Ett protokoll för odling och manipulering av mus embryonal vävnad på ett mikrofluidiskt chip tillhandahålls. Genom att applicera pulser av vägmodulatorer kan detta system användas för att externt kontrollera signalerande svängningar för funktionell undersökning av mus somitogenes.
Periodisk segmentering av presomitisk mesoderm av ett utvecklande musembryon kontrolleras av ett nätverk av signalvägar. Signalerande svängningar och gradienter tros styra tidpunkten respektive avståndet för segmentbildning. Medan de inblandade signalvägarna har studerats i stor utsträckning under de senaste decennierna, har direkta bevis för funktionen av signalering svängningar i kontrollera somitogenesis saknats. För att möjliggöra en funktionell undersökning av signaldynamiken är mikrofluidik ett tidigare etablerat verktyg för subtil modulering av dessa dynamiker. Med denna microfluidics-baserade entrainment strategi endogena signalering svängningar synkroniseras av pulser av utbildningsmodulerare. Detta möjliggör modulering av till exempel svängningsperioden eller fasförhållandet mellan två oscillerande vägar. Dessutom kan rumsliga gradienter av vägmodulatorer etableras längs vävnaden för att studera hur specifika förändringar i signalgradienterna påverkar somitogenes.
Det nuvarande protokollet är avsett att hjälpa till att fastställa mikrofluidiska metoder för första gången användare av mikrofluidik. De grundläggande principerna och utrustningen som behövs för att installera ett mikrofluidiskt system beskrivs, och en chipdesign tillhandahålls, med vilken en form för spångenerering bekvämt kan förberedas med en 3D-skrivare. Slutligen, hur man odlar primära musvävnad på ett mikrofluidiskt chip och hur man entrain signalerar svängningar till externa pulser av utbildningsmodulatorer diskuteras.
Detta mikrofluidiska system kan också anpassas för att hysa andra in vivo- och in vitro-modellsystem som gastruloider och organoider för funktionell undersökning av signaldynamik och morfengradienter i andra sammanhang.
Utvecklingen styrs av intercellulär kommunikation via signalvägar. Det finns bara ett begränsat antal signalvägar som orkestrerar den komplexa bildandet av vävnader och korrekt celldifferentiering i tid och rum. För att reglera denna mängd processer kan information kodas i dynamiken i en signalväg, förändringen av en väg över tid, till exempel frekvensen eller varaktigheten av en signal1,2.
Under somitogenesis segmenteras somitic vävnad periodiskt bort från presomitic mesoderm (PSM)3. PSM är rumsligt organiserad av gradienter av Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) och Retinsyra signalering. I främre PSM på bestämningsfronten, där Wnt- och FGF-signaler är låga, är cellerna primade för differentiering till somiter. Differentiering sker när en våg av transkriptionsaktivering når denna bestämningsfront. Inom PSM, Wnt, FGF och Notch signalering svänger. Närliggande celler svänger något ur fas, vilket resulterar i vågor av oscillatory transkriptionell aktivering nedströms Wnt, FGF och Notch vägar som reser från bakre till främre PSM. I musembryon når en transkriptionsvåg bestämningsfronten ungefär var 2:e timme och initierar somitbildning. Att studera somitogenes genom att störa eller aktivera signalvägar kan illustrera vikten av dessa vägar4,5,6,7,8,9. Men för att kunna undersöka funktionen av signaldynamik i kontrollen av cellulärt beteende är det viktigt att subtilt modulera signalvägar istället för att permanent aktivera eller hämma dem.
För att tidsmässigt modulera signalvägsaktiviteten inom det segmenterande musembryon har Sonnen m.fl. utvecklat ett mikrofluidiskt system10. Detta system möjliggör tät kontroll av vätskeflöden i mikrokanaler i ett chip som innehåller det biologiska provet11. För att studera vikten av signaldynamik för korrekt segmentering av PSM används denna mikrofluidikinställning för att modulera signaldynamiken hos mussegmenteringsklockan ex vivo. Genom sekventiellt pulserande vägaktivatorer eller hämmare in i kulturkammaren uppnås extern kontroll av dynamiken hos Wnt- och FGF- och Notch-signalering10. Det är till exempel möjligt att ändra perioden för enskilda vägar och fasförhållandet mellan flera oscillatoriska signalvägar. Med hjälp av samtidig realtidsavbildning av dynamiska signalreportrar kan effekten av entrainment på själva vägarna, på differentiering och somitbildning analyseras. Med hjälp av denna nivå av kontroll över signalering dynamik, vikten av fas förhållandet mellan Wnt- och Notch-signalering vägar under somitogenesis betonades10.
Personliga chipdesigner möjliggör en mängd alternativ för spatiotemporala störningar i den lokala miljön, t.ex. stabil gradientbildning12,13,14,15, pulsatil aktivering / hämning10,16,17,18 eller lokaliserade stör19,20 . Mikrofluidik kan också möjliggöra en mer reproducerbar avläsning och högre genomströmning på grund av automatisering av experimentell hantering21,22,23. Det nuvarande protokollet är avsett att föra mikrofluidics och entrainment av endogena signalering svängningar inom vävnader till varje standard livsvetenskap labb. Även i avsaknad av sofistikerad utrustning för spångenerering, såsom renrum och utrustning för mjuklitografi, kan mikrofluidiska chips tillverkas och användas för att ta itu med biologiska frågor. Formar kan utformas med hjälp av fritt tillgänglig datorstödd design (CAD) programvara. En form för generering av mikrofluidiska chips, vanligtvis bestående av polydimethylsiloxan (PDMS), kan skrivas ut med en 3D-skrivare eller beställas från tryckerier. På så sätt kan mikrofluidiska chips produceras inom en dag utan krav på dyr utrustning24. Här tillhandahålls en chipdesign, med vilken en form för entrainment av musen segmentering klocka i tvådimensionella (2D) ex vivo kulturer25 kan skrivas ut med en 3D-skrivare.
On-chip kulturer och exakta stör, möjliggjort av mikrofluidics, har enastående potential i att nysta upp de molekylära mekanismerna för hur signalvägar styr multicellulärt beteende. Signaldynamik och morfengradienter krävs för många processer under utveckling. Tidigare hade laboratorier odlade celler, vävnader och hela organismer i mikrofluidiska chips och protokoll för spatiotemporal perturbation av främst 2D-cellkultur tillhandahålls någon annanstans12,26,27,28,29. Genom att använda mikrofluidik för att modulera lokala miljöer i multicellulära system öppnas nya perspektiv för hög genomströmning och exakta spatiotemporala störningar. Området mikrofluidik har nu nått en punkt där det har blivit ett icke-specialiserat, billigt och lätt tillämpligt verktyg för utvecklingsbiologer.
Här tillhandahålls ett protokoll för entrainment av mussegmenteringsklockan till pulser av en Hack-signalhämmare. Ett sådant experiment består av följande steg: 1) generering av mikrofluidiskt chip, (2) beredning av slangar och beläggning av chipet och (3) själva det mikrofluidiska experimentet (figur 1A). Forskning som involverar ryggradsdjursmodellsystem kräver förhandsetiskt godkännande från ansvarig kommitté.
Hur signaldynamiken styr multicellulära system har länge varit en fråga inom området. Funktionell undersökning utgör en viktig utmaning, eftersom dessa dynamiker måste moduleras subtilt för att tillåta detta11. Sådan temporal kontroll över vägperturbations kan i princip uppnås med optogenetik, vilket också möjliggör en hög rumslig kontroll34. Optogenetik kräver dock att sofistikerade genetiska verktyg inrättas för analys av varje signalväg i fråga. Det nuvarande protokollet som beskrivs här ger ett mycket mångsidigt verktyg för att störa alla signalvägar. Mikrofluidikexperimentet gör det möjligt att tillämpa tidskontrollerade läkemedelspulser för att funktionellt undersöka dynamiken i signalvägar i vävnadskulturer. Här ligger fokus på studier av somitogenes i ex vivo-kulturer , men protokollet kan anpassas för att passa alla andra modellsystem.
Vissa steg i protokollet är avgörande för att utföra ett framgångsrikt mikrofluidikexperiment (sammanfattat i tabell 1). Viktiga punkter diskuteras på följande sätt. På grund av medelflödet under experimentets gång upplever vävnadskulturen skjuvningsstress. Att exponera modellsystemet för kontinuerligt flöde kan orsaka cellstress och i extrema fall celldöd på grund av skjuvningseffekt. För ex vivo vävnad kulturer av mus tailbuds och den nuvarande chip design, en flödeshastighet på 60 μL/h (högst 100 μL/h) befanns fungera bra med minimal klippning effekt. När flera pumpar slås på samtidigt för samma chip måste flödeshastigheten för enskilda pumpar justeras i enlighet därmed för att inte orsaka en ökning av det totala flödet. När det aktuella protokollet är anpassat till andra modellsystem och chipkonstruktioner bör flödeshastigheten optimeras. Alternativt är det möjligt att inte spola medium kontinuerligt, men regelbundet byta medium på chip35. En sådan inställning kan också tillämpas för att styra signaleringssvängningar i mus somitogenesis (opublicerad, data visas inte). Dessutom kan en inställning också föreställas, där vävnadskulturer inte utsätts för direkt vätskeflöde, men droger når vävnaden genom diffusion från en närliggande kanal. Sådana system har framgångsrikt använts för att tillämpa gradienter av tillväxtfaktorer på in vitro-modeller av ESC-differentiering14,36.
En viktig fråga om mikrofluidiska experiment är förekomsten av luftbubblor på chip under experimentet. Luftbubblor i chipet eller slangen kan störa det enhetliga vätskeflödet på chipet och kan leda till att embryokulturen avlägsnas från dess plats. För att förhindra närvaron av luftbubblor är olika steg i protokollet oumbärliga. För det första måste odlingsmediet inom sprutor och själva mikrofluidchipet avgasas med hjälp av en desiccator (steg 3.1.3). För det andra måste man vid lastning av prover i lastinloppen vara försiktig så att man inte rör luft i spånet tillsammans med provet (steg 3.2.3). För det tredje måste alla luftbubblor pumpas ut när slangen fylls med medium innan chipet fästs (steg 3.3.2). Annars kommer dessa bubblor att skjutas in i huvudchipet under experimentet. Slutligen, under experimentet, är mediet ekvilibrerat inom bildkammaren eller inkubatorn på grund av den halvgenomsläppliga slangen. Slangens permeabilitet möjliggör också avdunstning av mediet, så se till att fuktigheten regleras under experimentet för att förhindra bildandet av nya bubblor i slangen.
I allmänhet är mikrofluidik ett mycket mångsidigt verktyg som kan anpassas till forskarens specifika fråga. Den nuvarande designmetoden möjliggör avbildning av upp till 12 ex vivo-kulturer parallellt per chip. Detta antal begränsas huvudsakligen av antalet embryon per experiment och den tid det tar att avbilda varje embryokultur med tillräcklig upplösning. Om flera villkor behöver jämföras i ett enda experiment kan flera spånor monteras på en enda glasrutschbana. En chipdesign tillhandahålls, som är idealisk för avbildning av flera vävnadsexplanter parallellt, men personliga mönster kan övervinna begränsningar i provnummer för att möjliggöra analys med hög genomströmning och öka kombinationen av fler förhållanden inom ett enda experiment16,17. Mikrofluidik är begränsad till modeller som kan odlas på ett chip och on-chip-kulturen måste optimeras för varje modellsystem individuellt27,37,38.
Under de senaste 5-10 åren har mikrofluidik tillämpats för att ta itu med olika biologiska frågor på grund av dess potential för hög genomströmningsmetoder och subtila modulering av signaldynamik och gradienter. Numera har mikrofluidik blivit ett lätt tillämpbart, billigt och mångsidigt verktyg som laboratorier enkelt kan etablera. Här är det nuvarande protokollet optimerat för en specifik applikation, nämligen att studera signaldynamik som styr somitogenesis. Det är enkelt att anpassa detta protokoll och design för att passa enskilda forskningsfrågor inom vävnadsbiologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Yang Li och Jos Malda från UMC Utrecht för hjälp med 3D-utskrift av formar, Karen van den Anker från Sonnen-gruppen för mycket användbar feedback på protokollet och Tjeerd Faase från den mekaniska verkstaden vid Hubrecht Institute för innehavaren för mikrofluidiska chips i mikroskopet. Vi vill tacka hela Sonnengruppen för kritisk läsning av manuskriptet och granskarna för deras konstruktiva feedback. Detta arbete fick finansiering från Europeiska forskningsrådet inom ramen för ett avtal om startbidrag från EFR nr 850554 till K.F.S.
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |