formación de burbujas de aire debido a la gravedad. - Deje que todas las bombas fluyan a un caudal de 20 μL/h durante 20 min, después de que la configuración se haya colocado en su ubicación final. Debido a que lo más probable es que la cámara y la bomba se hayan movido en altura, esto es necesario para restablecer la presión correcta en el tubo.
- Apague la bomba de la droga, deje que solo la bomba media funcione a 60 μL / h hasta el inicio del experimento / imágenes en tiempo real.
- Inicio del experimento.
- Inicie el programa de bombeo planificado para el experimento. Para arrastrar la señalización de Notch, use un programa de bombeo de pulsos de drogas de 100 minutos de medio y 30 minutos, que se repite hasta el final del experimento, generalmente durante 24 horas.
NOTA: Se puede utilizar cualquier bomba microfluídica programable. En el formato más simple, las bombas se pueden programar e iniciar manualmente. Alternativamente, las bombas pueden ser controladas por un software de computadora. - En caso de que se realicen imágenes en tiempo real, comience a tomar imágenes después de un período de al menos 30 minutos. Esto permitirá que la temperatura del chip se ajuste a la temperatura dentro de la incubadora y evitará una deriva demasiado fuerte durante la toma de imágenes. El enfoque automático sigue siendo beneficioso.
- Realice imágenes confocales estándar a través del portaobjetos de vidrio del chip utilizando un microscopio invertido. Utilice un intervalo de imagen de 10 minutos para detectar suficientemente las oscilaciones de señalización con un período de 130 minutos.
- Para períodos más cortos, acorte el intervalo para un muestreo suficiente. Incluya una pista de imágenes de baja resolución para la detección de Cascade Blue para visualizar la presencia de drogas en el chip.
- Para la excitación de un reportero de Venus, use un láser de 515 nm o un láser de 2 fotones a una longitud de onda de 960 nm.
- Adquiera una pila z de 6-8 planos con una distancia de 8 μm a través de un objetivo de plan 20x (resolución 512 x 512 píxeles, 1,38 μm / píxel). Utilice una etapa motorizada para obtener imágenes de varias muestras dentro de un experimento.
- Excite Cascade Blue con un láser de 405 nm y adquiera un solo plano z cada 10 min (resolución 32 x 32 píxeles, 22,14 μm/píxel).
NOTA: Se proporciona más información sobre imágenes y análisis de imágenes en los Resultados representativos y se puede encontrar en la referencia10.
- Inicie el programa de bombeo planificado para el experimento. Para arrastrar la señalización de Notch, use un programa de bombeo de pulsos de drogas de 100 minutos de medio y 30 minutos, que se repite hasta el final del experimento, generalmente durante 24 horas.
Representative Results
Con este protocolo, se presenta un método para el arrastre externo de las oscilaciones de señalización del reloj de segmentación del ratón utilizando microfluídica. Mediante la aplicación de pulsos del inhibidor de señalización Notch, las oscilaciones de señalización en cultivos embrionarios independientes se sincronizan entre sí10. Un requisito previo para la aplicación de este sistema para estudiar la funcionalidad del reloj de segmentación es que la dinámica de señalización y la segmentación todavía están presentes en el chip. Se demostró anteriormente que tanto la dinámica de señalización Wnt como Notch se mantienen a pesar del flujo medio constante y la formación de límites físicos persiste en cultivos 2D periféricos, lo que representa PSM10 anterior.
Para confirmar el arrastre de las oscilaciones de señalización a pulsos de medicamentos externos, se realizan imágenes en tiempo real de, por ejemplo, el reportero de señalización Notch LuVeLu5, que expresa la proteína fluorescente amarilla Venus, durante el experimento microfluídico. Dado que la orientación de los cultivos 2D en chip es difícil de controlar, se analizan las oscilaciones de señalización en el tejido anterior. La periferia del cultivo 2D puede ser detectada de forma reproducible. La orientación de las secciones de tejido en el chip no se puede controlar a voluntad y toda la superficie interna del chip se recubre con fibronectina. Por lo tanto, ocasionalmente sucede que los cultivos se adhieren a los lados o al techo del chip. En caso de que las muestras se muevan fuera del campo de visión (en dirección x, y y z) o se adhieran con el extremo posterior de la cola mirando hacia abajo, generalmente se excluyen estas muestras.
Para un análisis más detallado, se combinan varios de estos experimentos de arrastre. Los experimentos independientes se pueden alinear entre sí utilizando el tiempo de los pulsos de fármaco visualizados por el tinte, Cascade Blue, a aproximadamente 400 nm. Para analizar y visualizar la sincronización, las oscilaciones cuantificadas se pueden destendenciar (Figura 2B, D) y luego se pueden mostrar como media y desviación estándar o se pueden calcular las fases de las oscilaciones. Esto permite el análisis de la relación de fase entre las oscilaciones de los cultivos de embriones posteriores independientes entre sí y con los pulsos externos de fármacos (Figura 2C,E). El programa basado en Python pyBOAT33 es una herramienta sencilla y fácil de usar para determinar el período, la fase y la amplitud de tales oscilaciones de señalización. Para confirmar el arrastre, se puede, por ejemplo, determinar el período de las oscilaciones de señalización endógenas. Al aplicar pulsos con un período de 130 min, las oscilaciones de señalización notch también muestran un período de 130 min (Figura 2F)10. Además, utilizando pulsos Cascade Blue, los experimentos independientes con diferentes reporteros de señalización se pueden alinear entre sí. De esta manera se puede determinar indirectamente la relación de fase entre las oscilaciones de múltiples reporteros de señalización10.
Así, el sistema microfluídico presentado permite el control de las oscilaciones de señalización en cultivos ex vivo del embrión de ratón en desarrollo. En combinación con imágenes de marcadores para la formación y diferenciación de segmentos, este sistema ahora se puede aplicar para diseccionar cómo interactúan las vías de señalización del reloj de segmentación y cómo controlan la formación de somitas.
Figura 1: Descripción general esquemática del protocolo de microfluídica. (A) Los moldes de chip se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD). Se proporciona un diseño de chip para arrastrar las oscilaciones de señalización en modelos ex vivo de somitogénesis de ratón. Los moldes pueden, por ejemplo, ser generados por impresión 3D u ordenados. Los chips microfluídicos se producen mediante moldeo de PDMS. Un chip PDMS endurecido se corta y se une covalentemente a un portaobjetos de vidrio utilizando un horno de plasma. La superficie de vidrio dentro del chip está recubierta con fibronectina para permitir que el tejido diseccionado se adhiera. El tejido embrionario se carga en el chip a través de entradas de carga, que posteriormente se cierran. Las bombas con diferentes condiciones de medios se unen a las entradas del chip y se inicializa un programa de flujo. El tejido se puede obtener imágenes utilizando un microscopio confocal durante el experimento. (Kymographs adaptados de Sonnen et al., 201810. Reimpreso y modificado de Cell según Creative Commons Atribución CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Dibujo esquemático de un diseño de molde para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior de ratón. La altura de los canales microfluídicos es de 500 μm, suficiente para el cultivo de colas de ratón embrionarias posteriores. El archivo para imprimir este molde se proporciona en el Archivo Suplementario 1, y una alternativa se da en el Archivo Suplementario 2. (C) Imagen de campo brillante de una cola de ratón seccionada E10.5 encerrada por pilares PDMS en el chip. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de un experimento de microfluídica. (A) Representación esquemática del experimento de arrastre con medio y bomba de fármaco. Los pulsos del modulador de la vía de señalización se aplican a cultivos ex vivo de embriones de ratón y las oscilaciones de señalización se pueden visualizar mediante imágenes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica (por ejemplo, el reportero de señalización Notch LuVeLu5 y el reportero de señalización Wnt Axin2T2A10). Las líneas discontinuas indican la región que se utiliza para los análisis a lo largo del tiempo. (B-F) Las oscilaciones del reportero LuVeLu son arrastradas por pulsos periódicos del inhibidor de señalización Notch DAPT. (B,D) Cuantificaciones de las oscilaciones de señalización Notch en PSM anterior tras el arrastre utilizando DAPT o un control DMSO. (C,E) La relación fase-fase traza entre la fase de las oscilaciones de señalización Notch y la sincronización de los pulsos EXTERNOS DAPT/DMSO. En caso de arrastre, se establece una relación fase-fase estable. (F) Cuantificación del período medio y SEM de las oscilaciones del informador comparando muestras arrastradas con pulsos DMSO y DAPT. (Figura adaptada de Sonnenet al., 201810. Reimpreso y modificado de Cell según Creative Commons Atribución CC BY-NC-ND 4.0.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Problema | Solución(es) sugerida(s) |
| El PDMS no se adhiere al vidrio. | - Asegúrese de que tanto el PDMS como el vidrio estén limpios. |
| - Asegúrese de que haya suficiente PDMS alrededor de la cámara para la unión. | |
| - Optimizar los ajustes del horno de plasma. | |
| Hay burbujas de aire en mi chip. | - Compruebe si la bomba estaba encendida. |
| - Desgasificar el chip antes de cargar el tejido en el chip. | |
| - Desgasificar el medio antes del inicio del experimento. | |
| - Asegúrese de que la humedad en la cámara de incubación sea lo suficientemente alta. | |
| El tejido muere al comienzo del experimento. | - Añadir HEPES al medio al cargar y montar el chip. |
| - No enjuague el tejido dentro y fuera con demasiada frecuencia durante la carga. | |
| - Compruebe que el caudal no es demasiado alto. | |
| El tejido muere durante la toma de imágenes. | - Asegúrese de que no haya fototoxicidad de la imagen |
| - Asegúrese de que no haya contaminación. | |
| - El caudal no debe ser demasiado alto. | |
| El enfoque cambia durante la toma de imágenes. | - Utilice el enfoque automático durante la toma de imágenes para ajustar la deriva de la diapositiva de imagen. |
| - Deje que el chip se equilibre a la temperatura dentro del microscopio durante al menos 30 minutos. | |
| Tomacorrientes/entradas se desprenden. | - Empuje todos los tubos completamente hacia abajo hasta el fondo. |
| El vaso del chip se rompe. | - Ten más cuidado, el cristal es muy frágil. |
| - El vidrio delgado solo es necesario para la obtención de imágenes. Si no se realizan imágenes, se puede usar un portaobjetos de vidrio normal más grueso. | |
| - Si la rotura está fuera del chip, puede que no sea un problema. Si el sello de vidrio del chip se rompe, el líquido se filtrará y entrará aire. | |
| Hay una contaminación en mi chip. | - Añadir antibióticos al medio de cultivo. |
| - Esterilizar todo el equipo y tubería. | |
| - Trabajar rápido y limpio. |
Tabla 1: Solución de problemas
Expediente complementario 1: Archivo STL para imprimir un molde con una impresora 3D. Este molde se utiliza para generar un chip microfluídico para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior (diseño que se muestra en la Figura 1). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Expediente Complementario 2: Archivo STL para imprimir un molde con una impresora 3D para generar un chip microfluídico para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior. A diferencia del Archivo Suplementario 1 y el diseño que se muestra en la Figura 1, este diseño contiene trampas de burbujas en todas las entradas para evitar que pequeñas cantidades de aire entren en la cámara microfluídica principal. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Expediente complementario 3: Archivo de diseño para la generación de un soporte para colocar el chip en el microscopio. Este soporte tiene las dimensiones de una placa de 96 pocillos y debe caber en los soportes estándar de la mayoría de los microscopios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Cómo la dinámica de señalización controla los sistemas multicelulares ha sido una pregunta de larga data en el campo. La investigación funcional plantea un desafío clave, porque estas dinámicas tienen que ser sutilmente moduladas para permitir esto11. Este control temporal sobre las perturbaciones de la vía puede lograrse, en principio, con la optogenética, que también permite un alto control espacial34. Sin embargo, la optogenética requiere el establecimiento de herramientas genéticas sofisticadas para el análisis de cada vía de señalización en cuestión. El protocolo actual descrito aquí proporciona una herramienta altamente versátil para la perturbación de cualquier vía de señalización. El experimento de microfluídica permite la aplicación de pulsos de fármacos controlados temporalmente para investigar funcionalmente la dinámica de las vías de señalización en cultivos de tejidos. Aquí, la atención se centra en el estudio de la somitogénesis en cultivos ex vivo , pero el protocolo se puede adaptar para adaptarse a cualquier otro sistema modelo.
