En protokol til dyrkning og manipulation af museembryonsk væv på en mikrofluidisk chip er tilvejebragt. Ved at anvende impulser af vejmodulatorer kan dette system bruges til eksternt at styre signalsvingninger til funktionel undersøgelse af museositogenese.
Periodisk segmentering af den præsomitiske mesoderm af et udviklende museembryo styres af et netværk af signalveje. Signalsvingninger og gradienter menes at kontrollere henholdsvis timing og afstand mellem segmentdannelse. Mens de involverede signalveje er blevet undersøgt grundigt i løbet af de sidste årtier, har der manglet direkte beviser for funktionen af signalsvingninger til styring af somitogenese. For at muliggøre en funktionel undersøgelse af signaldynamikken er mikrofluidik et tidligere etableret værktøj til subtil modulering af disse dynamikker. Med denne mikrofluidikbaserede indsugningsmetode synkroniseres endogene signalsvingninger af impulser af vejmodulatorer. Dette muliggør modulering af f.eks. svingningsperioden eller faseforholdet mellem to oscillerende veje. Desuden kan rumlige gradienter af vejmodulatorer etableres langs vævet for at studere, hvordan specifikke ændringer i signalgradienterne påvirker somitogenese.
Den nuværende protokol er beregnet til at hjælpe med at etablere mikrofluidiske tilgange for de første gangs brugere af mikrofluidik. De grundlæggende principper og udstyr, der er nødvendige for at oprette et mikrofluidisk system, beskrives, og der leveres et chipdesign, hvormed en form til chipgenerering bekvemt kan fremstilles ved hjælp af en 3D-printer. Endelig diskuteres, hvordan man dyrker primært musevæv på en mikrofluidisk chip, og hvordan man indkapsler signalsvingninger til eksterne impulser af vejmodulatorer.
Dette mikrofluidiske system kan også tilpasses til at huse andre in vivo- og in vitro-modelsystemer såsom gastruloider og organoider til funktionel undersøgelse af signaldynamik og morfogengradienter i andre sammenhænge.
Udviklingen styres af intercellulær kommunikation via signalveje. Der er kun et begrænset antal signalveje, der orkestrerer den komplekse dannelse af væv og korrekt celledifferentiering i rum og tid. For at regulere denne mangfoldighed af processer kan information kodes i dynamikken i en signalvej, ændringen af en vej over tid, såsom frekvensen eller varigheden af et signal1,2.
Under somitogenese segmenteres somitisk væv periodisk fra den præsomitiske mesoderm (PSM)3. PSM er rumligt organiseret efter gradienter af Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) og Retinsyresignalering. I forreste PSM på bestemmelsesfronten, hvor Wnt- og FGF-signaler er lave, grundes cellerne til differentiering i somitter. Differentiering opstår, når en bølge af transkriptionel aktivering når denne bestemmelsesfront. Inden for PSM, Wnt, FGF og Notch signalering svinger. Naboceller svinger lidt ud af fase, hvilket resulterer i bølger af oscillerende transkriptionel aktivering nedstrøms for Wnt-, FGF- og Notch-stierne, der rejser fra bageste til forreste PSM. I museembryoner når en transkriptionsbølge bestemmelsesfronten ca. hver 2. time og initierer somitdannelse. At studere somitogenese ved at forstyrre eller aktivere signalveje kan illustrere vigtigheden af disse veje4,5,6,7,8,9. For at kunne undersøge funktionen af signaldynamik i styringen af cellulær adfærd er det imidlertid vigtigt at subtilt modulere signalveje i stedet for permanent at aktivere eller hæmme dem.
For tidsmæssigt at modulere signalvejsaktivitet inden for det segmenterende museembryo har Sonnen et al. udviklet et mikrofluidisk system10. Dette system muliggør en stram kontrol af væskestrømme inden for mikrokanaler af en chip, der indeholder den biologiske prøve11. For at studere vigtigheden af signaldynamik for korrekt segmentering af PSM bruges denne mikrofluidikopsætning til at modulere signaldynamikken i musens segmenteringsur ex vivo. Ved sekventielt pulserende pathway aktivatorer eller hæmmere ind i kulturkammeret opnås ekstern kontrol af dynamikken i Wnt, FGF og Notch signalering10. For eksempel er det muligt at ændre perioden for individuelle veje og faseforholdet mellem flere oscillerende signalveje. Ved hjælp af samtidig realtidsbilleddannelse af dynamiske signalindmeldere kan effekten af indlejring på selve stierne, på differentiering og somitisk dannelse analyseres. Ved hjælp af dette niveau af kontrol over signaldynamikken blev betydningen af faseforholdet mellem Wnt- og Notch-signalveje under somitogenese fremhævet10.
Personlige chipdesign giver mulighed for en overflod af muligheder for spatiotemporale forstyrrelser i det lokale miljø, f.eks. Stabil gradientdannelse12,13,14,15, pulserende aktivering/hæmning10,16,17,18 eller lokaliserede forstyrrelser19,20 . Mikrofluidik kan også muliggøre en mere reproducerbar udlæsning og højere gennemstrømning på grund af automatisering af eksperimentel håndtering21,22,23. Den nuværende protokol er beregnet til at bringe mikrofluidik og indlejring af endogene signalsvingninger i væv til hvert standard biovidenskabeligt laboratorium. Selv i mangel af sofistikeret udstyr til chipgenerering, såsom renrum og udstyr til blød litografi, kan mikrofluidiske chips fremstilles og bruges til at løse biologiske spørgsmål. Forme kan designes ved hjælp af frit tilgængelig COMPUTERSTØTTET DESIGN (CAD) SOFTWARE. En form til generering af mikrofluidiske chips, der normalt består af polydimethylsiloxan (PDMS), kan udskrives med en 3D-printer eller bestilles fra trykkerier. På denne måde kan mikrofluidiske chips produceres inden for en dag uden krav om dyrt udstyr24. Her er der tilvejebragt et chipdesign, hvormed en form til indlejring af musesegmenteringsuret i todimensionelle (2D) ex vivo-kulturer25 kan udskrives med en 3D-printer.
On-chip-kulturer og præcise forstyrrelser, muliggjort af mikrofluidik, har et enestående potentiale i at optrævle de molekylære mekanismer for, hvordan signalveje styrer flercellet adfærd. Signaldynamik og morfogengradienter er nødvendige for mange processer under udvikling. Tidligere havde laboratorier dyrket celler, væv og hele organismer i mikrofluidiske chips, og protokoller til spatiotemporal forstyrrelse af primært 2D-cellekultur leveres andre steder12,26,27,28,29. Anvendelse af mikrofluidik til at modulere lokale miljøer i multicellulære systemer åbner nye perspektiver for høj gennemstrømning og præcise spatiotemporale forstyrrelser. Området for mikrofluidik har nu nået et punkt, hvor det er blevet et ikke-specialiseret, billigt og let anvendeligt værktøj for udviklingsbiologer.
Her tilvejebringes en protokol til indlejring af musesegmenteringsuret til impulser af en Notch-signalhæmmer. Et sådant eksperiment består af følgende trin: (1) generering af mikrofluidisk chip, (2) fremstilling af slanger og belægning af chippen og (3) selve det mikrofluidiske eksperiment (figur 1A). Forskning, der involverer hvirveldyrs modelsystemer, kræver forudgående etisk godkendelse fra det ansvarlige udvalg.
Hvordan signaldynamik styrer flercellede systemer har været et langvarigt spørgsmål på området. Funktionel undersøgelse udgør en central udfordring, fordi disse dynamikker skal moduleres subtilt for at muliggøre dette11. En sådan tidsmæssig kontrol over vejforstyrrelser kan i princippet opnås med optogenetik, hvilket også muliggør en høj rumlig kontrol34. Optogenetik kræver imidlertid, at der etableres sofistikerede genetiske værktøjer til analyse af hver enkelt signalvej. Den nuværende protokol, der er beskrevet her, giver et meget alsidigt værktøj til forstyrrelse af enhver signalvej. Mikrofluidikeksperimentet gør det muligt at anvende tidsmæssigt kontrollerede lægemiddelimpulser til funktionelt at undersøge dynamikken i signalveje i vævskulturer. Her er fokus på studiet af somitogenese i ex vivo-kulturer , men protokollen kan tilpasses, så den passer til alle andre modelsystemer.
Visse trin i protokollen er afgørende for at udføre et vellykket mikrofluidikeksperiment (opsummeret i tabel 1). Nøglepunkter diskuteres som følger. På grund af medium flow i løbet af eksperimentet oplever vævskulturen forskydningsstress. Eksponering af modelsystemet for kontinuerlig strømning kan forårsage cellestress og i ekstreme tilfælde celledød på grund af forskydningseffekt. For ex vivo-vævskulturer af musehaleknopper og det nuværende chipdesign viste det sig, at en strømningshastighed på 60 μL/h (højst 100 μL/h) fungerede godt med minimal forskydningseffekt. Når flere pumper tændes samtidigt for den samme chip, skal strømningshastigheden for de enkelte pumper justeres i overensstemmelse hermed for ikke at forårsage en stigning i den samlede strømningshastighed. Når den nuværende protokol er tilpasset andre modelsystemer og chipdesign, skal strømningshastigheden optimeres. Alternativt er det muligt ikke at skylle medium kontinuerligt, men med jævne mellemrum skifte medium på chippen35. En sådan opsætning kan også anvendes til at styre signalsvingninger i musesomiogenese (ikke offentliggjort, data ikke vist). Desuden kan man også forestille sig en opsætning, hvor vævskulturer ikke udsættes for direkte væskestrøm, men lægemidler når vævet ved diffusion fra en nabokanal. Sådanne systemer er blevet anvendt med succes til at anvende gradienter af vækstfaktorer på in vitro-modeller for ESC-differentiering14,36.
Et stort problem med mikrofluidiske eksperimenter er forekomsten af luftbobler på chip under eksperimentet. Luftbobler i chippen eller slangen kan forstyrre ensartet væskestrøm på chippen og kan føre til fjernelse af embryokulturen fra dens placering. For at forhindre tilstedeværelsen af luftbobler er forskellige trin i protokollen uundværlige. For det første skal dyrkningsmediet i sprøjterne og selve mikrofluidchippen afgasses ved hjælp af en ekssikkator (trin 3.1.3). For det andet skal man, når man lægger prøver i lasteindløbene, være forsigtig med ikke at pipetere luft ind i spånen sammen med prøven (trin 3.2.3). For det tredje, når slangen fyldes med medium, skal alle luftbobler pumpes ud, inden chippen fastgøres (trin 3.3.2). Ellers vil disse bobler blive skubbet ind i hovedchippen under eksperimentet. Endelig er mediet under eksperimentet ligestillet i billeddannelseskammeret eller inkubatoren på grund af den semipermeable slange. Slangens permeabilitet muliggør også fordampning af mediet, så sørg for, at fugtigheden reguleres under eksperimentet for at forhindre dannelse af nye bobler i slangen.
Generelt er mikrofluidik et meget alsidigt værktøj, der kan tilpasses forskerens specifikke spørgsmål. Den nuværende designtilgang giver mulighed for at afbilde op til 12 ex vivo-kulturer parallelt pr. Chip. Dette antal er hovedsageligt begrænset af antallet af embryoner pr. forsøg og den tid, det tager at afbilde hver embryokultur med tilstrækkelig opløsning. Hvis flere betingelser skal sammenlignes i et enkelt eksperiment, kan flere chips monteres på et enkelt glasglas. Der leveres et chipdesign, som er ideelt til billeddannelse af flere vævseksplanter parallelt, men personlige designs kan overvinde begrænsninger i prøveantal for at muliggøre analyse med høj gennemstrømning og øge kombinationen af flere betingelser inden for et enkelt eksperiment16,17. Mikrofluidik er begrænset til modeller, der kan dyrkes på en chip, og on-chip-kulturen skal optimeres for hvert modelsystem individuelt27,37,38.
I løbet af de sidste 5-10 år er mikrofluidik blevet anvendt til at løse forskellige biologiske spørgsmål på grund af dets potentiale for tilgange med høj gennemstrømning og subtile moduleringer af signaldynamik og gradienter. I dag er mikrofluidik blevet et let anvendeligt, billigt og alsidigt værktøj, som laboratorier let kan etablere. Her er den nuværende protokol optimeret til en bestemt applikation, nemlig at studere signaldynamik, der styrer somitogenese. Det er ligetil at tilpasse denne protokol og design, så den passer til individuelle forskningsspørgsmål inden for vævsbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Yang Li og Jos Malda fra UMC Utrecht for hjælp til 3D-udskrivning af forme, Karen van den Anker fra Sonnen-gruppen for meget nyttig feedback på protokollen og Tjeerd Faase fra det mekaniske værksted på Hubrecht Institute for indehaveren af mikrofluidiske chips i mikroskopet. Vi vil gerne takke hele Sonnen-gruppen for kritisk læsning af manuskriptet og korrekturlæserne for deres konstruktive feedback. Dette arbejde modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd i henhold til en EFR-startbevillingsaftale nr. 850554 til K.F.S.
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |