Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग करके एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए संस्कृति विधियां

Published: March 23, 2021 doi: 10.3791/62330
Automatic Translation
*1, *2, *2, 1, 2, 2,3, 1, 2
1STEMCELL Technologies Ltd., 2STEMCELL Technologies Inc., 3Terry Fox Laboratory, BC Cancer
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम दो प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो आंतों के एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन के मॉडलिंग की अनुमति देते हैं। ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न आंतों के मोनोलेयर और एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) संस्कृतियां चमकदार और बेसोलेटरल दोनों पक्षों से अच्छी तरह से विभेदित एपिथेलिया की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाती हैं, जबकि ध्रुवीयता-उल्टे आंतों के ऑर्गेनॉइड उनके एपिकल पक्ष को बेनकाब करते हैं और उच्च थ्रूपुट परख के लिए उत्तरदायी हैं।

Abstract

आंत एपिथेलियम की परत विशेष एपिथेलियल कोशिकाओं की एक साधारण परत से बनी है जो उनके एपिकल साइड को ल्यूमेन में बेनकाब करती है और बाहरी संकेतों का जवाब देती है। इन विट्रो संस्कृति स्थितियों का हालिया अनुकूलन आंतों के स्टेम सेल आला के पुनः निर्माण और उन्नत 3-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के विकास के लिए अनुमति देता है जो सेल संरचना और एपिथेलियम के संगठन को पुन: स्थापित करते हैं। एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड आंतों के ऑर्गेनॉइड को लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है और एक अच्छी तरह से परिभाषित, ध्रुवीकृत एपिथेलियम उत्पन्न करने के लिए स्वयं-व्यवस्थित किया जा सकता है जिसमें एक आंतरिक ल्यूमेन और एक बाहरी उजागर बेसल पक्ष शामिल है। आंतों के ऑर्गेनॉइड की यह प्रतिबंधात्मक प्रकृति विट्रो में एपिथेलियम की एपिकल सतह तक पहुंचने में चुनौतियां प्रस्तुत करती है और पोषक तत्वों के तेज और मेजबान-माइक्रोबायोटा/मेजबान-रोगजनक बातचीत जैसे जैविक तंत्रों की जांच को सीमित करती है । यहां, हम दो तरीकों का वर्णन करते हैं जो ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम के एपिकल साइड तक पहुंच की सुविधा प्रदान करते हैं और विशिष्ट आंतों के सेल प्रकारों के भेदभाव का समर्थन करते हैं। सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि कैसे ईसीएम हटाने एपिथेलियल सेल ध्रुवता के उलटा होता है और एपिकल-आउट 3 डी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। दूसरा, हम बताते हैं कि आंतों के ऑर्गेनॉइड से प्राप्त एकल कोशिका निलंबन से 2-आयामी (2डी) मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें, जिसमें परिपक्व और विभेदित कोशिका प्रकार शामिल हैं। ये तकनीकें विट्रो में बाहरी संकेतों के साथ एपिथेलियम के एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने और सटीक दवा की सुविधा के लिए एक मंच के रूप में ऑर्गेनॉइड के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए उपन्यास उपकरण प्रदान करती हैं।

Introduction

आंतों का एपिथेलियम मानव शरीर का दूसरा सबसे बड़ा एपिथेलियम है और इसमें एक ध्रुवीकृत कोशिका परत होती है जो पोषक तत्वों को तेज करने की सुविधा प्रदान करती है और पर्यावरण के अपमान के खिलाफ बाधा के रूप में कार्य करती है1. एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों के बीच यह अंतर एपिथेलियम की कोशिकाओं को अपने विविध कार्यों को पूरा करने की अनुमति देता है। एपिकल डिब्बे को ल्यूमेन के संपर्क में आता है और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं और सूक्ष्मजीवों के साथ एपिथेलियल इंटरैक्शन में मध्यस्थता करता है, जबकि पोषक तत्वों को तेज करने में भी सुविधा प्रदान करता है। बेसोलेटेरल सतह में अंतरकोशिकीय जंक्शन और सेल-मैट्रिक्स आसंजन होते हैं, जबकि प्रतिरक्षा प्रणाली और अन्य ऊतकों की कोशिकाओं के साथ इंटरफेसिंग2। ये जंक्शन तहखाने की झिल्ली से जुड़ा एक अभेद्य मोनोलेयर उत्पन्न करते हैं, जो एक बाधा के रूप में कार्य करता है और शरीर के ऊतकों को अवशोषित पोषक तत्वों को बचाता है।

इन आंतों के कार्यों को विट्रो में पुनः पुनः स्थापित करने में सक्षम संस्कृति प्रणालियों की स्थापनाचुनौतीपूर्णरही है । पारंपरिक इन विट्रो मॉडल 2D मोनोलेयर संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए कैको-2 जैसी मानव कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करते हैं। अवशोषण डिब्बे के कई कार्यों को मॉडलिंग करने में सक्षम होने के बावजूद, ये मॉडल आंतों के एपिथेलियम संरचना और कार्य को पूरी तरह से पुन: स्थापित नहीं कर सकते हैं, जो प्रमुख कार्यात्मक विशेषताओं और अनुप्रयोगों को सीमित करता है4,5।

स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न एक उन्नत 3 डी संस्कृति प्रणाली के रूप में ऑर्गेनॉइड का उद्भव जो अंग-विशिष्ट कोशिका प्रकारों को स्वयं व्यवस्थित और अंतर कर सकता है, आंतों के एपिथेलियम6के इन विट्रो अध्ययन में एक सफलता थी। आंतों के ऑर्गेनॉइड एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड होते हैं जो बेसल लैमिना जैसा दिखता है और सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों का निर्माण करता है जो इन संस्कृतियों को एपिथेलियम की एपिकोबेसल ध्रुवीयता को बनाए रखने की अनुमति देता है। ऑर्गेनॉइड एक संलग्न वास्तुकला प्रदर्शित करते हैं जिसमें एपिकल साइड ल्यूमिनल डिब्बे के संपर्क में आता है, इस प्रकार आंत की संरचना की नकल करता है। यद्यपि यह बंद संगठन अभिविन्यास-विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है, यह उन जांचों को सीमित करता है जिनके लिए एपिथेलियम के एपिकल पक्ष तक पहुंच की आवश्यकता होती है। ऑर्गेनॉइड विखंडन, ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन और मोनोलेयरसंस्कृतियोंकी पीढ़ी सहित 2डी और 3 डी दोनों में इन सीमाओं को दूर करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण अपनाए गए हैं। ऑर्गेनॉइड विखंडन संरचनात्मक संगठन के नुकसान और सेल जंक्शनों के विनाश का कारण बनता है, जो एपिथेलियम की एपिकल सतह के माध्यम के जोखिम की अनुमति देता है। यह तकनीक एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त होने पर ऑर्गेनॉइड में सुधार करने के लिए टुकड़ों की पुनर्योजी क्षमता का लाभ उठाती है और इसका उपयोग संक्रामक रोग और मेजबान-रोगजनक इंटरैक्शन8,9को मॉडल करने के लिए किया गया है। हालांकि, दोनों apical और बेसल सतह के लिए एक साथ उपयोग भी संक्रमण के लिए गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना हो सकता है ।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जो एपिकल सतह तक पहुंच की अनुमति देता है और संरचनात्मक वास्तुकला और सेल जंक्शनों दोनों को संरक्षित करता है, ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन में कारकों के माइक्रोइंजेक्शन द्वारा दर्शाया जाता है। इस विधि का बड़े पैमाने पर उपयोग मेजबान-रोगजनक बातचीत का अध्ययन करने और क्रिप्टोस्पोरिडियम10, एच पाइलोरी11 और सी डिफिसिल12 के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इसी तरह की तकनीकों का उपयोग करते हुए, आंतों के एपिथेलियम पर ई कोलाई के पीकेएस+ तनाव की उत्परिवर्तनीय क्षमता13निर्धारित की गई थी। हालांकि प्रभावी, ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन एक श्रमसाध्य और अक्षम कार्य है जो ऑर्गेनॉइड की उच्च संख्या को ध्यान में रखते हुए है जिसे मापने योग्य प्रभाव प्राप्त करने के लिए इंजेक्ट किए जाने की आवश्यकता होती है और इसलिए उच्च थ्रूपुट परख के लिए इसके आवेदन को सीमित करता है।

आंतों के ऑर्गेनॉइड के साथ हाल ही में हुई प्रगति ने 2डी मोनोलेयर ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना के लिए तरीके भी प्रदान किए हैं, जिससे उनकी एपिकल सतह14,15,16, 17को उजागर किया गया है। ये ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर आंतों के एपिथेलियम के वीवो गुणों में कुंजी को फिर से अपडेट करते हैं। वे एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल संरचना प्रदर्शित करते हैं, जिसमें विभेदित और स्टेम सेल आबादी दोनों होते हैं और क्रिप्ट-विल्लस अक्ष में विविधता को मॉडल करते हैं। जैसा कि एपिकोबासल ध्रुवीकरण को बनाए रखा जाता है, अंतर्निहित मोनोलेयर गुण एपिकल और बेसोलेटरल दोनों पक्षों की आसान पहुंच के लिए अनुमति देते हैं और मीडिया एक्सचेंज दीर्घकालिक संस्कृति के लिए आंतों के प्रवाह और अपशिष्ट हटाने की नकल कर सकते हैं। ये विशेषताएं चमकीले बातचीत पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों के लिए ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर को उत्तरदायी प्रदान करती हैं और एपिथेलियल बैरियर अखंडता और पारगम्यता18, 19के लिए एक बेहतर मॉडल प्रदान करती हैं।

अध्ययनों से पता चला है कि एपिथेलियल सेल पोलरिटी को एमडीकेके स्फेरॉइड20 , 21और हाल ही में मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड22 में ईसीएम प्रोटीन द्वारा कसकर विनियमित कियाजाताहै । ईसीएम घटकों को हटाने या सेल-मैट्रिक्स जंक्शनों में मध्यस्थता करने वाले इंटीग्रीन रिसेप्टर का अवरोध के परिणामस्वरूप आंतों के ऑर्गेनॉइड के ध्रुवता उत्क्रमण और एपिथेलियम के एपिकल साइड के माध्यमसे 22के संपर्क में आते हैं। इस दृष्टिकोण ने संक्रामक रोगों पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के हित को आकर्षित किया है क्योंकि यह 3 डी में एपिकल पक्ष तक आसान पहुंच की अनुमति देता है और इसे उच्च थ्रूपुट परख के लिए उत्तरदायी बनाता है। यहां, हम अमीवा लैब22द्वारा हाल के काम के आधार पर एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाता है जो आसानी से उनके एपिकल साइड को बेनकाब करता है। हम एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा भी तैयार करते हैं जो आंतों के ऑर्गेनॉइड से प्राप्त आंतों के 2D मोनोलेयर को कुशलतापूर्वक और पुन: उत्पन्न कर सकता है।

Protocol

मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों का व्युत्पन्न23और वर्णित किया गया था । आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम (सामग्रीकी तालिका को संदर्भित) के लिए उत्पाद सूचना पत्रक (पीआईएस) द्वारा वर्णित संस्कृति में ऑर्गेनॉइड बनाए रखा गया था।

1. आंतों के ऑर्गेनॉइड ध्रुवता का उलटा

नोट: यह अनुभाग 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड की ध्रुवता को उलटने के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करेगा। यह प्रोटोकॉल एक संस्कृति प्लेट में निलंबन में एक उजागर एपिकल सतह के साथ ध्रुवीकृत ऑर्गेनॉइड की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक अंत-बिंदु परख के रूप में है, हालांकि ऑर्गेनॉइड को इस संरचना में 2 सप्ताह से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है और एक छोटे स्टेम सेल आबादी को बनाए रखा जा सकता है जो उन्हें पारित होने पर एपिकल-इन ऑर्गेनॉइड को फिर से स्थापित करने की अनुमति देता है।

  1. विरोधी अनुयायी समाधान के साथ कल्चरवेयर और ट्यूब कोटिंग
    नोट: एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड की संख्या को अधिकतम करने और कल्चरवेयर के लिए अवांछनीय लगाव को रोकने के लिए, कल्चरवेयर की प्रीकोटिंग आम तौर पर आवश्यक है। नीचे उल्लिखित अनुभाग विरोधी अनुयायी समाधान के साथ संस्कृति और प्लास्टिकवेयर की कोटिंग का वर्णन करता है।
    1. कोट संस्कृति प्लेटों को इस प्रकार प्रोटोकॉल के निलंबन भाग में इस्तेमाल किया जाएगा।
      1. एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए विरोधी अनुयायी समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
      2. सतह और कुओं की दीवारों के पार समान रूप से समाधान फैलाने के लिए प्लेट को भंवर करें।
      3. 10 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें।
      4. एस्पिरेटर या 1 मिलीएल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से विरोधी-अनुयायी समाधान निकालें।
      5. 15mM HEPES (DMEM/F12) के साथ DMEM/F-12 के 1 ml के साथ कुओं को धोएं ।
      6. डीएमईएम/एफ-12 के 0.5 एमएल के साथ प्रत्येक धोए गए अच्छी तरह से भरें और उपयोग तक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर स्टोर करें।
        नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो लेपित प्लेटों को कम से कम 1 सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है।
    2. कोट 15 एमएल शंकु नलियों का इस्तेमाल इस प्रोटोकॉल में इस प्रकार है।
      1. 15 एमएल शंकु नली में एंटी-आबंटन समाधान के 4 एमएल जोड़ें।
      2. दीवारों की सतह के पार समान रूप से समाधान फैलाने के लिए ट्यूब को भंवर करें।
      3. 10 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
      4. ट्यूब से विरोधी अनुयायी समाधान निकालें।
      5. डीएमईएम/एफ-12 के 5 एमएल के साथ ट्यूब 1x धोएं और डीएमईएम/एफ-12 को एस्पिरेट करें । ट्यूब अब उपयोग के लिए तैयार हैं।
        नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो डीएमईएम/एफ 12 के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लेपित ट्यूबों को कम से कम एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  2. निलंबन संस्कृति द्वारा आंतों के ऑर्गेनॉइड का ध्रुवता उलटा
    नोट: नीचे दिए गए कदम मानक ईसीएम गुंबद की स्थिति के तहत पहले सुसंस्कृत आंतों के ऑर्गेनॉइड के उलटा रेखांकित करते हैं। यहां वर्णित प्रक्रियाएं 24-अच्छी प्लेट के एक कुएं के लिए हैं। यदि अन्य कल्चरवेयर का उपयोग कर रहे हैं, तो तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें।
    1. बेसमेंट झिल्ली एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स गुंबद को बाधित किए बिना प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त ऑर्गेनॉइड से माध्यम को ध्यान से हटाएं और त्यागें। सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनॉइड का आकार उलटा प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले 150-250 माइक्रोन व्यास (आमतौर पर दिन 3-5 पर) का है।
    2. प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडे वियोजन समाधान का 1 एमएल जोड़ें।
    3. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट।
    4. प्लास्टिक टिप्स को कोटिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली 15 एमएल ट्यूब में कम से कम 2 एमएल एंटी-ओर्यूजेंट सॉल्यूशन डालें।
    5. डीएमईएम/एफ-12 के कम से कम 2 एमएल को 15 एमएल ट्यूब में डालकर प्लास्टिक युक्तियों को धोने के लिए इस्तेमाल किया जाए, जो एंटी-अनुयायी समाधान के साथ कुल्ला किया जाता है।
    6. एंटी-अनुयायी समाधान के साथ 1 एमएल पिपेट टिप कोट करें, चरण 1.2.4 से एंटी-अनुयायी समाधान के साथ ट्यूब में तीन बार समाधान के 1 एमएल पाइपिंग करें।
    7. ठंडे DMEM/F-12 में टिप धोएं, कदम १.२.५ से DMEM/F-12 के साथ ट्यूब में तीन बार समाधान के 1 ml pipetting ।
    8. लेपित टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे पाइपिंग करके गुंबदों को सावधानी से उखाड़ फेंकें। ऑर्गेनॉइड को बाधित या टुकड़ा न करें, इसका ध्यान रखें।
    9. ऑर्गेनॉइड निलंबन को विरोधी-अनुयायी समाधान (चरण 1.1.1 से) के साथ इलाज की गई प्लेट में स्थानांतरित करें।
    10. थाली को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें। 70 आरपीएम पर एक जायरो शेकर का इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: कठोर झटकों से बचें, जैसे कि नमूने को भंवर से निकालना, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनॉइड विखंडन हो सकता है। बुलबुले और झाग का गठन कठोर मिलाते हुए संकेत दे सकता है।
    11. 30 मिनट के बाद, प्लेट निकालें। विरोधी-अनुयायी समाधान के साथ लेपित 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे समाधान को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    12. थाली को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर पर रखें। 70 आरपीएम पर एक जायरो शेकर का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    13. प्लेट निकालें और ऑर्गेनॉइड को गुरुत्वाकर्षण (कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट) द्वारा व्यवस्थित होने दें। ऑर्गेनॉइड तलछट को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें।
      नोट: प्लेट के व्यापक आंदोलन से बचें क्योंकि यह बसे ऑर्गेनॉइड को पुनर्व्यवित करने का कारण बन सकता है।
    14. ऑर्गेनॉइड बसने के बाद, जितना संभव हो उतना वियोजन समाधान निकालें और डीएमईएम/एफ-12 के 1.5 एमएल जोड़कर धो लें।
    15. ऑर्गेनॉइड को तलछट की अनुमति दें और जितना संभव हो उतना सुपरनेट को हटा दें। वॉश स्टेप को एक बार और दोहराएं।
      नोट: किसी भी धोने के कदम को करने से पहले ऑर्गेनॉइड तलछट को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट का निरीक्षण करें।
    16. जितना संभव हो डीएमईएम/एफ-12 को निकालें और आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के 0.5 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।
    17. अगले दिन, प्लेट को 25 से 30 डिग्री कोण पर झुकाकर आंशिक माध्यम परिवर्तन करें, और कुएं की दीवार के साथ माध्यम को हटा दें। निलंबित ऑर्गेनॉइड को हटाने के लिए ध्यान रखते हुए माध्यम के 0.4 एमएल निकालें।
    18. 0.4 एमएल आंतों ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 3 दिनों के लिए 5% सीओ2।
      नोट: 3 दिनों के बाद, अधिकांश ऑर्गेनॉइड में एक एपिकल-आउट ध्रुवता होनी चाहिए, लेकिन बड़े समुच्चय का गठन हो सकता है।
    19. यदि समुच्चय का गठन होता है, तो प्लेट के नीचे टिप के अंत को दबाते हुए 20 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कुल को कतरने के लिए एंटी-अनुयायी समाधान (जैसा कि चरण 1.2.6 और 1.2.7 में वर्णित) के साथ लेपित टिप के साथ 1 मिलीएल पिपेट का उपयोग करें।
    20. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें और अगले दिन आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम (जैसा कि धारा 1.2.17 में वर्णित है) के साथ एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करें।
    21. 2 दिनों (निलंबन में 5 दिन) के बाद, अपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड का उपयोग डाउनस्ट्रीम परख में किया जा सकता है।

2. आंतों की कोशिका 2D मोनोलेयर और एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) संस्कृतियों की स्थापना 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड से प्राप्त

नोट: यह अनुभाग आंतों के ऑर्गेनॉइड से 2डी मोनोलेयर संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करेगा। यह तकनीक कोशिका संस्कृति झिल्ली डालने वाली ऊतक संस्कृति प्लेट में एक उजागर एपिकल सतह के साथ एक कॉन्फ्ल्यूरेंट, ध्रुवीकृत मोनोलेयर संस्कृति स्थापित करने का लाभ प्रदान करती है। हालांकि मोनोलेयर जलमग्न, मोनोलेयर प्रारूप में अंतर करना शुरू कर देगा, लेकिन संगम तक पहुंचने के बाद एक अली संस्कृति में स्विच करके मोनोलेयर का अतिरिक्त भेदभाव हासिल किया जा सकता है। दोनों मोनोलेयर और बाद में अली प्रोटोकॉल अंत बिंदु परख के रूप में करना है और हालांकि मोनोलेयर संस्कृति एक छोटे स्टेम सेल आबादी का कहना है, न तो कुशलता से विभाजित किया जा सकता है और यह स्थापित होने के बाद पारित ।

  1. आंतों मोनोलेयर संस्कृति के लिए मीडिया और प्लेटें तैयार करना
    1. मोनोलेयर संस्कृति के लिए निर्माता द्वारा उल्लिखित आंतों के ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम तैयार करें (सामग्रियों की सूचीदेखें)। वाई-27632 को केवल माध्यम की मात्रा में जोड़ें जिसका उपयोग 10 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता पर 1 सप्ताह के भीतर किया जाएगा। यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. प्री-वार्म ट्रिप्सिन ईडीटीए (0.05%) से 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    3. मोनोलेयर संस्कृतियों को बोने से कम से कम 2 घंटे पहले, इस प्रकार 2% ईसीएम कोटिंग समाधान तैयार करें।
      1. बर्फ पर ईसीएम गल और ठंड, बाँझ PBS के लिए 1:50 जोड़ने के लिए एक 2% समाधान तैयार करते हैं । उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक 6.5 मिमी (0.33 सेमी2)सेल कल्चर झिल्ली डालने के ऊपरी कुएं में 100 माइक्रोन जोड़ने के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार करें। बड़ी या छोटी संस्कृतियों के लिए मात्रा को उचित रूप से समायोजित करें।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से 100 माइक्रोन जोड़ें और प्रत्येक प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि आवश्यक न हो (सीडिंग से कम से कम 2 घंटे पहले)।
  2. मोनोलेयर पीढ़ी और संस्कृति के लिए आंतों के ऑर्गेनॉइड को अलग करना
    1. इनक्यूबेटर से ऑर्गेनॉइड संस्कृति कुओं की एक उपयुक्त संख्या को हटा दें। विभिन्न संस्कृतिवेयर के लिए फसल के लिए कुओं की अनुशंसित संख्या के लिए तालिका 1 का उल्लेख करें।
    2. ईसीएम गुंबद को परेशान किए बिना ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों से सभी माध्यमों को एस्पिरेट करें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से वियोजन समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
    4. कम से कम 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर इनक्यूबेट करें।
    5. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, गुंबद को बाधित करने और ऑर्गेनॉइड को छोड़ने के लिए सख्ती से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    6. 15 एमएल शंकु नली में प्रत्येक कुएं से निलंबित ऑर्गेनॉइड पूल करें। कोमल आंदोलन या कमाल के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल की मात्रा तक, कई कुओं को बोने के लिए ऑर्गेनॉइड को इस चरण में एकत्र किया जा सकता है।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    8. सुपरनेट को निकालें और त्यागें। ऑर्गेनॉइड को रीसस्ट करने के लिए 5 एमएल आइस-कोल्ड डीएमईएम/एफ-12 जोड़ें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर फिर से मिक्स और सेंट्रलाइज करें।
    10. सुपरनेट को एस्पिरेट करें, जितना संभव हो उतना हटाएं, सावधान रहें कि गोली को परेशान न करें।
      नोट: कुछ अवशिष्ट ECM गोली में रह सकते हैं; हालांकि, यह ऑर्गेनॉइड के वियोजन को काफी प्रभावित नहीं करना चाहिए।
    11. ऑर्गेनॉइड को रीसस्ट करने के लिए प्री-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) का 1 मिलीएल जोड़ें। एक भी निलंबन सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। बड़ी संख्या में कोशिकाओं के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए के अतिरिक्त 1 एमसीएल तक जोड़ें, या यदि ईसीएम की एक महत्वपूर्ण मात्रा बनी हुई है।
    12. 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    13. ऑर्गेनॉइड को जितना संभव हो उतना बाधित करने के लिए 1 एमएल पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। ऑर्गेनॉइड को एकल कोशिकाओं या छोटे टुकड़ों में पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए। यदि बड़े टुकड़े या पूरे ऑर्गेनॉइड अच्छी तरह से पाइपिंग के बाद रहते हैं, तो ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ इनक्यूबेशन को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 3-5 मिनट के लिए जारी रखें।
      नोट: 20 मिनट से अधिक समय तक ट्रिप्पसिन-ईडीटीए के साथ इनक्यूबेट न करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता में वृद्धि हो सकती है।
    14. एक बार ऑर्गेनॉइड पर्याप्त रूप से अलग हो जाते हैं, तो डीएमईएम/एफ-12 (उदाहरण के लिए, 1 एमएल डीएमईएम/एफ-12 प्रति एमएलए ट्रिप्पसिन-ईडीटीए) की बराबर मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। इस कदम में डीएमईएम/एफ-12 में 10% एफबीएस जोड़कर ट्राइप्सिन-ईडीटीए को निष्क्रिय करें।
    15. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज टुकड़े।
    16. यदि वियोजन ऑर्गेनॉइड गोली करने में विफल रहते हैं, तो यह आम है और अलग कोशिकाओं द्वारा जारी बलगम के संचय के कारण हो सकता है। इस मामले में, कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और उन्हें फिर से 200 x g पर 5 मिनट के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं।
    17. ध्यान से जितना संभव हो उतना सुपरनेट को हटा दें, केवल सेल पेलेट छोड़ दें।
    18. प्रत्येक अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त करने के लिए आंतों ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम (10 माइक्रोन वाई-27632 के साथ) के 100 माइक्रोल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। बड़े या छोटे अच्छी तरह से आकार के लिए मात्रा को उचित रूप से समायोजित करें।
    19. इनक्यूबेटर (चरण 3.1.4 में तैयार) से लेपित प्लेटों को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से अतिरिक्त ईसीएम को हटा दें।
    20. प्रत्येक सेल संस्कृति डालने के ऊपरी कुएं में सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें।
    21. प्रत्येक सेल कल्चर डालने के निचले कुएं में आंतों के ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
    22. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर इनक्यूबेट।
    23. हर 2 से 3 दिन में ऊपरी और निचले दोनों कुओं में मीडियम को बदलें। मोनोलेयर संस्कृतियों को 7 दिनों के भीतर व्यापकता तक पहुंचना चाहिए और अक्सर 2-3 दिनों के भीतर गैस्लुसी तक पहुंच जाएगा।
  3. एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) संस्कृति की स्थापना
    नोट: यदि वांछित, एक जलमग्न आंतों मोनोलेयर संस्कृति के आगे भेदभाव एक अली संस्कृति के लिए जलमग्न मोनोलेयर संस्कृति संक्रमण से पूरा किया जा सकता है । यह संस्कृति विधि विभेदित कोशिका प्रकारों की संख्या में वृद्धि की अनुमति देगी, विशेष रूप से गुप्त वंश की कोशिकाओं, जैसे गोबलेट और एंटेरोएंडोक्राइन कोशिकाएं।
    1. एक सेल संस्कृति में एक मोनोलेयर संस्कृति स्थापित करें जैसा कि ऊपर चरण 2.2.1-2.2.2.23 में वर्णित है और कम से कम 4 दिनों के लिए 100% सम्मिलन पर इस संस्कृति को बनाए रखता है।
    2. अली संस्कृति स्थापित करने के लिए, ऊपरी और निचले कुओं से मध्यम को हटा दें। ऊपरी कुएं को खाली छोड़ते हुए, निचले कुएं में ताजा आंतों ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम (वाई-27632 के साथ) जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट ।
    4. हर 2-3 दिनों में निचले कुएं में माध्यम को बदलें और मोनोलेयर को कम से कम 1 सप्ताह के लिए अंतर करने की अनुमति दें।
    5. यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त बलगम संचय को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ ऊपरी कुएं को कुल्लाएं।
      इन परिस्थितियों में, अली संस्कृति को कम से कम 2-3 सप्ताह तक बनाए रखा जा सकता है।

Representative Results

ऑर्गेनॉइड बायोप्सी नमूनों से पहले23 और आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के लिए पीआईएस में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद बायोप्सी नमूनों से उत्पन्न हुए थे (सामग्री की तालिकादेखें)। चित्रा 1A,लेफ्ट पैनल,आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के साथ एक गुंबद में सुसंस्कृत आंतों के ऑर्गेनॉइड के फेनोटाइप को दर्शाता है। इन संस्कृति स्थितियों में, ऑर्गेनॉइड एक पतली (10-25 माइक्रोन) एपिथेलियम द्वारा परिभाषित एक सिस्टिक आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं जो एक ल्यूमेन(चित्रा 1A,राइट पैनल)को संलग्न करता है। इस स्तर पर, आंतों के एपिथेलियम के एपिकल साइड को ल्यूमेन का सामना करना पड़ता है, जबकि बेसोलेटरल पक्ष आसपास के एक्सपेरि़एंशल मैट्रिक्स से संपर्क करता है। जब अधिकांश ऑर्गेनॉइड वांछित आकार तक पहुंच गए, तो बाह्य मैट्रिक्स को हटा दिया गया, और ऑर्गेनॉइड को निलंबन में सुसंस्कृत किया गया। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के लिए सेलुलर बाध्यकारी की हानि ऑर्गेनॉइड में एक उलटा प्रक्रिया को ट्रिगर करती है, जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम की ध्रुवता को उलट दिया जाता है, जो एपिथेलियम के एपिकल पक्ष को विकास माध्यम में उजागर करता है और बेसोलेटरल पक्ष को आंतरिक बनाता है।

कुछ संस्कृतियों में, निलंबन कुल और फ्यूज में ऑर्गेनॉइड, एक प्रभाव जो पहले 3 दिनों(चित्रा 1B, बाएंपैनल) के दौरान अधिक गहरा होताहै। एक कतरनी तकनीक के आवेदन ऑर्गेनॉइड की टुकड़ी और न्यूनतम पुनर्अगगरिण(चित्रा 1 बी,सही पैनल)के साथ दिनों के लिए संस्कृतियों की निरंतरता की अनुमति देता है ।

ईसीएम गुंबदों में सुसंस्कृत आंतों के ऑर्गेनॉइड का विस्तार जारी है(चित्रा 1C, लेफ्टपैनल) और लुमेन(चित्रा 1C,राइटपैनल)के आसपास के एपिथेलियम के बेसोटेलरल साइड पर छोटे क्रिप्ट्स जैसी माध्यमिक नवोदित संरचनाओं के सहज गठन का प्रदर्शनकरतेहैं। इसके साथ ही, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स की अनुपस्थिति में 5 दिनों तक बनाए गए ऑर्गेनॉइड निलंबन(चित्रा 1D, लेफ्टपैनल) में विकसित होतेरहते हैं। ध्रुवता के उलटा एपिथेलियम के मोटा (30-40 माइक्रोन) की विशेषता है जो ऑर्गेनॉइड के मूल और विभिन्न प्रकार के मोर्फोलोजी की उपस्थिति को घेरे हुए है: विस्तारित(चित्रा 1D,सही पैनल और अनुपूरक चित्रा 1 ए),सिस्टिक(अनुपूरक चित्रा 1बी),और अनियमित(अनुपूरक चित्रा 1C)। यह अक्सर ऑर्गेनॉइड के भीतर चमकदार अंतरिक्ष के सिकुड़ने के साथ संयुक्त होता है, जो उनके समग्र आकार को प्रभावित करता है।

आंतों के विशिष्ट ध्रुवता मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके कुशल उलटफेर की भी पुष्टि की जा सकती है। एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन की ओर नाभिक का एक अलग स्थानीयकरण दिखाते हैं, जैसा कि 4′6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (DAPI) संकेत द्वारा इंगित किया गया है। विल्लिन(चित्रा 2 ए) और जेडओ-1 (चित्रा2बी)जैसे एपिकल मार्कर की अभिव्यक्ति का पता एपिथेलियम के बाहरी हिस्से में लगाया जाता है जो माध्यम के संपर्क में आता है। यह स्थानीयकरण ईसीएम में सुसंस्कृत आंतों के ऑर्गेनॉइड में देखे गए लोगों के विपरीत है। न्यूक्लियी (DAPI), VILLIN(चित्रा 2C),और ZO-1(चित्रा 2D)के लिए दाग वाले एक्सासेलुलर मैट्रिक्स एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड एक एपिकोबेसल ध्रुवीकरण प्रदर्शित करते हैं जहां एपिकल साइड ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन का सामना कर रहा है।

आंतों के ऑर्गेनॉइड के कुशल ध्रुवता उलटा प्राप्त करने के लिए ईसीएम को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता होती है। कभी-कभी, ईसीएम अवशेषों से घिरे निलंबन संस्कृतियों में पाए जाने वाले ऑर्गेनॉइड का एक हिस्सा, एक सिस्टिक आकृति विज्ञान दिखाता है जो एपिथेलियम(अनुपूरक चित्रा 2 ए)के ध्रुवीयता उलटा में विफलता का सुझाव देता है। इन ऑर्गेनॉइड पर किए गए इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग का विश्लेषण, एपिथेलियम के साथ नाभिक (डीएपीआई) की बेसोलेटरल स्थिति और एपिकल साइड में जेडओ-1 की अभिव्यक्ति का सबूत प्रदान करता है जो ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन(सप्लीमेंट्री फिगर 2 बी)का सामना करता है कि अधूरी ईसीएम हटाने से ईटीएम-एम्बेडेड ऑर्गेनॉइड के समान तरीके से अचिक्षित ध्रुवीयता को बनाए रखने का कारण बनता है।

आंतों मोनोलेयर संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप सीडिंग के 7 दिनों के भीतर एक एक्लेयर संस्कृति होती है और संस्कृति अक्सर 2-3 दिनों के भीतर संगम तक पहुंच जाती है। सफलता के प्रमुख निर्धारकों में से एक मोनोलेयर को बीज करने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या और गुणवत्ता है। चित्रा 3 ए,लेफ्ट पैनल 6.5 मिमी सेल कल्चर झिल्ली डालने में लगभग 150,000 कोशिकाओं के आदर्श सीडिंग घनत्व का एक उदाहरण प्रदान करता है। यह संख्या तय नहीं है और दाता और स्रोत ऑर्गेनॉइड संस्कृति की गुणवत्ता के आधार पर अत्यधिक परिवर्तनशील हो सकती है; इसलिए, इन चरों के आधार पर सेल नंबर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि सीडिंग घनत्व बहुत कम है, या खराब गुणवत्ता(चित्रा 3 ए,राइट पैनल) का है, तो एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर संस्कृति बनाने के लिए पर्याप्त अनुलग्नक नहीं हो सकते हैं।

एक बार मोनोलेयर(चित्रा 3B) स्थापितहो जाने के बाद, कोशिकाएं तंग जंक्शन बनाती हैं, जिससे एक कोबलस्टोन उपस्थिति(चित्रा 3B, लेफ्टपैनल)बनती है। यदि वे एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर(चित्रा 3 बी,राइट पैनल)बनाने में विफल रहते हैं, तो मोनोलेयर की उपस्थिति अक्सर अच्छी गुणवत्ता वाले सेल अटैचमेंट के क्षेत्रों के साथ "बद" होगी, लेकिन इन क्षेत्रों के बीच बड़े अंतराल के साथ। ये संस्कृतियां बेसल और एपिकल डिब्बों के बीच एक कार्यात्मक बाधा प्रदान नहीं करती हैं और वर्णित परखों के लिए उपयुक्त नहीं हैं। एक कॉन्फ्ल्यूंट मोनोलेयर एपिथेलियम के एपिकल साइड की ओर अपनी विल्लिन युक्त ब्रश सीमा को उन्मुख करता है, इसके नाभिक कोशिका के बेसोलेटरल पोल(चित्रा 4B)की ओर तैनात हैं। कोशिकाओं के बीच में, जेडओ-1 सहित बहु-प्रोटीन परिसरों से मिलकर इंटरसेलुलर जंक्शन(चित्रा 4B)बनते हैं। उनकी उपस्थिति एपिथेलियल संस्कृति के बाधा समारोह प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है।

एक बार एक कंप्लेंट, एक अली संस्कृति के लिए संक्रमण संस्कृति के आगे भेदभाव लातीहै (चित्रा 3C)। छोटी, गोल गोबलेट कोशिकाएं दिखाई देती हैं और मोनोलेयर स्वयं अधिक मुड़ा हुआ रूप लेता है। यद्यपि गोबलेट कोशिकाएं जलमग्न संस्कृति(चित्रा 4 ए)के एपिथेलियम के भीतर मौजूद हैं, वे अली भेदभाव के बाद अधिक प्रमुख हैं। एपिथेलियम के भीतर मौजूद गोबलेट कोशिकाएं बलगम को स्रावित करती हैं, जिससे एपिथेलियम के शीर्ष पर धुंधला रूप होता है। गोबलेट कोशिकाओं और स्रावित बलगम को स्रावित म्यूसिन प्रोटीन, MUC2(चित्रा 4A,सी और डी)के लिए धुंधला करके कल्पना की जा सकती है और गोबलेट सेल आबादी में वृद्धि MUC2 अभिव्यक्ति(अनुपूरक चित्रा 3 ए)में वृद्धि से मापी जा सकती है। इस जेल जैसी बलगम परत को हटाना आवश्यक नहीं है और यह एपिथेलियम की सतह से चिपक जाएगा और बार-बार धोता के बाद रहेगा। यदि हटाने की आवश्यकता है, तो संस्कृति को म्यूकोलिटिक यौगिक के साथ धोना, जैसे 10 m N-एसीटाइल सिस्टीन या 50 माइक्रोग्राम/एमएल डीटीटी अतिरिक्त बलगम को हटा देता है। गोबलेट सेल आबादी में वृद्धि के अलावा, अली इंटरफेस एंटेरोएंडोक्राइन कोशिकाओं (जैसा कि CHGA अभिव्यक्ति द्वारा इंगित)(अनुपूरक चित्रा 3B)और परिपक्व आंत्रसाइट्स (जैसा कि KRT20 अभिव्यक्ति द्वारा इंगित)(अनुपूरक चित्रा 3 सी)की उपस्थिति में वृद्धि करता है।

Figure 1
चित्रा 1:एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के चरण। (A)दिन 4 में वांछित आकार के ऑर्गेनॉइड के साथ एक गुंबद की प्रतिनिधि छवियां (लेफ्ट पैनल, स्केल बार = 500 माइक्रोन)। ऑर्गेनॉइड पतले दीवारों वाले होते हैं, जिसमें एक खुले चमकदार डिब्बे (राइट पैनल, स्केल बार = 100 माइक्रोन) होते हैं। (ख)निलंबन में 3 दिनों के बाद व्यापक एकत्रीकरण के साथ एक अच्छी तरह से प्रतिनिधि छवि (बाएं पैनल, स्केल बार = २०० μm) । झुरमुट टुकड़े की छवि सीधे कतरनी के बाद (सही पैनल, स्केल बार = २०० μm) । (ग)7 दिन में गुंबद में आंतों के ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवि । ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम के बेसोलेटरल साइड पर छोटी कलियों के गठन के साथ एक विस्तारित ल्यूमेन प्रदर्शित करते हैं (बाएं 20x आवर्धन, चिह्नित क्षेत्र का दाएं 100x आवर्धन, स्केल बार = 200 माइक्रोन)। (घ)ईसीएम हटाने के बाद आंतों के ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवि और बाद में निलंबन संस्कृति 5 दिनों के लिए । ऑर्गेनॉइड एक घने एपिथेलियम के साथ एक घने आकृति विज्ञान प्राप्त करते हैं और माध्यम के लिए अपने एपिकल साइड को बेनकाब करते हैं। (बाएं 20x आवर्धन, चिह्नित क्षेत्र का दाएं 100x आवर्धन, स्केल बार = 200 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:आंतों केऑर्गेनॉइड में सेल पोलरिटी मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला। एपिकल-आउट(ए, बी),और एपिकल-इन(सी, डी)उन्मुख आंतों के ऑर्गेनॉइड एपिकल मार्कर जेडओ-1 और विललिन के साथ और एपिथेलियल मार्कर ई-कैडेरिन (लाल) के साथ दाग रहे थे। डीएपीआई (नीला) का उपयोग नाभिक की कल्पना करने के लिए किया जाता था। बाएं पैनल 25x आवर्धन पर ली गई छवियों को प्रदर्शित करते हैं और दाएं पैनल 63x आवर्धन पर विभिन्न ऑर्गेनॉइड की छवियों को प्रदर्शित करते हैं (केवल पैनल सी एक ही ऑर्गेनॉइड के 25x और 63x आवर्धन प्रदर्शित करता है)। (A)विलेलिन (ग्रीन) और ई-कैडेरिन (लाल) से सना हुआ एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड माध्यम के लिए एपिकल साइड के एक्सपोजर को इंगित करते हैं । (ख)एफी-1 (ग्रीन) और ई-कैडेरिन (लाल) से सना हुआ एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड तंग जंक्शनों की उपस्थिति और एपिकोबाकल ध्रुवीयता के प्रतिवर्तन को दर्शाते हैं । (ग)मैट्रिगेल एम्बेडेड आंतों के ऑर्गेनॉइड विलिन (ग्रीन) और ई-कैडेरिन (लाल) के साथ दागदार ऑर्गेनॉइड ल्यूमेन का सामना करने वाले एपिकल साइड को दिखाते हैं । (घ)मैट्रिगेल एम्बेडेड आंतों के ऑर्गेनॉइड जो जेडओ-1 (हरे) और ई-कैडेरिन (लाल) से सना हुआ है, जो ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन का सामना कर रहे एपिकल टाइट जंक्शनों की उपस्थिति को दर्शाता है । (स्केल बार = 100 माइक्रोन)। ऑर्गेनॉइड इम्यूनोफ्लोरेसेंस से दाग रहे थे और पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल24,25का उपयोग करके चित्रित किए गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:आंतों की मोनोलेयर संस्कृतियों की स्थापना। (A)0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के साथ उपचार के बाद 3डी ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवि। बोने मोनोलेयर संस्कृतियों की तैयारी में ऑर्गेनॉइड को एकल कोशिकाओं या छोटे सेल-झुरमुटों से अलग किया जाता है। बाएं पैनल: मोनोलेयर संस्कृति के लिए इष्टतम सीडिंग घनत्व का उदाहरण, 6.5 मिमी सेल कल्चर झिल्ली डालें पर प्रति 100 माइक्रोन लगभग 150,000 कोशिकाएं। राइट पैनल: 6.5 मिमी सेल कल्चर झिल्ली डालने पर प्रति 100 माइक्रोन < 50,000 कोशिकाओं पर उप-मौजूदा सीडिंग घनत्व का उदाहरण। (ख)एक जलमग्न मोनोलेयर संस्कृति की प्रतिनिधि उज्ज्वल छवि । बाएं पैनल: विशेषता कोबलस्टोन उपस्थिति के साथ 100% कॉन्फ्लोटेंट परत। राइट पैनल: लगभग 50% कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर। आंतों की स्टेम कोशिकाओं के निरंतर प्रसार के कारण समय के साथ मोनोलेयर (धराशायी रेखा द्वारा इंगित) में देखा गया अंतराल। (ग)7 दिनों में एक विभेदित अली संस्कृति की प्रतिनिधि उज्ज्वल छवि । (स्केल बार = 200 माइक्रोन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:मोनोलेयर संस्कृतियों में विभेदित कोशिका मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला। (ए)म्यूसिन प्रोटीन MUC2 के लिए एक जलमग्न मोनोलेयर संस्कृति के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला की जेड-स्टैक छवि, मोनोलेयर संस्कृति (ग्रीन = MUC2, ब्लू = DAPI) के भीतर गोबलेट कोशिकाओं की उपस्थिति का संकेत है । (ख)जलमग्न मोनोलेयर के इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग की जेड-स्टैक छवि । एपिथेलियम के एपिकल एंड के साथ विलेलिन स्टेनिंग (हरा) ब्रश सीमा की उपस्थिति को इंगित करता है और जेडओ-1 धुंधला (लाल) कोशिकाओं (ब्लू = डीएपीआई) के बीच तंग जंक्शनों की उपस्थिति को इंगित करता है। (ग)म्यूसिन प्रोटीन MUC2 के लिए एक अली-विभेदित मोनोलेयर संस्कृति के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग की जेड-स्टैक छवि, अली मोनोलेयर संस्कृति (ग्रीन = MUC2, ब्लू = DAPI) के भीतर गोबलेट कोशिकाओं की काफी बड़ी संख्या की उपस्थिति का संकेत देती है। (घ)अली-विभेदित मोनोलेयर संस्कृति का क्रायोसेक्शन, MUC2 (ग्रीन) और ई-कैडेरिन (लाल) की उपस्थिति के लिए दाग, एपिथेलियम में गोबलेट कोशिकाओं की उपस्थिति और मोनोलेयर संस्कृति के एपिकल साइड के साथ बलगम के स्राव का संकेत देता है। (स्केल बार = 200 माइक्रोन)। मोनोलेयर संस्कृतियों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस से दाग दिया गया था और पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल26,27का उपयोग करके चित्रित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: संस्कृति निलंबन में एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड के फेनोटाइप का स्पेक्ट्रम। (A,B,C) ईसीएम हटाने के 5 दिन बाद निलंबन में बनाए गए आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉर्फोलोजी की अतिरिक्त प्रतिनिधि छवियां। ऑर्गेनॉइड ध्रुवता उलटा हो गया है। ऑर्गेनॉइड एक मोटा एपिथेलियम के साथ अधिक घने हो गए हैं और ऑर्गेनॉइड के एपिकल साइड को जावक का सामना करना पड़ रहा है। ऑर्गेनॉइड विभिन्न प्रकार के मॉर्फोलोजी दिखा सकते हैं: विस्तारित(ए),सिस्टिक(बी),और अनियमित(सी)। (स्केल बार = 100 माइक्रोन)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: आंतों के ऑर्गेनॉइड निलंबन संस्कृतियों में अवशिष्ट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम की उपस्थिति में ध्रुवता को पलटने में विफल रहते हैं। (A)अधूरी ईसीएम हटाने की प्रतिनिधि छवि और ऑर्गेनॉइड की ध्रुवीकरण को पलटने में विफलता । मैट्रिगेल अवशेष ऑर्गेनॉइड के आसपास मौजूद होते हैं और एपिथेलियम पोलरिटी ओरिएंटेड एपिकल-इन को बनाए रखने में योगदान देते हैं। ऑर्गेनॉइड लुमेन (स्केल बार = 200 माइक्रोन) के आसपास एक पतली एपिथेलियम के साथ एक सिस्टिक आकृति विज्ञान दिखाते हैं। (ख)निलंबन संस्कृति की स्थिति में पाए जाने वाले एक गैर-उल्टे ऑर्गेनॉइड की प्रतिनिधि छवि। नाभिक (नीला = DAPI) और ई-CADHERIN (लाल) बेसोटेरल पक्ष के लिए तैनात हैं, ZO-1 (हरा) apical पक्ष है कि ऑर्गेनॉइड के ल्यूमेन का सामना करने के लिए व्यक्त की है । (स्केल बार = 100 माइक्रोन)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 3: मोनोलेयर संस्कृतियों में विभेदित सेल मार्कर की जीन अभिव्यक्ति। (A,B,C) क्यूपीसीआर के माध्यम से स्थापित आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के साथ उगाई जाने वाली 3डी ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम के सापेक्ष आंतों के ऑर्गेनॉइड विभेदन माध्यम में उत्पन्न जलमग्न और अली-विभेदित मोनोलेयर संस्कृति में MUC2, CHGAऔर KRT20 की अभिव्यक्ति। एक जलमग्न मोनोलेयर संस्कृति की स्थापना प्रत्येक विभेदित सेल मार्कर की अभिव्यक्ति को बढ़ाती है; हालांकि, अली संस्कृति के रूप में भेदभाव प्रत्येक मार्कर की अभिव्यक्ति को तेजी से बढ़ाता है। त्रुटि सलाखों = +/-SEM. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

मोनोलेयर कल्चरवेयर आंतों के ऑर्गेनॉइड के कुओं की संख्या फसल के लिए (50 माइक्रोन गुंबद से/
6.5 मिमी ट्रांसवेल डालने 1 - 2 कुएं
12 मिमी ट्रांसवेल डालने 3 - 4 कुओं
6-अच्छी थाली 6 - 8 कुओं
24-अच्छी तरह से थाली 3 - 4 कुओं
96-अच्छी थाली 1 - 2 कुएं

तालिका 1: विभिन्न संस्कृति के बर्तनों के लिए फसल के लिए आंतों के ऑर्गेनॉइड के कुओं की संख्या

Discussion

एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड मॉडल शक्तिशाली प्लेटफ़ॉर्म बन गए हैं जिनका उपयोग ऊतक संगठन, रोग प्रगति को मॉडल करने औरचिकित्सीय23, 28,29की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड माइक्रोइंजेक्शन ने संक्रामक रोगों के मॉडलिंग की ऑर्गेनॉइड की क्षमता में मूल्य जोड़ा है क्योंकि यह मेजबान एपिथेलियम के एपिकल साइड के साथ रोगजनक बातचीत की अनुमति देता है। माइक्रोइंजेक्शन तकनीकों में हाल ही में हुई प्रगति ने ऑर्गेनॉइड में इंजेक्शन की गति को अनुकूलित किया है और प्रति घंटे 90 इंजेक्शन ऑर्गेनॉइड तक की दर हासिल की है। इंजेक्शन ऑर्गेनॉइड में बाधा कार्य को संरक्षित किया गया था, और लुमेन के अंदर कम ऑक्सीजन एकाग्रता अनिवार्य-एनारोबिक इंजेक्शन बैक्टीरिया30के अस्तित्व के लिए अनुमति दी गई थी। हालांकि, अध्ययनों ने एक ही कुएं के भीतर ऑर्गेनॉइड आबादी में विषमता की उपस्थिति को नोट किया है। ये अंतर आकार और आकार31में देखा गया , प्रमुख जीन32के अभिव्यक्ति स्तर के साथ - साथ प्रसार दर33. फोरस्कोलिन और पीजीई2, या हैजा टॉक्सिन जैसे यौगिकों के लिए एक ही ऑर्गेनॉइड आबादी के भीतर अंतर प्रतिक्रियाओं को भी28,33वर्णित किया गया है। ये परिणाम अध्ययन में उच्च ऑर्गेनॉइड नंबरों की आवश्यकता को उजागर करते हैं और ल्यूमिनल इंजेक्शन के उपयोग को सीमित करते हैं।

पारंपरिक ऑर्गेनॉइड संस्कृति हाइड्रोगेल में ऑर्गेनॉइड के एनकैप्सुलेशन और प्रचार पर आधारित है। हालांकि, हाइड्रोगेल प्रसार पर सीमाएं पैदा कर सकते हैं और एकाग्रता ढाल पेश कर सकते हैं, जो विषमता34को बढ़ा सकते हैं। इसके अलावा, उच्च परिवर्तनशीलता का दस्तावेजीकरण किया गया है, न केवल संस्कृतियों और दानदाताओं के बीच बल्कि व्यक्तिगत प्रायोगिक परिस्थितियों में भी । दाता स्रोत, हाइड्रोगेल के जैव रासायनिक गुण, और संस्कृति प्रणाली के रूप में ऑर्गेनॉइड की आंतरिक विषमता महत्वपूर्ण कारक हैं जो प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में प्राप्त परिणामों की प्रजनन क्षमता को सीमित कर सकते हैं। यहां वर्णित दोनों विधियां एपिथेलियम के एपिकल पक्ष को उजागर करने का एक सरल साधन प्रदान करती हैं, जिससे यौगिकों और ब्याज के रोगजनकों के मॉडलिंग के लिए सीधे संस्कृति माध्यम में जोड़कर अनुमति मिलती है। हाइड्रोजेल उपयोग में कमी त्रुटि के तकनीकी स्रोतों से प्रायोगिक परिवर्तनशीलता को सीमित कर सकती है।

एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनॉइड ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम की प्रमुख विशेषताओं को बनाए रखते हैं और उनकी स्केलेबिलिटी उन्हें 2डी मोनोलेयर की तुलना में उच्च थ्रूपुट असाक के लिए अधिक उत्तरदायी बनाती है। हालांकि, चूंकि ऑर्गेनॉइड अपनी 3डी संरचना को बनाए रखते हैं, बेसल पक्ष की पहुंच सीमित है और दोनों पक्षों तक पहुंच की आवश्यकता वाले अध्ययनों में एक साथ बाधा डाल सकती है।

हमने दिखा दिया है कि आंतों के ऑर्गेनॉइड का ध्रुवता उलटा ईसीएम के कुशल और पूर्ण हटाने पर निर्भर करता है, जबकि ऑर्गेनॉइड की अक्षुण्ण संरचना को भी संरक्षित करता है। ईसीएम को हटाने के लिए वियोजन समाधान का उपयोग और प्लास्टिकवेयर के ऑर्गेनॉइड के पालन को रोकने के लिए एंटी-अनुयायी समाधानदोनोंने सीओ, जेवाई और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल की समग्र दक्षता को सुधारने में योगदान दिया, विशेष रूप से डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उत्पादित एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड की संख्या के संबंध में।

इसके अलावा, हमने देखा कि हमारा प्रोटोकॉल 250 माइक्रोन से छोटे ऑर्गेनॉइड के अधिक कुशल विलोपन का समर्थन करता है और बड़े ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने से पिपटिंग के कारण विखंडन के कारण कम ऑर्गेनॉइड आउटपुट हो सकता है। व्यापक बोर युक्तियां, जैसे कि सामग्री की तालिकामें इंगित किए गए, बड़े ऑर्गेनॉइड के उपयोग की अनुमति दे सकते हैं। हालांकि, कम लागू यांत्रिक बल के कारण मानक युक्तियों की तुलना में ईसीएम वियोजन में चौड़े बोर युक्तियां कम प्रभावी होती हैं। इसलिए, बड़े ऑर्गेनॉइड के साथ काम करते समय पर्याप्त व्यवधान और सभी ईसीएम अवशेषों को पूरी तरह से हटाने के लिए 1.2.9-1.2.11 के कदमों को दोहराने की आवश्यकता हो सकती है।