Ciertos pasos en el protocolo son críticos para realizar un experimento de microfluídica exitoso (resumido en la Tabla 1). Los puntos clave se discuten de la siguiente manera. Debido al flujo medio durante el curso del experimento, el cultivo de tejidos experimenta estrés cortante. La exposición del sistema modelo al flujo continuo puede causar estrés celular y, en casos extremos, la muerte celular debido al efecto de cizallamiento. Para los cultivos de tejidos ex vivo de tailbuds de ratón y el diseño actual del chip, se encontró que un caudal de 60 μL / h (máximo de 100 μL / h) funciona bien con un efecto de cizallamiento mínimo. Cuando se encienden varias bombas simultáneamente para el mismo chip, el caudal de las bombas individuales debe ajustarse en consecuencia para no causar un aumento en el caudal total. Cuando el protocolo actual se adapta a otros sistemas de modelos y diseños de chips, se debe optimizar el caudal. Alternativamente, es posible no enjuagar el medio continuamente, sino cambiar periódicamente el medio en el chip35. Dicha configuración también se puede aplicar para controlar las oscilaciones de señalización en la somitogénesis del ratón (datos no publicados, no mostrados). Además, también se puede imaginar una configuración, en la que los cultivos de tejidos no están expuestos al flujo directo de fluidos, sino que los medicamentos llegan al tejido por difusión desde un canal vecino. Dichos sistemas se han utilizado con éxito para aplicar gradientes de factores de crecimiento a modelos in vitro de diferenciación ESC14,36.
Un problema importante de los experimentos microfluídicos es la aparición de burbujas de aire en el chip durante el experimento. Las burbujas de aire dentro del chip o tubo pueden interferir con el flujo uniforme de líquido en el chip y pueden conducir a la eliminación del cultivo de embriones de su ubicación. Para evitar la presencia de burbujas de aire, varios pasos del protocolo son indispensables. En primer lugar, el medio de cultivo dentro de las jeringas y el propio chip microfluídico debe desgasificarse utilizando un desecador (paso 3.1.3). En segundo lugar, al cargar muestras en las entradas de carga, se debe tener cuidado de no canalizar aire en el chip junto con la muestra (paso 3.2.3). En tercer lugar, al llenar el tubo con medio, todas las burbujas de aire deben bombearse antes de conectar el chip (paso 3.3.2). De lo contrario, estas burbujas serán empujadas hacia el chip principal durante el experimento. Por último, durante el experimento, el medio se equilibra dentro de la cámara de imágenes o incubadora debido al tubo semipermeable. La permeabilidad del tubo también permite la evaporación del medio, así que asegúrese de que la humedad esté regulada durante el experimento para evitar la formación de nuevas burbujas en el tubo.
En general, la microfluídica es una herramienta muy versátil que se puede adaptar a la pregunta específica del investigador. El enfoque de diseño actual permite obtener imágenes de hasta 12 cultivos ex vivo en paralelo por chip. Este número está limitado principalmente por el número de embriones por experimento y el tiempo que se tarda en obtener imágenes de cada cultivo de embriones con suficiente resolución. Si es necesario comparar varias condiciones en un solo experimento, se pueden montar varios chips en un solo portaobjetos de vidrio. Se proporciona un diseño de chip, que es ideal para la obtención de imágenes de múltiples explantes de tejido en paralelo, pero los diseños personalizados pueden superar las limitaciones en el número de muestras para permitir un análisis de alto rendimiento y aumentar la combinación de más condiciones dentro de un solo experimento16,17. La microfluídica se limita a modelos que se pueden cultivar en un chip y la cultura en chip tendrá que optimizarse para cada sistema modelo individualmente27,37,38.
En los últimos 5-10 años, la microfluídica se ha aplicado para abordar diversas cuestiones biológicas debido a su potencial para enfoques de alto rendimiento y modulaciones sutiles de la dinámica y los gradientes de señalización. Hoy en día, la microfluídica se ha convertido en una herramienta fácilmente aplicable, barata y versátil que los laboratorios pueden establecer con facilidad. Aquí, el protocolo actual está optimizado para una aplicación específica, a saber, estudiar la dinámica de señalización que gobierna la somitogénesis. Es sencillo adaptar este protocolo y diseño para adaptarse a las preguntas de investigación individuales en biología de tejidos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Yang Li y Jos Malda de la UMC Utrecht por su ayuda con la impresión 3D de moldes, a Karen van den Anker del grupo Sonnen por sus comentarios muy útiles sobre el protocolo y a Tjeerd Faase del taller mecánico del Instituto Hubrecht para el soporte de chips microfluídicos dentro del microscopio. Nos gustaría agradecer a todo el grupo sonnen por la lectura crítica del manuscrito y a los revisores por sus comentarios constructivos. Este trabajo recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud de un acuerdo de subvención inicial del CEI n.º 850554 a K.F.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
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