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Developmental Biology

सिगनलिंग दोलनों की कार्यात्मक जांच के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक्स दृष्टिकोण जो सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करता है

Published: March 19, 2021 doi: 10.3791/62318
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht
* These authors contributed equally

Summary

माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर माउस भ्रूण ऊतक की संस्कृति और हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। पाथवे मॉड्यूलेटर की दालों को लागू करके, इस प्रणाली का उपयोग माउस सोमिटोजेनेसिस की कार्यात्मक जांच के लिए सिग्नलिंग दोलनों को बाहरी रूप से नियंत्रित करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

एक विकासशील माउस भ्रूण के प्रीसोमिटिक मेसोडर्म का आवधिक विभाजन सिग्नलिंग मार्गों के एक नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है। सिग्नलिंग दोलनों और ग्रेडिएंट को क्रमशः खंड गठन के समय और रिक्ति को नियंत्रित करने के लिए सोचा जाता है। जबकि शामिल सिग्नलिंग मार्गों का पिछले दशकों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करने में सिग्नलिंग दोलनों के कार्य के लिए प्रत्यक्ष सबूत की कमी है। सिग्नलिंग गतिशीलता की कार्यात्मक जांच को सक्षम करने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक्स इन गतिशीलता के सूक्ष्म मॉडुलन के लिए पहले से स्थापित उपकरण है। इस माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित entrainment दृष्टिकोण के साथ अंतर्जात सिग्नलिंग दोलनों मार्ग modulators की दालों द्वारा सिंक्रनाइज़ कर रहे हैं। यह उदाहरण के लिए, दोलन अवधि या दो दोलन मार्गों के बीच चरण-संबंध के मॉडुलन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, मार्ग मॉड्यूलेटर के स्थानिक ग्रेडिएंट को ऊतक के साथ स्थापित किया जा सकता है ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि सिग्नलिंग ग्रेडिएंट में विशिष्ट परिवर्तन सोमिटोजेनेसिस को कैसे प्रभावित करते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक्स के पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण स्थापित करने में मदद करने के लिए है। माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम स्थापित करने के लिए आवश्यक बुनियादी सिद्धांतों और उपकरणों का वर्णन किया गया है, और एक चिप डिजाइन प्रदान किया जाता है, जिसके साथ चिप पीढ़ी के लिए एक मोल्ड आसानी से 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। अंत में, माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर प्राथमिक माउस ऊतक को कैसे संस्कृति करें और मार्ग मॉड्यूलेटर के बाहरी दालों के लिए सिग्नलिंग दोलनों को कैसे प्रशिक्षित करें, इस पर चर्चा की जाती है।

इस माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली को अन्य संदर्भों में सिग्नलिंग गतिशीलता और मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट की कार्यात्मक जांच के लिए गैस्ट्रुलॉइड्स और ऑर्गेनोइड्स जैसे विवो और इन विट्रो मॉडल सिस्टम में अन्य बंदरगाह के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

विकास सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से अंतरकोशिकीय संचार द्वारा नियंत्रित किया जाता है। केवल सीमित संख्या में सिग्नलिंग मार्ग हैं जो ऊतकों के जटिल गठन और अंतरिक्ष और समय में उचित सेल भेदभाव का आयोजन करते हैं। प्रक्रियाओं की इस भीड़ को विनियमित करने के लिए, जानकारी को सिग्नलिंग मार्ग की गतिशीलता में एन्कोड किया जा सकता है, समय के साथ एक मार्ग का परिवर्तन, जैसे कि सिग्नल 1,2 की आवृत्ति या अवधि।

सोमिटोजेनेसिस के दौरान, सोमिटिक ऊतक को समय-समय पर प्रीसोमिटिक मेसोडर्म (पीएसएम) 3 से विभाजित किया जाता है। PSM स्थानिक रूप से WNT, Fibroblast विकास कारक (FGF), और रेटिनोइक एसिड सिग्नलिंग के gradients द्वारा आयोजित किया जाता है। निर्धारण के मोर्चे पर पूर्वकाल पीएसएम में, जहां WNT और FGF संकेत कम होते हैं, कोशिकाओं को सोमाइट्स में भेदभाव के लिए प्राइम किया जाता है। भेदभाव तब होता है जब ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण की एक लहर इस निर्धारण मोर्चे तक पहुंचती है। PSM के भीतर, WNT, FGF, और पायदान सिग्नलिंग दोलन. पड़ोसी कोशिकाएं चरण से थोड़ा बाहर दोलन करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप डब्ल्यूएनटी, एफजीएफ और नॉच मार्गों के डाउनस्ट्रीम में ऑसिलेटरी ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण की तरंगें होती हैं जो पीछे से पूर्वकाल पीएसएम तक यात्रा करती हैं। माउस भ्रूण में, एक ट्रांसक्रिप्शनल तरंग लगभग हर 2 घंटे में निर्धारण मोर्चे तक पहुंचती है और सोमाइट गठन शुरू करती है। सिग्नलिंग मार्गों को परेशान या सक्रिय करके सोमिटोजेनेसिस का अध्ययन करना इन मार्गों के महत्व को स्पष्ट कर सकता है4,5,6,7,8,9। हालांकि, सेलुलर व्यवहार के नियंत्रण में सिग्नलिंग गतिशीलता के कार्य की जांच करने में सक्षम होने के लिए, स्थायी रूप से सक्रिय करने या उन्हें बाधित करने के बजाय सिग्नलिंग मार्गों को सूक्ष्म रूप से संशोधित करना आवश्यक है।

अस्थायी रूप से माउस भ्रूण को विभाजित करने के भीतर सिग्नलिंग मार्ग गतिविधि को संशोधित करने के लिए, Sonnen et al. ने एक माइक्रोफ्लुइडिक system10 विकसित किया है। यह प्रणाली एक चिप के माइक्रोचैनल के भीतर तरल पदार्थ के प्रवाह के तंग नियंत्रण की अनुमति देती है जिसमें जैविक नमूना 11 होता है। PSM के उचित विभाजन के लिए सिग्नलिंग गतिशीलता के महत्व का अध्ययन करने के लिए, इस माइक्रोफ्लुइडिक्स सेटअप का उपयोग माउस विभाजन घड़ी पूर्व विवो की सिग्नलिंग गतिशीलता को संशोधित करने के लिए किया जाता है। संस्कृति कक्ष में क्रमिक रूप से मार्ग उत्प्रेरक या अवरोधकों को स्पंदित करके, WNT, FGF, और Notch सिग्नलिंग की गतिशीलता का बाहरी नियंत्रण प्राप्त किया जाता है10। उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत मार्गों की अवधि और कई ऑस्सिलेटरी सिग्नलिंग मार्गों के बीच चरण संबंध को संशोधित करना संभव है। गतिशील सिग्नलिंग रिपोर्टरों के सहवर्ती वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग करते हुए, भेदभाव और सोमाइट गठन पर स्वयं मार्गों पर एनट्रेनमेंट के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सकता है। सिग्नलिंग गतिशीलता पर नियंत्रण के इस स्तर का उपयोग करते हुए, सोमिटोजेनेसिस के दौरान WNT- और Notch-सिग्नलिंग मार्गों के बीच चरण संबंध के महत्व को उजागर किया गया था10।

व्यक्तिगत चिप डिजाइन स्थानीय वातावरण के भीतर spatiotemporal perturbations के लिए विकल्पों की एक बहुतायत के लिए अनुमति देते हैं, उदाहरण के लिए, स्थिर ढाल गठन12,13,14,15, pulsatile सक्रियण / निषेध10,16,17,18 या स्थानीयकृत गड़बड़ी19,20 . माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोगात्मक हैंडलिंग 21,22,23 के स्वचालन के कारण एक अधिक पुनरुत्पादक रीड-आउट और उच्च थ्रूपुट को भी सक्षम कर सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक्स और ऊतकों के भीतर अंतर्जात सिग्नलिंग दोलनों को हर मानक जीवन विज्ञान प्रयोगशाला में लाने के लिए है। यहां तक कि चिप पीढ़ी के लिए परिष्कृत उपकरणों की अनुपस्थिति में, जैसे कि नरम-लिथोग्राफी के लिए स्वच्छ कमरा और उपकरण, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स का निर्माण किया जा सकता है और जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। मोल्ड्स को स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डिज़ाइन किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स की पीढ़ी के लिए एक मोल्ड, जिसमें आमतौर पर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) होता है, को 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित किया जा सकता है, या मुद्रण कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है। इस तरह, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स महंगे उपकरणों की आवश्यकता के बिना एक दिन के भीतर उत्पादित किया जा सकता है24। यहां, एक चिप डिज़ाइन प्रदान किया जाता है, जिसके साथ दो-आयामी (2 डी) पूर्व विवो संस्कृतियों 25 में माउस विभाजन घड़ी के प्रवेश के लिए एक मोल्ड को 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित किया जा सकता है।

ऑन-चिप संस्कृतियों और सटीक गड़बड़ी, माइक्रोफ्लुइडिक्स द्वारा सक्षम, आणविक तंत्र को उजागर करने में उत्कृष्ट क्षमता रखते हैं कि सिग्नलिंग मार्ग बहुकोशिकीय व्यवहार को कैसे नियंत्रित करते हैं। विकास में कई प्रक्रियाओं के लिए सिग्नलिंग गतिशीलता और मॉर्फोजेन ग्रेडिएंट की आवश्यकता होती है। इससे पहले, प्रयोगशालाओं में माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में सुसंस्कृत कोशिकाएं, ऊतक और पूरे जीव थे और मुख्य रूप से 2 डी सेल संस्कृति के स्पैटिओटेम्पोरल गड़बड़ी के लिए प्रोटोकॉल कहीं और प्रदान किए जाते हैं12,26,27,28,29। बहुकोशिकीय प्रणालियों में स्थानीय वातावरण को संशोधित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स को लागू करने से उच्च-थ्रूपुट और सटीक स्पैटिओटेम्पोरल गड़बड़ी के लिए नए दृष्टिकोण खुलते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक्स का क्षेत्र अब एक बिंदु पर पहुंच गया है कि यह विकासात्मक जीवविज्ञानियों के लिए एक गैर-विशेषज्ञ, सस्ती और आसानी से लागू उपकरण बन गया है।

यहां, एक पायदान सिग्नलिंग अवरोधक की दालों के लिए माउस विभाजन घड़ी के entrainment के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। इस तरह के प्रयोग में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) माइक्रोफ्लुइडिक चिप की पीढ़ी, (2) चिप के टयूबिंग और कोटिंग की तैयारी, और (3) माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग स्वयं (चित्रा 1 ए)। कशेरुक मॉडल प्रणालियों को शामिल करने वाले अनुसंधान के लिए जिम्मेदार समिति से पूर्व नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता होती है।

Protocol

यहां प्रस्तुत शोध को EMBL नैतिकता समिति 10 और पशु अनुसंधान के लिए डच समिति (dierenexperimentencommissie, DEC) द्वारा अनुमोदित किया गया है, और पशु देखभाल के लिए Hubrecht दिशानिर्देशों का पालन करता है।

तरल PDMS के साथ काम करते समय दस्ताने पहनें। कवर सतहों और उपकरणों. किसी भी स्पिल को तुरंत हटा दें, क्योंकि एक बार सख्त होने के बाद सफाई मुश्किल हो जाती है।

1. चिप की पीढ़ी

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स एक मोल्ड में PDMS (Polydimethylsiloxane) कास्टिंग द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। Molds सीएडी सॉफ्टवेयर (जैसे, uFlow या 3DμF30) का उपयोग करके डिजाइन किया जा सकता है। मुक्त डिजाइन का एक भंडार एमआईटी (Metafluidics.org) द्वारा प्रदान किया जाता है। मोल्ड्स या तो 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित होते हैं या एक फोटोमास्क का उपयोग करके नरम लिथोग्राफी द्वारा उत्पन्न किए जा सकते हैं जिसमें वांछित डिजाइन होता है (आगे की जानकारी के लिए देखें, उदाहरण के लिए, किन एट अल। यहां, एक मोल्ड के लिए एक डिजाइन प्रदान किया गया है जिसे माउस भ्रूण ऊतक (चित्रा 1 बी, सी, पूरक फाइल1 और 2) की ऑन-चिप संस्कृति के लिए 3 डी प्रिंटर के साथ मुद्रित किया जा सकता है। कम रिज़ॉल्यूशन 3D प्रिंटर के साथ मुद्रण की अनुमति देने के लिए, डिज़ाइन को पहले प्रकाशित one10 की तुलना में संशोधित किया गया है. हवा बुलबुला जाल के बिना एक मोल्ड और हवा बुलबुला जाल के साथ एक प्रदान की जाती है (अनुपूरक फ़ाइलें 1 और 2, क्रमशः)। चूंकि मुद्रण की प्रक्रिया उपलब्ध प्रिंटर पर निर्भर है, इसलिए मुद्रण के लिए विवरण का वर्णन नहीं किया जाएगा. हालांकि, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी अनपॉलिमराइज्ड राल पूरी तरह से हटा दिया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के भीतर छोटे <200 μm छेद से unpolymerized राल को हटाने के लिए अक्सर सॉल्वैंट्स के साथ अतिरिक्त धोने की आवश्यकता होती है। ये छेद प्रयोग के दौरान चिप के भीतर भ्रूण ऊतक को फंसाने के लिए पीडीएमएस स्तंभों का निर्माण करेंगे। पीडीएमएस का उपयोग आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स के लिए किया जाता है, क्योंकि यह सस्ता, बायोकंपैटिबल और पारदर्शी है, और इसमें कम ऑटोफ्लोरेसेंस है। इलाज के बाद, पीडीएमएस चिप को मोल्ड से काट दिया जाता है और एक ग्लास स्लाइड पर बंधुआ किया जाता है। ग्लास और पीडीएमएस चिप दोनों का प्लाज्मा उपचार सतहों को सक्रिय करता है और संपर्क में लाए जाने पर सहसंयोजक बांड के गठन की अनुमति देता है।

  1. पोलीमराइजेशन को प्रेरित करने के लिए 9: 1 अनुपात (डब्ल्यू: डब्ल्यू) में उत्प्रेरक के साथ मोनोमर को मिलाकर पीडीएमएस की आवश्यक मात्रा तैयार करें। मिश्रण करने के लिए डिस्पोजेबल उपकरणों का उपयोग करें, जैसे कि प्लास्टिक के कप और कांटे। सुनिश्चित करें कि मिश्रण ठीक से प्राप्त किया गया है।
  2. पीडीएमएस मिश्रण को एक डेसिकेटर में रखें और पीडीएमएस मिश्रण से हवा को हटाने के लिए लगभग 30 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें। desiccator के भीतर वैक्यूम के कारण, हवा PDMS मिश्रण से हटा दिया जाएगा।
    नोट: यदि PDMS पर प्रवाहित होता है तो ऊतकों के साथ desiccator के अंदर को कवर करें।
  3. चिप मोल्ड में पीडीएमएस मिश्रण डालें (लगभग 3-5 मिमी की पीडीएमएस परत पर्याप्त है)।
  4. PDMS से भरे मोल्ड को वापस desiccator में रखें और किसी भी शेष बुलबुले को हटाने के लिए वैक्यूम लागू करें। सुनिश्चित करें कि मोल्ड की सभी छोटी संरचनाओं से हवा को हटा दिया गया है।
  5. मोल्ड को 65 डिग्री सेल्सियस (या मोल्ड सामग्री के आधार पर कम) ओवन में रात भर रखकर ठीक करें। एक स्केलपेल का उपयोग करके चिप को मोल्ड से बाहर काटें। बाद में बंधन के लिए अनुमति देने के लिए डिजाइन के चारों ओर पर्याप्त स्थान (1-2 सेमी) के साथ मोल्ड से कठोर पीडीएमएस को काटें। इसे बाहर निकालते समय चिप को तोड़ने से रोकने के लिए पीडीएमएस को पूरी तरह से काटना सुनिश्चित करें। पीडीएमएस चिप को सावधानीसे उठाएं, पहले स्केलपेल के कुंद अंत के साथ, और जब संभव हो, तो हाथों से।
  6. पंच इनलेट और आउटलेट छेद, एक 1 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के अंदर से शुरू होता है।
  7. संपीड़ित हवा के साथ संक्षेप में पीडीएमएस चिप को साफ करें और पीडीएमएस और धूल के किसी भी फंसे हुए बिट्स को हटाने के लिए दोनों पक्षों पर चिपकने वाला टेप चिपकाएं और आगे के उपयोग तक इसे साफ रखें।
    नोट: चिप को आगे के उपयोग तक इस तरह रखा जा सकता है।
  8. संपीड़ित हवा के साथ कांच की स्लाइड को साफ करें। सावधान रहें कि यह टूट न जाए। PDMS चिप से चिपकने वाला टेप निकालें।
  9. एक प्लाज्मा ओवन का उपयोग कर कांच की स्लाइड के लिए चिप बांड. निम्नलिखित निर्देशों को हवा प्लाज्मा के लिए अनुकूलित किया जाता है।
    नोट: प्रयोगशाला के प्लाज्मा ओवन के मैनुअल से परामर्श करें और विशिष्ट प्रयोग के लिए प्रक्रिया का अनुकूलन करें।
    1. चिप और ग्लास स्लाइड को प्लाज्मा ओवन में रखें, जिसमें पक्षों का सामना करना पड़ रहा है।
    2. ढक्कन को प्लाज्मा ओवन पर रखें और वैक्यूम लागू करते समय इसे जगह में रखें और वैक्यूम स्थापित होने तक प्रतीक्षा करें।
    3. गैस बटन दबाकर गैस को चालू करें और लगभग 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें (दबाव लगभग 0.37 mbar पर होना चाहिए)।
    4. जेनरेटर (पावर: 9.0, समय: 1 मिनट) दबाकर प्लाज्मा उत्पन्न करें।
    5. समाप्त होने पर, पंप और गैस को बंद कर दें; हवादार और दरवाजा खोलें।
    6. सक्रिय सतहों को एक-दूसरे पर रखकर और समान रूप से दबाव लागू करके चिप को कांच पर बांधें। सावधान रहें कि कांच टूट न जाए।
      नोट: एक पानी परीक्षण की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि प्लाज्मा उपचार ने काम किया है। कांच की सतह पर पानी की एक बूंद रखें। यदि प्लाज्मा उपचार ने काम किया है, तो पानी को एक बूंद बनाने के बजाय तुरंत फैलना चाहिए।
  10. बंधुआ चिप को 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
  11. इनलेट्स में प्रवेश करने से धूल को रोकने के लिए चिपकने वाले टेप के साथ चिप के उजागर पक्ष को सील करें।
    नोट: चिप का उपयोग करने तक रखा जा सकता है। उद्घाटन को तब तक टेप के साथ बंद कर दिया जाना चाहिए।

2. माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग की तैयारी

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग करने के लिए निम्नलिखित प्रारंभिक चरण आवश्यक हैं: सबसे पहले, जब माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग करते हैं, तो इनलेट्स से आउटलेट्स तक एक द्रव प्रवाह बनाया जाता है। चिप में कोई भी छेद इनलेट्स से दबाव बिल्ड-अप के कारण आउटलेट के रूप में कार्य करेगा। इसलिए, उपयोग नहीं किए जाने वाले सभी छेदों को बंद किया जाना चाहिए; उदाहरण के लिए, छेद जो चिप पर ऊतक लोड करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। यदि ये बंद नहीं होते हैं, तो ऊतक तरल पदार्थ के साथ बाहर बह सकता है। इन छेदों को बंद करने के लिए, पीडीएमएस से भरे टयूबिंग का उपयोग किया जाता है। पीडीएमएस से भरे टयूबिंग को अनिश्चित काल तक रखा जा सकता है और इसलिए, प्रत्येक माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग के लिए अलग से तैयार होने की आवश्यकता नहीं होगी, लेकिन बड़े बैचों में बनाया जा सकता है। दूसरा, माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग की शुरुआत से पहले, टयूबिंग, पीडीएमएस से भरे टयूबिंग, और चिप, प्रयोग के लिए आवश्यक, तैयार किए जाते हैं और यूवी-निष्फल होते हैं। अंत में, चिप को फाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित किया जाना चाहिए, ताकि भ्रूण ऊतक ग्लास 25 से जुड़ सके।

  1. PDMS से भरा टयूबिंग बनाना.
    1. टयूबिंग के ±1 मीटर ले लो। अधिक टयूबिंग को ट्यूबिंग के कई टुकड़े लेकर पीडीएमएस से भरा जा सकता है।
    2. पोलीमराइजेशन को प्रेरित करने के लिए 9: 1 अनुपात (डब्ल्यू: डब्ल्यू) में उत्प्रेरक के साथ मोनोमर को मिलाकर पीडीएमएस की आवश्यक मात्रा तैयार करें।
      नोट: मिश्रण करने के लिए डिस्पोजेबल टूल का उपयोग करें, जैसे कि प्लास्टिक के कप और कांटे। ठीक से मिलाएं।
    3. पीडीएमएस मिश्रण को एक डेसिकेटर में रखें और पीडीएमएस मिश्रण से हवा को हटाने के लिए लगभग 30 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें।
      नोट: यदि PDMS पर प्रवाहित होता है तो ऊतकों के साथ desiccator के अंदर को कवर करें।
    4. PDMS के साथ एक 3 mL सिरिंज भरें। मिश्रण में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए ध्यान से भरें।
    5. टयूबिंग में 22 जी सुई की नोक डालने के लिए संदंश का उपयोग करें।
      नोट: ध्यान रखें कि सुई के साथ टयूबिंग या अपनी उंगलियों को पंचर न करें।
    6. सुई के माध्यम से PDMS से भरे सिरिंज के लिए टयूबिंग संलग्न करें। टयूबिंग को भरने के लिए सिरिंज पंप का उपयोग करें, लगभग 500 μL / h की प्रवाह दर के साथ। सावधान रहें कि पंप के टूटने से रोकने के लिए बहुत अधिक दबाव लागू न करें।
    7. एक बार जब टयूबिंग पूरी तरह से पीडीएमएस से भर जाती है, तो इसे 15 सेमी डिश में रखें और कमरे के तापमान (कम से कम रात भर) पर इलाज करें।
  2. प्रयोग के लिए टयूबिंग और चिप तैयार करें।
    नोट: प्रयोग के लिए निम्नलिखित टयूबिंग की आवश्यकता होती है: पहला, प्रति आउटलेट लगभग 50 सेमी टयूबिंग और दूसरा, लगभग 2-3 मीटर प्रति इनलेट (सटीक आकार बाद में उपयोग किए जाने वाले पंपों, इनक्यूबेटर या माइक्रोस्कोप के स्थानिक संगठन पर निर्भर करता है)। इनलेट टयूबिंग को प्रयोग के दौरान भ्रूण संस्कृति के लिए CO2 के साथ संतुलन करने के लिए संस्कृति माध्यम को अनुमति देने के लिए लंबे समय तक होना चाहिए।
    1. टयूबिंग को 45° कोण पर काटें ताकि नुकीले सिरे बनाए जा सकें; यह चिप के छेद में टयूबिंग डालने के लिए आसान बना देगा। इनलेट टयूबिंग में से प्रत्येक के लिए एक सुई संलग्न करें। चरण 2.1.5 देखें।
    2. ±1 सेमी प्लग में PDMS से भरे टयूबिंग को काटें। 45° कोण पर काटें ताकि नुकीले सिरे बनाए जा सकें; यह चिप के छेद में टयूबिंग डालने के लिए आसान बना देगा। प्रत्येक छेद को भरने के लिए पर्याप्त प्लग की आवश्यकता होती है जो किसी भी टयूबिंग से जुड़ी नहीं है।
    3. चिप से चिपकने वाला टेप निकालें।
    4. एक डिश में संलग्न सुइयों, चिप, और प्लग के साथ सभी टयूबिंग रखें और ±15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में लाकर निष्फल करें। यूवी नसबंदी के लिए संभावना के साथ किसी भी सेल संस्कृति हुड का उपयोग किया जा सकता है।
  3. फाइब्रोनेक्टिन के साथ चिप की कोटिंग.
    नोट: पीछे पीएसएम के 2 डी पूर्व विवो संस्कृतियों की संस्कृति के लिए, फाइब्रोनेक्टिन के साथ चिप कोट करें।
    1. चिप को कमरे के तापमान पर पीबीएस + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त बीकर में रखें। सुनिश्चित करें कि चिप पूरी तरह से पीबीएस के साथ कवर किया गया है। पीबीएस के साथ चिप फ्लश एक P200 पिपेट के साथ हवा को हटाने के लिए।
      नोट: चिप के सभी आगे हैंडलिंग चिप में हवा के प्रवेश को रोकने के लिए प्रयोग की शुरुआत तक इस बीकर में किया जाएगा। सावधान रहें कि चिप की ग्लास स्लाइड को न तोड़ें।
    2. पीबीएस में 1: 20 फाइब्रोनेक्टिन के 2 एमएल तैयार करें और बीकर में भरें।
    3. चिप के प्रत्येक कक्ष के लिए एक 3 एमएल सिरिंज लोड करें। संदंश के साथ, आउटलेट टयूबिंग में एक 22 जी सुई डालें। सुई को फाइब्रोनेक्टिन युक्त सिरिंज से जोड़ें।
    4. सिरिंज को सिरिंज पंप से कनेक्ट करें। टयूबिंग फ्लश करें, जब तक कि टयूबिंग में कोई हवा न बची हो।
    5. चिप के आउटलेट के आउटलेट के लिए आउटलेट टयूबिंग संलग्न करें। टयूबिंग को नीचे तक सभी तरह से धक्का देना सुनिश्चित करें। चिप को कोट करने के लिए कम प्रवाह दर सेट करें। अन्य सभी उद्घाटन खुले रह सकते हैं। सिरिंज पंप को कम से कम 2 घंटे के लिए चलने दें, रात भर भी चल सकते हैं।
    6. पंप बंद करो। सुई के ठीक बाद टयूबिंग को काट लें। शेष टयूबिंग बाद में प्रयोग के दौरान आउटलेट के रूप में काम करेगा।

3. माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग

नोट:: यहाँ, नॉच सिग्नलिंग अवरोधक DAPT की दालों को लागू करके 2D पूर्व vivo संस्कृतियों में माउस विभाजन घड़ी के entrainment के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। माउस विभाजन घड़ी (137 min25) की प्राकृतिक अवधि के करीब, 130 मिनट की अवधि के साथ दालों को लागू करना, कुशल entrainment की अनुमति देता है। मध्यम के 100 मिनट और 2 μM DAPT के 30 मिनट की दालों को लागू किया जाता है (चित्रा 2A)। चिप के भीतर दवा की उपस्थिति की निगरानी एक फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके की जाती है। इस डाई और फ्लोरोसेंट सिग्नलिंग रिपोर्टर के उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को प्रतिदीप्ति वास्तविक समय इमेजिंग के दौरान रक्तस्राव को रोकने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए। जब पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग सिग्नलिंग रिपोर्टर के रूप में किया जाता है, जैसे कि नॉच सिग्नलिंग रिपोर्टर LuVeLu5 (पागल फ्रिंज-वीनस-पागल फ्रिंज), डाई, कैस्केड ब्लू, लागू किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट डाई और रिपोर्टर के अन्य संभावित संयोजनों की पहचान करने के लिए, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध स्पेक्ट्रा दर्शक का उपयोग किया जा सकता है। Entrainment के प्रभाव गतिशील सिग्नलिंग पत्रकारों के वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है5,10,32. प्रत्येक चिप में दो इनक्यूबेशन कक्ष होते हैं। यह दालों (डीएमएसओ) को नियंत्रित करने के लिए दवा दालों (डीएपीटी) की सीधी तुलना की अनुमति देता है।

  1. मध्यम और degas बनाओ.
    1. प्रयोग के दिन, 50 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम तैयार करें (DMEM-F12 0.5 mM ग्लूकोज, 2 mM ग्लूटामाइन, और 1% BSA के साथ पूरक, माउस टेलबड संस्कृति see25 की अधिक जानकारी के लिए)।
    2. प्रयोग के लिए माध्यम से भरे सिरिंज तैयार करें। बीकर्स में संस्कृति माध्यम तैयार करें: नॉच सिग्नलिंग दोलनों को प्रशिक्षित करने के लिए, डीएमएसओ + 10 μM कैस्केड ब्लू के 1.2 μL के साथ 6 मिलीलीटर माध्यम तैयार करें; 2 μM DAPT + 10 μM कैस्केड ब्लू के साथ संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर; मध्यम प्रत्येक के 6 mL के साथ दो ट्यूबों. प्रति सिरिंज माध्यम के कम से कम 6 मिलीलीटर का उपयोग करें। माध्यम के साथ सिरिंज लोड करें। दवा और डीएमएसओ युक्त सिरिंज को लेबल करना सुनिश्चित करें।
    3. डीगैस पीबीएस के भीतर चिप और एक desiccator में माध्यम युक्त सिरिंज. सिरिंज को एक बीकर में रखें, जिसमें टिप का सामना करना पड़ रहा है, ताकि हवा शीर्ष पर बच सके। यह हो सकता है कि चिप तैरती है और अभी भी बुलबुले से भरी होती है। इन्हें बाद में हटा दिया जाएगा।
    4. एक P200 पिपेट का उपयोग कर चिप से हवा के बुलबुले के अधिकांश बाहर फ्लश / चूसना करने की कोशिश करो। यदि कुछ हवा बनी रहती है, तो इसे निम्नलिखित प्रयोग के दौरान हटा दिया जाएगा।
    5. पंपों में सिरिंज स्थापित करें और सिरिंज के लिए इनलेट टयूबिंग संलग्न करें। नॉच सिग्नलिंग को प्रशिक्षित करने के लिए, दो सिरिंज पंपों का उपयोग करें, एक मध्यम सिरिंज ले जा रहा है, एक दवा / डीएमएसओ सिरिंज ले जा रहा है। इसे टयूबिंग से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्रयोग की शुरुआत तक उच्च प्रवाह दर (0.5 एमएल / एच) पर चलने दें। पंप में सिरिंज विवरण (व्यास) ठीक से सेट करने के लिए सावधान रहें।
  2. चिप पर ऊतक का लोड हो रहा है.
    1. माउस भ्रूण ऊतक विच्छेदन. पूंछ (tailbud) के सबसे पीछे टिप विच्छेदन. विच्छेदित ऊतक को संस्कृति माध्यम + 25 μM HEPES में रखें।
    2. पीबीएस को हटाने के लिए एक P200 का उपयोग करके संस्कृति माध्यम + 25 μM HEPES के साथ चिप फ्लश करें।
    3. एक P200 पिपेट (चित्रा 1C) का उपयोग कर चिप में ऊतक लोड करें। सुनिश्चित करें कि चिप में हवा के बुलबुले पेश न करें।
      नोट:: कुशल लोडिंग कुछ अभ्यास की आवश्यकता है। यदि ऊतक ठीक से उन्मुख नहीं है, तो ध्यान से चूसने और फिर से फ्लश करके इसे चालू करना संभव हो सकता है। हालांकि, यह अक्सर त्वरित कोशिका मृत्यु में परिणाम देता है।
    4. प्रत्येक ऊतक-लोडिंग चरण के बाद, पीडीएमएस से भरे टयूबिंग के एक टुकड़े का उपयोग करके संबंधित ऊतक-लोडिंग इनलेट को बंद करें। सुनिश्चित करें कि प्लग को कुंद चिमटी का उपयोग करके चिप के नीचे पर्याप्त रूप से नीचे धकेल दिया जाता है।
    5. सभी नमूनों को लोड किए जाने के बाद, कुंद संदंश का उपयोग करके पीडीएमएस से भरे टयूबिंग के टुकड़ों के साथ किसी भी अप्रयुक्त इनलेट्स / आउटलेट्स को बंद करें।
  3. माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप की असेंबली।
    1. माइक्रोफ्लुइडिक पंपों की प्रवाह दर को कम करें। 60-100 μL / h माउस भ्रूण tailbuds के लिए अच्छी तरह से काम करता है। उच्च प्रवाह दरों पर, सेल मृत्यु देखी गई थी - संभवतः बहुत अधिक सेल कर्तन के कारण। एकाधिक पंपों की संचयी प्रवाह दर किसी दिए गए समय में इन 60-100 μL / h प्रति माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष से अधिक नहीं होनी चाहिए।
    2. माइक्रोफ्लुइडिक चिप के लिए टयूबिंग संलग्न करें। चिप के अंदर हवा के बुलबुले प्राप्त किए बिना ऐसा करें (यह सुनिश्चित करके प्राप्त किया जा सकता है कि टयूबिंग के अंत में मौजूद माध्यम की एक बूंद है)। आउटलेट अभी भी फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग से मौजूद हैं (2.3 देखें)।
    3. एक बार जब सभी ट्यूबिंग चिप से जुड़े होते हैं, तो इसे बीकर से बाहर निकालें, इसे ठीक से सुखाएं, इसे एक डिश में रखें, और इसे रात भर की संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ 2, 5% सीओ 2) में लगभग 1.5 मीटर इनलेट टयूबिंग के साथ एक साथ रखें। टयूबिंग गैस पारगम्य है; यह माध्यम में O2 और CO2 के संतुलन की अनुमति देगा। वैकल्पिक रूप से, एक साथ प्रतिदीप्ति वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, चिप और लगभग 1.5 मीटर इनलेट टयूबिंग को सीधे माइक्रोस्कोप में रखा जाता है। चिप के लिए एक धारक, जो मानक 96-वेल-प्लेट धारकों में फिट बैठता है, पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान किया गया है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेशन के दौरान आर्द्रता काफी अधिक है। यदि आवश्यक हो, तो माइक्रोफ्लुइडिक्स सेट-अप में वाष्पीकरण को रोकने के लिए इमेजिंग चैंबर या इनक्यूबेटर में एक नम ऊतक जोड़ें। यदि माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर में आर्द्रता बहुत कम है, तो इसके परिणामस्वरूप टयूबिंग और माइक्रोफ्लुइडिक चिप में एयर बबल गठन होता है। एक बंद इमेजिंग बॉक्स, जिसमें चिप और टयूबिंग को रखा जाता है, फिर इसका उपयोग किया जा सकता है। इस तरह के इमेजिंग बॉक्स को बनाने का सबसे सरल तरीका चिप पर एक बड़ा ढक्कन रखना और एक गीला ऊतक जोड़ना है, इसे पूरी तरह से बंद करने की आवश्यकता नहीं है। सुनिश्चित करें कि पंप और चिप के बीच ऊंचाई का अंतर बहुत बड़ा नहीं है और यदि आवश्यक हो, तो गुरुत्वाकर्षण के कारण हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए धीरे-धीरे ऊंचाइयों को बदलें।
    4. सेटअप को अपने अंतिम स्थान पर रखने के बाद सभी पंपों को 20 मिनट के लिए 20 μL / h की प्रवाह दर पर प्रवाहित होने दें। क्योंकि कक्ष और पंप सबसे अधिक संभावना ऊंचाई में चले गए हैं, यह टयूबिंग में सही दबाव को फिर से स्थापित करने के लिए आवश्यक है।
    5. दवा पंप को बंद कर दें, प्रयोग / वास्तविक समय इमेजिंग की शुरुआत तक केवल मध्यम पंप को 60 μL / h पर चलने दें।
  4. प्रयोग की शुरुआत।
    1. प्रयोग के लिए नियोजित पंपिंग कार्यक्रम शुरू करें। नॉच सिग्नलिंग को प्रशिक्षित करने के लिए, 100 मिनट के माध्यम और 30 मिनट की दवा दालों के पंपिंग कार्यक्रम का उपयोग करें, जिसे प्रयोग के अंत तक दोहराया जाता है, आमतौर पर 24 घंटे के लिए।
      नोट: किसी भी प्रोग्राम माइक्रोफ्लुइडिक पंप का उपयोग किया जा सकता है। सबसे सरल प्रारूप में, पंपों को प्रोग्राम किया जा सकता है और मैन्युअल रूप से शुरू किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पंपों को एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।
    2. यदि वास्तविक समय इमेजिंग की जाती है, तो कम से कम 30 मिनट की अवधि के बाद इमेजिंग शुरू करें। यह चिप के तापमान को इनक्यूबेटर के भीतर तापमान को समायोजित करने और इमेजिंग के दौरान बहुत मजबूत बहाव को रोकने की अनुमति देगा। ऑटोफोकस अभी भी फायदेमंद है।
    3. एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चिप की ग्लास स्लाइड के माध्यम से मानक कॉन्फोकल इमेजिंग करें। 130 मिनट की अवधि के साथ पर्याप्त रूप से सिग्नलिंग दोलनों का पता लगाने के लिए 10 मिनट के इमेजिंग अंतराल का उपयोग करें।
    4. छोटी अवधि के लिए, पर्याप्त नमूने के लिए अंतराल को छोटा करें। चिप पर दवा की उपस्थिति की कल्पना करने के लिए कैस्केड ब्लू का पता लगाने के लिए एक कम रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग ट्रैक शामिल करें।
    5. एक वीनस रिपोर्टर की उत्तेजना के लिए, 960 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर 515 एनएम लेजर या 2-फोटॉन लेजर का उपयोग करें।
    6. एक 20x योजना उद्देश्य (संकल्प 512 x 512 पिक्सेल, 1.38 μm / पिक्सेल) के माध्यम से 8 μm की दूरी के साथ 6-8 विमानों का एक z स्टैक प्राप्त करें। एक प्रयोग के भीतर कई नमूनों की छवि के लिए एक motorized चरण का उपयोग करें।
    7. एक 405 एनएम लेजर के साथ कैस्केड ब्लू को उत्तेजित करें और हर 10 मिनट में एक एकल जेड विमान प्राप्त करें (रिज़ॉल्यूशन 32 x 32 पिक्सेल, 22.14 μm / पिक्सेल)।
      नोट:: इमेजिंग और छवि विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी प्रतिनिधि परिणाम में प्रदान की जाती है और संदर्भ 10 में पाया जा सकता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के साथ, माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके माउस विभाजन घड़ी के सिग्नलिंग दोलनों के बाहरी entrainment के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। नॉच सिग्नलिंग इनहिबिटर की दालों को लागू करके, स्वतंत्र भ्रूण संस्कृतियों में सिग्नलिंग दोलन एक दूसरे से सिंक्रनाइज़ हो जाते हैं10। विभाजन घड़ी की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली के आवेदन के लिए एक शर्त यह है कि सिग्नलिंग गतिशीलता और विभाजन अभी भी ऑन-चिप मौजूद हैं। यह पहले दिखाया गया था कि WNT और Notch सिग्नलिंग गतिशीलता दोनों को निरंतर मध्यम प्रवाह के बावजूद बनाए रखा जाता है और परिधीय 2 D संस्कृतियों में भौतिक सीमा गठन जारी रहता है, जो पूर्वकाल PSM10 का प्रतिनिधित्व करता है।

बाहरी दवा दालों के लिए सिग्नलिंग दोलनों के entrainment की पुष्टि करने के लिए, उदाहरण के लिए, नॉच सिग्नलिंग रिपोर्टर LuVeLu5, माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग के दौरान पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन वीनस को व्यक्त करते हुए, वास्तविक समय इमेजिंग किया जाता है। चूंकि चिप पर 2 डी संस्कृतियों के अभिविन्यास को नियंत्रित करना मुश्किल है, इसलिए पूर्वकाल ऊतक में सिग्नलिंग दोलनों का विश्लेषण किया जाता है। 2 डी संस्कृति की परिधि का पता लगाया जा सकता है। ऑन-चिप ऊतक वर्गों के अभिविन्यास को इच्छानुसार नियंत्रित नहीं किया जा सकता है और चिप की पूरी आंतरिक सतह फाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित हो जाती है। इसलिए, कभी-कभी ऐसा होता है कि संस्कृतियां चिप के किनारों या छत से जुड़ी होती हैं। यदि नमूने दृश्य के क्षेत्र (एक्स, वाई और जेड दिशा में) से बाहर निकलते हैं या वे नीचे की ओर सामना करने वाली पूंछ के पीछे के छोर के साथ संलग्न होते हैं, तो आमतौर पर इन नमूनों को बाहर रखा जाता है।

आगे के विश्लेषण के लिए, इस तरह के कई entrainment प्रयोगों को संयुक्त किया जाता है। स्वतंत्र प्रयोगों को लगभग 400 एनएम पर डाई, कैस्केड ब्लू द्वारा विज़ुअलाइज़ की गई दवा दालों के समय का उपयोग करके एक-दूसरे के साथ संरेखित किया जा सकता है। सिंक्रनाइज़ेशन का विश्लेषण और कल्पना करने के लिए, परिमाणित दोलनों को detrended किया जा सकता है (चित्रा 2B, D) और फिर या तो माध्य और मानक विचलन या दोलनों के चरणों के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है। यह एक दूसरे के लिए स्वतंत्र पश्च भ्रूण संस्कृतियों के दोलनों और बाहरी दवा दालों (चित्रा 2 सी, ई) के बीच चरण-संबंध के विश्लेषण की अनुमति देता है। पायथन-आधारित प्रोग्राम pyBOAT33 इस तरह के सिग्नलिंग दोलनों की अवधि, चरण और आयाम को निर्धारित करने के लिए एक सीधा और उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण है। Entrainment की पुष्टि करने के लिए, उदाहरण के लिए, अंतर्जात सिग्नलिंग दोलनों की अवधि निर्धारित कर सकते हैं। 130 मिनट की अवधि के साथ दालों को लागू करते समय, नॉच सिग्नलिंग दोलन भी 130 मिनट (चित्रा 2 एफ) 10 की अवधि दिखाते हैं। इसके अलावा, कैस्केड ब्लू दालों का उपयोग करके, विभिन्न सिग्नलिंग पत्रकारों के साथ स्वतंत्र प्रयोगों को एक-दूसरे के साथ संरेखित किया जा सकता है। इस तरह से कई सिग्नलिंग पत्रकारों के दोलनों के बीच चरण-संबंध अप्रत्यक्ष रूप से निर्धारित किया जा सकता है10।

इस प्रकार, प्रस्तुत माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली विकासशील माउस भ्रूण की पूर्व विवो संस्कृतियों में सिग्नलिंग दोलनों के नियंत्रण की अनुमति देती है। खंड गठन और भेदभाव के लिए मार्करों की इमेजिंग के साथ संयोजन में, इस प्रणाली को अब विच्छेदन करने के लिए लागू किया जा सकता है कि विभाजन घड़ी के सिग्नलिंग मार्ग कैसे बातचीत करते हैं और वे सोमाइट गठन को कैसे नियंत्रित करते हैं।

Figure 1
चित्र1: माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए) चिप मोल्ड्स को कंप्यूटर-एडेड-डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डिज़ाइन किया जा सकता है। माउस somitogenesis के पूर्व विवो मॉडल में संकेतन दोलनों entrain करने के लिए एक चिप डिजाइन प्रदान की जाती है। मोल्ड्स, उदाहरण के लिए, 3 डी प्रिंटिंग द्वारा उत्पन्न किए जा सकते हैं या ऑर्डर किए जा सकते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स पीडीएमएस के मोल्डिंग द्वारा उत्पादित किए जाते हैं। एक कठोर पीडीएमएस चिप को काट दिया जाता है और प्लाज्मा ओवन का उपयोग करके ग्लास स्लाइड से सहसंयोजक रूप से बंधुआ किया जाता है। चिप के भीतर कांच की सतह को फाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित किया जाता है ताकि विच्छेदित ऊतक को संलग्न करने की अनुमति मिल सके। भ्रूण ऊतक लोडिंग इनलेट्स के माध्यम से चिप पर लोड किया जाता है, जो बाद में बंद हो जाते हैं। विभिन्न मीडिया स्थितियों के साथ पंप चिप के इनलेट्स से जुड़े होते हैं और एक प्रवाह कार्यक्रम शुरू किया जाता है। ऊतक को प्रयोग के दौरान एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। (Kymographs Sonnen et al., 201810 से अनुकूलित। पुनर्मुद्रित और क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन CC BY-NC-ND 4.0 के अनुसार सेल से संशोधित.) (बी) पीछे के माउस भ्रूण ऊतक के ऑन-चिप संस्कृति के लिए एक मोल्ड डिजाइन की योजनाबद्ध ड्राइंग। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की ऊंचाई 500 μm है, जो पीछे के भ्रूण माउस पूंछ की संस्कृति के लिए पर्याप्त है। इस मोल्ड को मुद्रित करने के लिए फ़ाइल अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है, और अनुपूरक फ़ाइल 2 में एक विकल्प दिया गया है। (सी) एक E10.5 अनुभागित माउस पूंछ की ब्राइटफील्ड छवि PDMS स्तंभों पर चिप द्वारा संलग्न है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम। (ए) मध्यम और दवा पंप के साथ एनट्रेनमेंट प्रयोग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सिग्नलिंग पाथवे मॉड्यूलेटर की दालों को माउस भ्रूण की पूर्व विवो संस्कृतियों पर लागू किया जाता है और सिग्नलिंग दोलनों को गतिशील सिग्नलिंग रिपोर्टरों के वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा कल्पना की जा सकती है (उदाहरण के लिए, नॉच सिग्नलिंग रिपोर्टर LuVeLu5 और WNT सिग्नलिंग रिपोर्टर Axin2T2A10)। डैश्ड लाइनें उस क्षेत्र को इंगित करती हैं जिसका उपयोग समय के साथ विश्लेषण के लिए किया जाता है। (B-F) LuVeLu रिपोर्टर दोलनों पायदान सिग्नलिंग अवरोधक DAPT के आवधिक दालों द्वारा entrained हैं. (B,D) DAPT या एक DMSO नियंत्रण का उपयोग कर entrainment पर पूर्वकाल PSM में पायदान सिग्नलिंग दोलनों के परिमाणीकरण. (C,E) पायदान सिग्नलिंग दोलनों के चरण और बाहरी डीएपीटी / डीएमएसओ दालों के समय के बीच चरण-चरण संबंध भूखंड। entrainment के मामले में, एक स्थिर चरण-संबंध स्थापित किया जाता है। (च) डीएमएसओ और डीएपीटी दालों के साथ संलग्न नमूनों की तुलना में रिपोर्टर दोलनों की माध्य अवधि और एसईएम का परिमाणीकरण। (चित्र Sonnenet al., 201810 से अनुकूलित। पुनर्मुद्रित और क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन CC BY-NC-ND 4.0.) के अनुसार सेल से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समस्या सुझाए गए समाधान (ओं)
PDMS कांच के लिए बंधन नहीं है। - सुनिश्चित करें कि पीडीएमएस और ग्लास दोनों साफ हैं।
- सुनिश्चित करें कि बंधन के लिए कक्ष के चारों ओर पर्याप्त पीडीएमएस है।
- प्लाज्मा ओवन की सेटिंग्स का अनुकूलन।
मेरी चिप पर हवा के बुलबुले हैं। - जांचें कि पंप चालू था या नहीं।
- चिप पर ऊतक लोड करने से पहले चिप degas.
- प्रयोग की शुरुआत से पहले माध्यम degas.
- सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेशन कक्ष में आर्द्रता काफी अधिक है।
प्रयोग की शुरुआत में ऊतक मर जाता है। - लोड हो रहा है और चिप असेंबलिंग जब माध्यम के लिए HEPES जोड़ें।
- लोडिंग के दौरान ऊतक को बहुत बार अंदर और बाहर फ्लश न करें।
- जांचें कि प्रवाह दर बहुत अधिक नहीं है।
इमेजिंग के दौरान ऊतक मर जाता है। - सुनिश्चित करें कि इमेजिंग से कोई फोटोटॉक्सिसिटी नहीं है
- सुनिश्चित करें कि कोई संदूषण नहीं है।
- प्रवाह दर बहुत अधिक नहीं होनी चाहिए।
फ़ोकस इमेजिंग के दौरान बदलता है। - इमेजिंग स्लाइड के बहाव के लिए समायोजित करने के लिए इमेजिंग के दौरान ऑटोफोकस का उपयोग करें।
- चिप को कम से कम 30 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप के भीतर तापमान पर संतुलित होने दें।
आउटलेट्स/इनलेट्स अलग हो जाते हैं। - नीचे पूरी तरह से नीचे सभी टयूबिंग पुश।
चिप का शीशा टूट जाता है। - अधिक सावधान रहें, ग्लास बहुत नाजुक है।
- पतले कांच केवल इमेजिंग के लिए आवश्यक है। यदि इमेजिंग नहीं की जाती है, तो एक सामान्य मोटी ग्लास स्लाइड का उपयोग किया जा सकता है।
- यदि ब्रेक चिप के बाहर है, तो यह एक समस्या नहीं हो सकती है। यदि चिप के लिए ग्लास सील टूट जाती है, तो तरल बाहर निकल जाएगा और हवा अंदर आ जाएगी।
मेरी चिप पर एक संदूषण है। - संस्कृति माध्यम के लिए एंटीबायोटिक्स जोड़ें।
- सभी उपकरणों और टयूबिंग को निष्फल करें।
- तेजी से और साफ काम करते हैं।

तालिका 1: समस्या निवारण

अनुपूरक फ़ाइल 1: एक 3 डी प्रिंटर के साथ एक मोल्ड मुद्रित करने के लिए STL फ़ाइल। इस मोल्ड का उपयोग पीछे के भ्रूण ऊतक ( चित्र 1 में दिखाए गए डिजाइन) के ऑन-चिप संस्कृति के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: पीछे के भ्रूण ऊतक के ऑन-चिप संस्कृति के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप उत्पन्न करने के लिए 3 डी प्रिंटर के साथ एक मोल्ड मुद्रित करने के लिए एसटीएल फ़ाइल। पूरक फ़ाइल 1 और चित्रा 1 में दिखाए गए डिजाइन के विपरीत, इस डिजाइन में मुख्य माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में प्रवेश करने से हवा की छोटी मात्रा को रोकने के लिए सभी इनलेट्स पर बुलबुला जाल शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 3: चिप को माइक्रोस्कोप में रखने के लिए एक धारक की पीढ़ी के लिए डिज़ाइन फ़ाइल। इस धारक में 96-अच्छी तरह से प्लेट के आयाम हैं और अधिकांश माइक्रोस्कोप के मानक धारकों में फिट होना चाहिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

कैसे सिग्नलिंग गतिशीलता बहुकोशिकीय प्रणालियों को नियंत्रित करती है, क्षेत्र में एक लंबे समय से सवाल रहा है। कार्यात्मक जांच एक महत्वपूर्ण चुनौती है, क्योंकि इन गतिशीलताओं को इस 11 की अनुमति देने के लिए सूक्ष्मरूप से मॉडुलित किया जाना चाहिए। मार्ग गड़बड़ी पर इस तरह के अस्थायी नियंत्रण को सिद्धांत रूप में ऑप्टोजेनेटिक्स के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो एक उच्च स्थानिक नियंत्रण को भी सक्षम बनाता है34। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स को प्रश्न में प्रत्येक सिग्नलिंग मार्ग के विश्लेषण के लिए परिष्कृत आनुवंशिक उपकरणों की स्थापना की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित वर्तमान प्रोटोकॉल किसी भी सिग्नलिंग मार्ग की गड़बड़ी के लिए एक अत्यधिक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग ऊतक संस्कृतियों में सिग्नलिंग मार्गों की गतिशीलता की कार्यात्मक रूप से जांच करने के लिए अस्थायी रूप से नियंत्रित दवा दालों के आवेदन की अनुमति देता है। यहां, पूर्व विवो संस्कृतियों में सोमिटोजेनेसिस के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल को किसी भी अन्य मॉडल सिस्टम को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में कुछ चरण एक सफल माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं (तालिका 1 में संक्षेप में)। मुख्य बिंदुओं पर निम्नानुसार चर्चा की जाती है। प्रयोग के दौरान मध्यम प्रवाह के कारण, ऊतक संस्कृति कतरनी तनाव का अनुभव करती है। निरंतर प्रवाह के लिए मॉडल प्रणाली के संपर्क में सेल तनाव और चरम मामलों में कर्तन प्रभाव के कारण सेल मृत्यु का कारण बन सकता है। माउस टेलबड्स और वर्तमान चिप डिजाइन की पूर्व विवो ऊतक संस्कृतियों के लिए, 60 μL / h (अधिकतम 100 μL / h) की एक फ्लोरेट को न्यूनतम कर्तन प्रभाव के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए पाया गया था। जब एक ही चिप के लिए एक साथ कई पंप चालू किए जाते हैं, तो कुल प्रवाह दर में वृद्धि का कारण नहीं बनने के लिए व्यक्तिगत पंपों की प्रवाह दर को तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होती है। जब वर्तमान प्रोटोकॉल को अन्य मॉडल सिस्टम और चिप डिज़ाइन के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो प्रवाह दर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, लगातार माध्यम को फ्लश नहीं करना संभव है, लेकिन समय-समय पर चिप 35 पर माध्यम बदलता है। इस तरह के सेटअप को माउस सोमिटोजेनेसिस (अप्रकाशित, डेटा नहीं दिखाया गया है) में सिग्नलिंग दोलनों को नियंत्रित करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, एक सेटअप की भी कल्पना की जा सकती है, जिसमें ऊतक संस्कृतियों को प्रत्यक्ष तरल प्रवाह के संपर्क में नहीं लाया जाता है, लेकिन दवाएं पड़ोसी चैनल से प्रसार द्वारा ऊतक तक पहुंचती हैं। इस तरह की प्रणालियों का उपयोग ईएससी भेदभाव 14,36 के इन विट्रो मॉडल में विकास कारकों के ग्रेडिएंट को लागू करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों का एक प्रमुख मुद्दा प्रयोग के दौरान चिप पर हवा के बुलबुले की घटना है। चिप या टयूबिंग के भीतर हवा के बुलबुले चिप पर समान तरल प्रवाह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और इसके स्थान से भ्रूण संस्कृति को हटाने का कारण बन सकते हैं। हवा के बुलबुले की उपस्थिति को रोकने के लिए, प्रोटोकॉल के विभिन्न चरण अपरिहार्य हैं। सबसे पहले, सिरिंज और माइक्रोफ्लुइडिक चिप के भीतर संस्कृति माध्यम को खुद को एक desiccator (चरण 3.1.3) का उपयोग करके degassed किया जाना चाहिए। दूसरा, लोडिंग इनलेट्स में नमूने लोड करते समय, किसी को सावधान रहना चाहिए कि नमूने (चरण 3.2.3) के साथ चिप में हवा को पाइप न करें। तीसरा, माध्यम के साथ टयूबिंग को भरते समय, चिप (चरण 3.3.2) को संलग्न करने से पहले सभी हवा के बुलबुले को पंप किया जाना चाहिए। अन्यथा, इन बुलबुले को प्रयोग के दौरान मुख्य चिप में धकेल दिया जाएगा। अंत में, प्रयोग के दौरान, माध्यम को अर्ध-पारगम्य टयूबिंग के कारण इमेजिंग चैंबर या इनक्यूबेटर के भीतर संतुलित किया जाता है। टयूबिंग की पारगम्यता भी माध्यम के वाष्पीकरण के लिए अनुमति देती है, इसलिए सुनिश्चित करें कि टयूबिंग में नए बुलबुले के गठन को रोकने के लिए प्रयोग के दौरान आर्द्रता को विनियमित किया जाता है।

सामान्य तौर पर, माइक्रोफ्लुइडिक्स एक अत्यधिक बहुमुखी उपकरण है जिसे शोधकर्ता के विशिष्ट प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वर्तमान डिजाइन दृष्टिकोण प्रति चिप समानांतर में 12 पूर्व विवो संस्कृतियों तक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है। यह संख्या मुख्य रूप से प्रति प्रयोग भ्रूण की संख्या और पर्याप्त संकल्प के साथ प्रत्येक भ्रूण संस्कृति की छवि बनाने में लगने वाले समय से सीमित है। यदि एक ही प्रयोग में कई स्थितियों की तुलना करने की आवश्यकता है, तो एक ही ग्लास स्लाइड पर कई चिप्स लगाए जा सकते हैं। एक चिप डिजाइन प्रदान किया जाता है, जो समानांतर में कई ऊतक स्पष्टीकरणों की इमेजिंग के लिए आदर्श है, लेकिन व्यक्तिगत डिजाइन उच्च थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देने के लिए नमूना संख्या में सीमाओं को दूर कर सकते हैं और एक ही प्रयोग के भीतर अधिक स्थितियों के संयोजन को बढ़ा सकते हैं16,17। माइक्रोफ्लुइडिक्स उन मॉडलों तक सीमित है जिन्हें चिप पर सुसंस्कृत किया जा सकता है और ऑन-चिप संस्कृति को प्रत्येक मॉडल सिस्टम के लिए व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित करना होगा27,37,38।

पिछले 5-10 वर्षों में, माइक्रोफ्लुइडिक्स को उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण और सिग्नलिंग गतिशीलता और ग्रेडिएंट के सूक्ष्म मॉडुलन के लिए अपनी क्षमता के कारण विभिन्न जैविक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए लागू किया गया है। आजकल, माइक्रोफ्लुइडिक्स एक आसानी से लागू, सस्ता और बहुमुखी उपकरण बन गया है जिसे प्रयोगशालाएं आसानी से स्थापित कर सकती हैं। यहां, वर्तमान प्रोटोकॉल को एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, अर्थात्, सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाली सिग्नलिंग गतिशीलता का अध्ययन करना। ऊतक जीव विज्ञान में व्यक्तिगत अनुसंधान प्रश्नों के अनुरूप इस प्रोटोकॉल और डिजाइन को अनुकूलित करना सीधा है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम यांग ली और जोस मालदा के लिए UMC Utrecht से molds के 3 डी मुद्रण के साथ मदद के लिए आभारी हैं, प्रोटोकॉल पर बहुत उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए Sonnen समूह से करेन वैन डेन Anker, और Tjeerd Faase सूक्ष्मदर्शी के भीतर microfluidic चिप्स के लिए धारक के लिए Hubrecht संस्थान में यांत्रिक कार्यशाला से. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पूरे Sonnen समूह और उनकी रचनात्मक प्रतिक्रिया के लिए समीक्षकों को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद से एक ईआरसी के तहत वित्त पोषण प्राप्त हुआ, जो केएफएस को अनुदान समझौते नंबर 850554 शुरू कर रहा था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringe Becton, Dickinson and company 300912
184 Silicon Elastomer curing agent SYLGARD 1673921
184 Silicon Elastomer PDMS SYLGARD 1673921
3 ml syringes Becton, Dickinson and company 309657
Adhesive tape Scotch Magic tape or similar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel Fisher Scientific 10663341
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 Biowest P6154
Compressed air system
Crystallizing dish VWR 10754-7 Sterilized
D-(+)-Glucose 45% Sigma G8769
Desiccator VWR 467-0104
Disposable cups Duni 173 941
Disposable forks Staples 511514
Dissection equipment
DMEM/F12 Cell culture technologies custom DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose
Fibronectin Sigma F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline CleanAir by Baker 511514 For UV light source
Glass slide No 1.5H high precision, 70x70 mm Marienfeld 107999098
HEPES Buffer Gibco 15630-056
L-glutamine Gibco 25030024
Microscope Leica Leica SP8 MP
Needles 22G Becton, dickinson and company z412139-100EA
Oven VWR 390-09
PBS0
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plasma oven Femto Diener electronic
Punch Ø 1mm Uni-Core WB100073
Scale Sartorius Entris
Syringe pump WPI AL-4000
Tubing Ø 1mm APT AWG24T
Vacuum pump VWR 181-0308

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 169 भ्रूण विकास माउस सिग्नलिंग गतिशीलता सिग्नलिंग दोलनों माइक्रोफ्लुइडिक्स entrainment somitogenesis
सिगनलिंग दोलनों की कार्यात्मक जांच के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक्स दृष्टिकोण जो सोमिटोजेनेसिस को नियंत्रित करता है
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van Oostrom, M. J., Meijer, W. H.… More

van Oostrom, M. J., Meijer, W. H. M., Sonnen, K. F. A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis. J. Vis. Exp. (169), e62318, doi:10.3791/62318 (2021).

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