निलंबन में ऑर्गेनॉइड कम से कम 2 सप्ताह तक जीवित रह सकते हैं। इस अवधि के बाद, हमने आकृति विज्ञान परिवर्तन और कोशिका मृत्यु की बढ़ी हुई संख्या देखी। एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड22 में प्रोलाइफिंग कोशिकाओं की उपस्थिति आंतों के ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में एपिकल-इन की पुनः स्थापना के लिए अनुमति देती है। यह एकल कोशिकाओं के लिए एपिकल-आउट ऑर्गेनॉइड को अलग करके और उन्हें आंतों के ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम के साथ ईसीएम में एम्बेड करके प्राप्त किया जा सकता है।

निलंबन संस्कृतियों में आंतों के ऑर्गेनॉइड की स्थापना का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल में अक्सर सामना करने वाली एक सीमा बड़े समुच्चय की पीढ़ी है। यह दक्षता, रूपात्मक विशेषताओं की प्रजनन क्षमता, यौगिकों के लिए पारिम्यता और पैराक्रिन सिग्नलिंग जैसे कई चरों को प्रभावित करता है। सीओ, जेवाई और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान, यहां हम निलंबन में 3 दिनों के बाद कतरनी के बिना सभी निलंबित ऑर्गेनॉइड के कम से कम 97% की ध्रुवीयता उलटा प्राप्त करने की पुष्टि करते हैं। हालांकि, प्रकाशन के विपरीत, हमने बड़े समुच्चय के गठन को कम करने और उपज में वृद्धि करने के लिए एक यांत्रिक वियोजन चरण शुरू किया है। चूंकि यह प्रक्रिया ऑर्गेनॉइड के एपिथेलियम को नुकसान पहुंचा सकती है, इसलिए हमने ऑर्गेनॉइड इनक्यूबेशन अवधि को अतिरिक्त 2 दिनों के लिए बढ़ा दिया ताकि पूर्ण एपिथेलियम वसूली की अनुमति दी जा सके और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता वाली संस्कृतियों को सुनिश्चित किया जा सके। एक इनक्यूबेटर शेखर या एक स्पिनर फ्लास्क के उपयोग के साथ लगातार आंदोलन की शुरूआत संभावित रूप से संलयन घटनाओं को कम कर सकती है, विखंडन को कम कर सकती है, और ऑक्सीजन में वृद्धि कर सकती है। ये वैकल्पिक दृष्टिकोण संस्कृतियों को लंबी अवधि के लिए बनाए रख सकते हैं, सेल मृत्यु को कम कर सकते हैं, और एपिकल-आउट आंतों के ऑर्गेनॉइड के आगे भेदभाव की अनुमति दे सकते हैं।

ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न 2डी मोनोलेयर की स्थापना उल्टे ध्रुवीयता ऑर्गेनॉइड की तुलना में कई फायदे और नुकसान प्रदान करती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर संस्कृति की तेजी से स्थापना के लिए अनुमति देता है, आमतौर पर, 7 दिनों से कम समय में और संस्कृतियों के दीर्घकालिक रखरखाव का विकल्प समय की विस्तारित अवधि (10 सप्ताह तक) के लिए। प्रोटोकॉल और मीडिया यहां इस्तेमाल किया भी कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या के कुशल भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं, हमेशा अंय ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृतियों में नहीं पाया16। एक सेल संस्कृति डालें झिल्ली पर एक मोनोलेयर की स्थापना एपिथेलियम के दोनों एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों तक एक साथ पहुंच के लिए अनुमति देती है जिससे उन्हें बाधा अखंडता और एपिथेलियल परिवहन में अध्ययन के लिए आदर्श बना दिया जाता है। यह सरलीकृत पहुंच उन्हें संक्रमण और दवा उपचार अध्ययन के लिए अधिक उत्तरदायी भी प्रदान करती है। इसके अलावा, ये संस्कृतियां दाता के लिए अद्वितीय विशेषताओं में से कई को बनाए रखते हैं, रोगी-विशिष्ट अध्ययनों के लिए उनकी प्रासंगिकता को बनाए रखते हैं। अली संस्कृति विधि स्राव और अवशोषण कोशिका दोनों प्रकारों से बने अधिक कार्यात्मक एपिथेलियम के भेदभाव की सुविधा भी प्रदान करती है, जिससे यह मानव आंतों के एपिथेलियम का अधिक प्रतिनिधि बन जाता है। इन संस्कृतियों की सापेक्ष स्थिरता भी उन्हें लंबे समय तक बनाए रखने की अनुमति देती है, जो दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए संभावना प्रदान करती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सीमाएं एक कन्फ्लूंट मोनोलेयर स्थापित करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की उच्च संख्या हैं और एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों के बीच एक कार्यात्मक अलगाव के लिए पूर्ण उदारता बनाए रखने की आवश्यकता है। विशेषता तहखाना वास्तुकला, जिसे 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में मॉडलिंग किया जा सकता है, मोनोलेयर संस्कृति स्थापित करने पर भी खो जाता है। फिर भी, संस्कृति का प्रयोगात्मक अनुकूल प्रारूप और जिस सहजता पर एपिथेलियम के एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों तक पहुंचा जा सकता है, इसे आंतों के शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं।

Disclosures

जी एस, डब्ल्यू.C, और एस एस स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज लिमिटेड, कैंब्रिज (यूके) के कर्मचारी हैं । एम एस, एफ ई, एस एल, ए ई, और आर के.C STEMCELL टेक्नोलॉजीज इंक, वैंकूवर (कनाडा) के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

इस शोध को क्षितिज 2020 अनुदान ऑर्गेनोवीर 812673 द्वारा वायरस अनुसंधान के लिए परियोजना ऑर्गेनॉइड - एक अभिनव प्रशिक्षण-आईटीएन कार्यक्रम पर वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies Inc. 7010 For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text.
Conical tubes, 15 mL STEMCELL Technologies Inc. 38009
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free Corning 356231 Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines.
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts STEMCELL Technologies Inc. 38023/38024 For 2D Monolayer culture.
Costar 24 Well  Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate STEMCELL Technologies Inc. 38017 For maintenance and establishment of organoid lines.
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) STEMCELL Technologies Inc. 37350 For washing 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D2650 Reconstitution of small molecules
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies Inc. 36254 For washing
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) STEMCELL Technologies Inc. 7174 For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 6010 For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text.
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) STEMCELL Technologies Inc. 100-0214 For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text.
Trypsin-EDTA (0.05%) STEMCELL Technologies Inc. 7910 For 2D Monolayer establishment.
Y-27632 STEMCELL Technologies Inc. 72302 RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment.
Wide bore tips Corning #TF-1005-WB-R-S Organoids handling

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  3. Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
  4. DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
  5. Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  7. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  8. Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
  9. Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
  10. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  11. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  12. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  14. Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
  15. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  16. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  17. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
  18. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  19. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
  20. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
  21. Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
  22. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  23. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  24. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  25. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  26. Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
  27. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  28. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  29. Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
  30. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  31. Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
  32. Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
  33. Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
  34. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 169 आंतों ऑर्गेनॉइड अपिकाबासल ध्रुवता आंतों मोनोलेयर सेल कल्चर झिल्ली आवेषण ध्रुवता उलटा मॉडल
आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग करके एपिकल-विशिष्ट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए संस्कृति विधियां
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stroulios, G., Stahl, M., Elstone,… More

Stroulios, G., Stahl, M., Elstone, F., Chang, W., Louis, S., Eaves, A., Simmini, S., Conder, R. K. Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models. J. Vis. Exp. (169), e62330, doi:10.3791/62330 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter