Summary
Her presenterer vi to protokoller som tillater modellering av intestinale apikale spesifikke interaksjoner. Organoid-avledede intestinale monolayers og Air-Liquid Interface (ALI) kulturer letter genereringen av godt differensiert epithelia tilgjengelig fra både lysende og basolaterale sider, mens polaritet-inverterte intestinale organoider utsetter sin apikale side og er mottagelige for høy gjennomstrømningsanalyser.
Abstract
Foringen av tarmepitelet består av et enkelt lag med spesialiserte epitelceller som utsetter deres apikale side for lumen og reagerer på eksterne signaler. Nylig optimalisering av in vitro-kulturforhold gjør det mulig å gjenskape tarmstammecellenisjen og utviklingen av avanserte 3-dimensjonale (3D) kultursystemer som rekapitulerer cellesammensetningen og organiseringen av epitelet. Intestinale organoider innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM) kan opprettholdes for langsiktig og selvorganisert for å generere et veldefinert, polarisert epitel som omfatter en intern lumen og en ekstern eksponert basal side. Denne restriktive naturen til tarmorganoidene gir utfordringer med å få tilgang til epitelintroens apikale overflate og begrenser undersøkelsen av biologiske mekanismer som næringsopptak og vertsmikrobiota / vertspatogeninteraksjoner. Her beskriver vi to metoder som letter tilgangen til den apikale siden av det organoide epitelet og støtter differensiering av spesifikke tarmcelletyper. Først viser vi hvordan ECM-fjerning induserer en inversjon av epitelcellepolariteten og tillater generering av apikale 3D-organoider. For det andre beskriver vi hvordan man genererer 2-dimensjonale (2D) monolayers fra encellede suspensjoner avledet fra intestinale organoider, bestående av modne og differensierte celletyper. Disse teknikkene gir nye verktøy for å studere apikale spesifikke interaksjoner av epitelet med eksterne signaler in vitro og fremme bruk av organoider som plattform for å lette presisjonsmedisin.
Introduction
Intestinal epitel er det nest største epitelet i menneskekroppen og består av et polarisert cellelag som letter næringsopptaket og fungerer som en barriere mot miljømessige fornærmelser1. Dette skillet mellom de apikale og basolaterale sidene gjør at epitelets celler kan utføre sine forskjellige funksjoner. Det apikale rommet er utsatt for lumen og formidler epitelinteraksjonene med miljøstimuli og mikroorganismer, samtidig som det letter næringsopptaket. Den basolaterale overflaten huser intercellulære veikryss og cellematriseadhesjoner, mens de interfacing med celler i immunsystemet og andre vev2. Disse kryssene genererer en ugjennomtrengelig monolayer festet til kjellermembranen, som fungerer som en barriere og leverer de absorberte næringsstoffene til det omkringliggende kroppsvevet.
Etableringen av kultursystemer som er i stand til å rekapitulere disse tarmfunksjonene in vitro har vært utfordrende3. Konvensjonelle in vitro-modeller bruker transformerte cellelinjer for humant kolorektal kreft, for eksempel Caco-2, for å generere 2D-monolayerkulturer. Til tross for å være i stand til å modellere flere funksjoner i det absorptive rommet, kan disse modellene ikke fullt ut rekapitulere tarmepitelets sammensetning og funksjon, noe som begrenser viktige funksjonelle egenskaper og applikasjoner4,5.
Fremveksten av organoider som et avansert 3D-kultursystem generert fra stamceller som selv kan organisere og skille seg fra organspesifikke celletyper, var et gjennombrudd i in vitro-studien av tarmepitelet6. Intestinale organoider er innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM) som ligner basal lamina og danner cellematrisekryss som gjør at disse kulturene kan beholde epitelets apikobasale polaritet. Organoider viser en lukket arkitektur der den apikale siden blir utsatt for lyskammeret, og dermed etterligner tarmens struktur. Selv om denne lukkede organisasjonen tilbyr muligheten til å studere orienteringsspesifikke funksjoner, begrenser den undersøkelser som krever tilgang til den apikale siden av epitelet. Ulike tilnærminger har blitt tatt for å overvinne disse begrensningene i både 2D og 3D, inkludert organoid fragmentering, organoid mikroinjeksjon og generering av monolayerkulturer7. Organoid fragmentering forårsaker tap av strukturorganisasjonen og ødeleggelse av cellekryss, noe som gjør det mulig å eksponeringen av epitelets apikale overflate til mediet. Denne teknikken drar nytte av fragmentenes regenerative kapasitet til å reformere organoider når de frøes til en ekstracellulær matrise og har blitt brukt til å modellere smittsomme sykdommer og vertspatogeninteraksjoner8,9. Samtidig tilgang til både den apikale og basale overflaten kan imidlertid også fremkalle ikke-spesifikke reaksjoner på infeksjon.
En alternativ tilnærming som gir tilgang til den apikale overflaten og bevarer både strukturarkitekturen og cellekryssene, er representert av mikroinjeksjon av faktorer i organoidenes lumen. Denne metoden har blitt mye brukt til å studere vert-patogen interaksjoner og modellere effekten av Cryptosporidium10, H. pylori11, og C. difficile12 på gastrointestinal epitel in vitro. Ved hjelp av lignende teknikker ble det mutagene potensialet til pks+ stamme av E. coli på intestinal epitel bestemt13. Selv om det er effektivt, er organoid mikroinjeksjon en arbeidskrevende og ineffektiv oppgave med tanke på det høye antallet organoider som må injiseres for å oppnå målbare effekter og begrenser derfor anvendelsen for analyser med høy gjennomstrømning.
Nylige fremskritt med intestinale organoider har også gitt metoder for etablering av 2D monolayer organoidkulturer, og dermed utsette deres apikale overflate14,15,16,17. Disse organoid-avledede monolayers recapitulate nøkkel in vivo egenskaper av intestinal epitel. De viser en fysiologisk relevant cellesammensetning, som inneholder både differensierte og stamcellepopulasjoner og modellerer mangfoldet på tvers av krypt-villusaksen. Etter hvert som apicobasal polaritet beholdes, gir de iboende monolayeregenskapene enkel tilgang til både de apikale og basolaterale sidene, og medieutvekslinger kan etterligne tarmstrøm og avfallsfjerning som muliggjør langsiktig kultur. Disse funksjonene gjør organoid-avledede monolayers egnet for studier som fokuserer på lysende interaksjoner og gir en overlegen modell for epitelial barriereintegritet og permeabilitet18,19.
Studier har vist at epitelcellepolaritet er tett regulert av ECM-proteiner i MDCK-sfæroider20,21 og nylig i humane tarmorganoider22. Fjerning av ECM-komponenter eller hemming av den integrinske reseptoren som formidler cellematrisekryssene resulterer i en polaritets reversering av intestinale organoider og eksponering av den apikale siden av epitelet til medium22. Denne tilnærmingen har tiltrukket seg interessen til forskere som jobber med smittsomme sykdommer, da den gir enkel tilgang til den apikale siden i 3D og gjør den mottagelig for høye gjennomstrømningsanalyser. Her beskriver vi en modifisert protokoll basert på det nylige arbeidet fra Amieva lab22, som letter genereringen av 3D intestinale organoider som lett utsetter deres apikale side. Vi skisserer også en protokoll som effektivt og reproduserer intestinale 2D-monolayre avledet fra tarmorganoider.
Protocol
Avledning av humane intestinale organoidkulturer ble utført som beskrevet andre steder23. Organoider ble opprettholdt i kultur som beskrevet av Produktinformasjonsarket (PIS) for intestinal organoid ekspansjonsmedium (se materialtabellen).
1. Inversjon av intestinal organoid polaritet
MERK: Denne delen vil skissere protokollen for å invertere polariteten til 3D intestinale organoider. Denne protokollen gir en detaljert prosedyre for etablering av polariserte organoider med en eksponert apikal overflate i suspensjon i en kulturplate. Denne protokollen er ment som en sluttpunktanalyse, selv om organoidene kan opprettholdes i denne konformasjonen i over 2 uker og opprettholde en liten stamcellepopulasjon som gjør at de kan gjenopprette apikale organoider ved passasje.
- Beleggkultur og rør med anti-tilhenger løsning
MERK: For å maksimere antall apikale intestinale organoider og forhindre uønsket tilknytning til kulturutstyret, er precoating av kulturutstyr generelt nødvendig. Avsnittet beskrevet nedenfor beskriver belegget av kultur og plastikk med anti-tilhenger løsning.- Frakkkulturplater som skal brukes i fjæringsdelen av protokollen som følger.
- Tilsett 0,5 ml anti-tilhengeroppløsning til hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate.
- Virvle platen for å spre løsningen jevnt over overflaten og veggene i brønnene.
- Sentrifuger platen på 1300 x g i 10 min.
- Fjern anti-tilhengeroppløsning fra hver brønn ved hjelp av en aspirator eller en 1 ml pipette.
- Vask brønnene med 1 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES (DMEM/F12).
- Fyll hver vasket brønn med 0,5 ml DMEM/F-12 og oppbevar platen ved 37 °C og 5 % CO2 til bruk.
MERK: Hvis de ikke brukes umiddelbart, kan de belagte platene oppbevares i inkubatoren i minst 1 uke.
- Frakk 15 ml koniske rør som brukes i denne protokollen som følger.
- Tilsett 4 ml anti-tilhengeroppløsning til det koniske røret på 15 ml.
- Virvle røret for å spre løsningen jevnt over overflaten av veggene.
- Sentrifuger røret på 1300 x g i 10 min.
- Fjern den anti-festende løsningen fra røret.
- Vask røret 1x med 5 ml DMEM/F-12 og aspirer DMEM/F-12. Rørene er nå klare til bruk.
MERK: Hvis det ikke brukes umiddelbart, tilsett 5 ml DMEM/F12 og oppbevar ved 4 °C. Belagte rør kan holdes ved 4 °C i minst en uke.
- Frakkkulturplater som skal brukes i fjæringsdelen av protokollen som følger.
- Polaritet inversjon av intestinale organoider ved suspensjon kultur
MERK: Trinnene nedenfor skisserer inversjon av intestinale organoider som tidligere var dyrket under standard ECM-kuppelforhold. Prosedyrene som er beskrevet her er for en brønn av en 24-brønns plate. Hvis du bruker andre cultureware, juster volumene tilsvarende.- Fjern og kast forsiktig mediet fra hver brønn som inneholder organoider uten å forstyrre kjellermembranen ekstracellulær matrisekuppel. Forsikre deg om at størrelsen på organoidene er på 150-250 μm diameter (vanligvis på dag 3-5) før du begynner inversjonsprotokollen.
- Tilsett 1 ml iskald dissosiasjonsløsning i hver brønn.
- Inkuber ved romtemperatur (15-25 °C) i 1 min.
- Tilsett minst 2 ml anti-tilhengeroppløsning til et 15 ml rør som skal brukes til belegg av plastspisser.
- Tilsett minst 2 ml DMEM/F-12 i et 15 ml rør som skal brukes til vasking av plastspisser skyllet med anti-tilhengeroppløsning.
- Belegge en 1 ml pipettespiss med anti-tilhengeroppløsning, pipettering 1 ml oppløsning tre ganger inn i røret med anti-tilhengerløsning fra trinn 1.2.4.
- Vask spissen i kald DMEM/F-12, pipettering 1 ml oppløsning tre ganger inn i røret med DMEM/F-12 fra trinn 1.2.5.
- Bruk den belagte spissen til å løsne kupplene forsiktig ved å pipetter sakte. Pass på at du ikke forstyrrer eller fragmenterer organoidene.
- Overfør den organoide suspensjonen til en plate behandlet med anti-tilhengeroppløsning (fra trinn 1.1.1).
- Plasser platen på en shaker ved 4 °C i 30 minutter. En gyro shaker kan brukes ved 70 rpm.
MERK: Unngå hard risting, for eksempel virveling av prøven, da det kan føre til organoid fragmentering. Dannelsen av bobler og skum kan indikere hard risting. - Fjern platen etter 30 min. Bruk en 1 ml pipettespiss belagt med anti-festende oppløsning, forsiktig pipette løsningen opp og ned.
- Plasser platen på en shaker ved 4 °C i 15 minutter. En gyro shaker kan brukes ved 70 rpm.
- Fjern platen og la organoidene slå seg ned med tyngdekraften (1-2 min ved romtemperatur). Vær oppmerksom på platen under mikroskopet for å bekrefte organoid sedimentering.
MERK: Unngå omfattende agitasjon av platen, da det kan føre til at avgjorte organoider resuspenderer. - Etter at organoidene har lagt seg, fjern så mye av dissosiasjonsløsningen som mulig og vask ved å tilsette 1,5 ml DMEM / F-12.
- La organoidene sedimentere og fjerne så mye av supernatanten som mulig. Gjenta vasketrinnet en gang til.
MERK: Vær oppmerksom på platen under mikroskopet for å bekrefte organoid sedimentering før du utfører et vasketrinn. - Fjern så mye av DMEM/F-12 som mulig og tilsett 0,5 ml intestinal organoid ekspansjonsmedium. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
- Påfølgende dag, utfør en delvis middels endring ved å vippe platen i en 25- til 30-graders vinkel, og fjern medium langs veggen av brønnen. Fjern 0,4 ml middels pass på at du ikke fjerner suspenderte organoider.
- Tilsett 0,4 ml intestinal organoid ekspansjonsmedium. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 3 dager.
MERK: Etter 3 dager skal de fleste organoidene ha en apikal polaritet, men store aggregater kan ha dannet seg. - Hvis aggregater har dannet seg, bruk en 1 ml pipette med en spiss belagt med anti-tilhengeroppløsning (som beskrevet i trinn 1.2.6 og 1.2.7) for å skjære aggregatene ved å pipettere opp og ned 20 ganger mens du trykker enden av spissen inn i bunnen av platen.
- Plasser platen ved 37 °C og 5 % CO2 og utfør en full middels endring neste dag med intestinal organoid ekspansjonsmedium (som beskrevet i avsnitt 1.2.17).
- Etter 2 dager (dag 5 i suspensjon) kan apikale tarmorganoider brukes i nedstrømsanalyser.
2. Etablering av tarmcelle 2D monolayer og Air-Liquid Interface (ALI) kulturer avledet fra 3D intestinale organoider
MERK: Denne delen vil skissere protokollen for å generere 2D monolayer kulturer fra intestinale organoider. Denne teknikken gir fordelen av å etablere en konfluent, polarisert monolayerkultur med en eksponert apikal overflate i en vevskulturplate som inneholder cellekulturmembraninnsats. Selv om monolayeren vil begynne å skille seg ut i nedsenket monolayerformat, kan ytterligere differensiering av monolayer oppnås ved å bytte til en ALI-kultur etter at den har nådd samløp. Både monolayer og påfølgende ALI-protokoller er ment som sluttpunktanalyser, og selv om monolayerkulturen opprettholder en liten stamcellepopulasjon, kan ingen av dem effektivt splittes og passeres etter at den er etablert.
- Forbereder medier og plater for tarmmonolayerkultur
- Forbered intestinal organoid differensieringsmedium som skissert av produsenten for monolayerkultur (se Liste over materialer). Tilsett Y-27632 bare i et mediumvolum som skal brukes innen 1 uke ved en endelig konsentrasjon på 10 μM. Oppbevars ved 4 °C hvis det ikke brukes umiddelbart.
- Forvarm Trypsin EDTA (0,05 %) til 37 °C.
- Minst 2 timer før såing monolayer kulturer, forberede en 2% ECM belegg løsning som følger.
- Tine ECM på is og tilsett 1:50 til kald, steril PBS for å lage en 2% løsning. Forbered tilstrekkelige mengder til å tilsette 100 μL til den øvre brønnen til hver 6,5 mm (0,33 cm2)cellekulturmembraninnsats som skal brukes. Juster volumet riktig for større eller mindre kulturer.
- Tilsett 100 μL i hver brønn og inkuber hver plate ved 37 °C og 5 % CO2 til det er nødvendig (minst 2 timer før sådd).
- Dissosierende intestinale organoider for monolayer generasjon og kultur
- Fjern et passende antall organoidkulturbrønner fra inkubatoren. Se tabell 1 for anbefalt antall brønner som skal høste for ulike kulturvarer.
- Aspirer alt medium fra organoidkulturene uten å forstyrre ECM-kuppelen.
- Tilsett 1 ml dissosiasjonsløsning til hver brønn.
- Inkuber ved romtemperatur (15-25 °C) i minst 1 min.
- Bruk en 1 ml pipette, rør kraftig opp og ned for å forstyrre kuppelen og frigjøre organoidene.
- Pulje de suspenderte organoidene fra hver brønn i et 15 ml konisk rør. Inkuber ved romtemperatur i 10 min med mild agitasjon eller gynging. Organoider for såing av flere brønner kan samles på dette trinnet, opptil 10 ml volum i hvert rør.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern og kast supernatanten. Tilsett 5 ml iskald DMEM/F-12 for å resuspendere organoider.
- Bland og sentrifuger igjen ved 200 x g i 5 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten, fjern så mye som mulig, vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen.
MERK: Noen gjenværende ECM kan forbli i pelletsen; Dette bør imidlertid ikke påvirke dissosiasjonen av organoidene betydelig. - Tilsett 1 ml forvarmede (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05 %) for å resuspendere organoider. Bland grundig for å sikre en jevn suspensjon. Legg opp til ytterligere 1 ml Trypsin-EDTA for et stort antall celler, eller hvis en betydelig mengde ECM forblir.
- Inkuber ved 37 °C i 5-10 min.
- Bland grundig med en 1 ml pipette for å forstyrre organoidene så mye som mulig. Organoider bør fullstendig dissosieres i enkeltceller eller små fragmenter. Hvis større fragmenter eller hele organoider forblir etter grundig pipettering, fortsett inkubasjonen med Trypsin-EDTA ved 37 °C i ytterligere 3-5 minutter.
MERK: Ikke inkuber med Trypsin-EDTA i mer enn 20 minutter, da dette kan føre til økt tap av celle levedyktighet. - Når organoider er tilstrekkelig dissosiert, tilsett et likt volum DMEM/F-12 (f.eks. 1 ml DMEM/F-12 per ml Trypsin-EDTA) og pipette opp og ned for å blande grundig. Deaktiver Trypsin-EDTA ved å legge til 10% FBS i DMEM / F-12 i dette trinnet.
- Sentrifugefragmenter ved 200 x g i 5 min ved 2-8 °C.
- Hvis de dissosierte organoidene ikke klarer å pellets, er dette vanlig og kan skyldes en opphopning av slim frigjort av de dissosierte cellene. I dette tilfellet blander du cellene grundig ved å pipettere opp og ned og sentrifugere dem igjen ved 200 x g i 5 min ved 2-8 °C.
- Fjern forsiktig så mye supernatant som mulig, og la bare cellepellet.
- Resuspend cellene i 100 μL av intestinal organoid differensiering medium (med 10 μM Y-27632) for hver brønn som skal frøs. Juster volumet riktig for større eller mindre brønnstørrelser.
- Fjern de belagte platene fra inkubatoren (fremstilt i trinn 3.1.4) og fjern overflødig ECM fra hver brønn.
- Legg til 100 μL av celleopphenget i den øvre brønnen i hver cellekulturinnsats.
- Tilsett 500 μL intestinal organoid differensieringsmedium til den nedre brønnen i hver cellekulturinnsats.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift ut mediet i både øvre og nedre brønn annenhver til tredje dag. Monolayerkulturer bør nå samløp innen 7 dager og vil ofte nå samløp innen 2-3 dager.
- Etablere en ALI-kultur (Air-Liquid Interface)
MERK: Om ønskelig kan ytterligere differensiering av en nedsenket intestinal monolayerkultur oppnås ved å overføre den nedsenkede monolayerkulturen til en ALI-kultur. Denne kulturmetoden vil tillate en økning i antall differensierte celletyper, spesielt celler i sekretorisk avskamning, for eksempel beger og enterokenkrine celler.- Etablere en monolayerkultur i en cellekulturinnsats som beskrevet ovenfor i trinn 2.2.1-2.2.23 og opprettholde denne kulturen ved 100% samløp i minst 4 dager.
- For å etablere en ALI-kultur, fjern medium fra øvre og nedre brønner. Tilsett fersk intestinal organoid differensieringsmedium (med Y-27632) til den nedre brønnen, slik at den øvre brønnen er tom.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
- Bytt ut mediet i den nedre brønnen hver 2-3 dager og la monolayer skille i minst 1 uke.
- Skyll den øvre brønnen med steril PBS for å fjerne overflødig slimakkumulering om nødvendig.
Under disse forholdene kan ALI-kulturen opprettholdes i minst 2-3 uker.
Representative Results
Organoider ble generert fra biopsiprøver etter protokollen beskrevet tidligere23 og i PIS for intestinal organoid ekspansjonsmedium (se materialtabellen). Figur 1A, Venstre panel, viser fenotypen til tarmorganoidene dyrket i en kuppel med intestinal organoid ekspansjonsmedium. Under disse kulturforholdene viser organoider en cystisk morfologi definert av et tynt (10-25 μm) epitel som omslutter en lumen (Figur 1A, Høyre panel). På dette stadiet vender den apikale siden av tarmepitelet mot lumen, mens den basolaterale siden kontakter den omkringliggende ekstracellulære matrisen. Da flertallet av organoidene nådde ønsket størrelse, ble den ekstracellulære matrisen fjernet, og organoidene ble deretter dyrket i suspensjon. Tapet av cellulær binding til den ekstracellulære matrisen utløser en inversjonsprosess i organoidene, noe som resulterer i en reversering av polariteten til det organoide epitelet, og utsetter epitelets apikale side for vekstmediet og internaliserer basolateralsiden.
I noen kulturer aggregerer organoider i suspensjon og sikring, en effekt som er dypere i løpet av de første 3 dagene (Figur 1B, Venstre panel). Påføring av en skjæreteknikk tillater løsrivelse av organoidene og videreføring av kulturene i dager med minimal reaggregering (Figur 1B, Høyre panel).
Intestinale organoider dyrket i ECM-kupler fortsetter å ekspandere (Figur 1C, Venstre panel) og viser spontan dannelse av sekundære spirende strukturer, som ligner små krypter, på basolateralsiden av epitelet rundt lumen ( Figur1C, Høyrepanel). Samtidig opprettholdes organoider i 5 dager i fravær av ekstracellulær matrise fortsetter å utvikle seg i suspensjon (Figur 1D, Venstre panel). Inversjon av polariteten er preget av fortykning (30-40 μm) av epitelet som omgir kjernen av organoidene og utseendet til en rekke morfologier: langstrakt (Figur 1D, Høyre panel og Supplerende figur 1A), cystisk (Supplerende figur 1B), og uregelmessig (Supplerende figur 1C). Dette kombineres ofte med en krymping av lysområdet i organoiden, noe som påvirker deres totale størrelse.
Effektiv inversjon kan også bekreftes ved å analysere uttrykket av tarmspesifikke polaritetsmarkører. Apikale intestinale organoider viser en tydelig lokalisering av kjernen mot organoidens lumen, som indikert av 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-signalet. Uttrykket av apikale markører, for eksempel VILLIN (figur 2A) og ZO-1 (figur 2B), oppdages på yttersiden av epitelet som er utsatt for mediet. Denne lokaliseringen står i sterk kontrast til det som observeres i tarmorganoider dyrket i ECM. Ekstracellulære matrisein innebygde organoider farget for kjerner (DAPI), VILLIN (figur 2C) og ZO-1 (figur 2D) demonstrerer en apicobasal polaritet der den apikale siden vender mot lumen til organoiden.
Fullstendig fjerning av ECM er nødvendig for å oppnå effektiv polaritetsinversjon av tarmorganoidene. Noen ganger viser en del organoider som finnes i suspensjonskulturer omgitt av ECM-rester, en cystisk morfologi som antyder en svikt i polaritetsinversjon av epitelet (Supplementary Figure 2A). Analyse av immunfluorescerende farging, utført på disse organoidene, gir bevis på den basolaterale posisjonen til kjernen (DAPI) langs epitelet og uttrykket av ZO-1 på den apikale siden som står overfor lumen til organoiden (Supplementary Figure 2B) som bekrefter at ufullstendig ECM-fjerning forårsaker oppbevaring av apicobasal polaritet på en måte som ligner på ECM innebygd organoider.
Protokollen for etablering av intestinale monolayerkulturer resulterer i en samtidig monolayerkultur innen 7 dager etter sådd, og kulturen vil ofte nå samløp innen så lite som 2-3 dager. En av de viktigste determinantene for suksess er antall og kvalitet på celler som brukes til å frø monolayeren. Figur 3A, Venstre panel gir et eksempel på en ideell såddtetthet på ca. 150 000 celler i en 6,5 mm cellekulturmembraninnsats. Dette tallet er ikke fast og kan være svært variabelt basert på donor og kvaliteten på kildeorganoidkulturen; Derfor bør cellenummeret optimaliseres basert på disse variablene. Hvis såddtettheten er for lav eller av dårlig kvalitet (figur 3A, høyre panel), kan det hende at det ikke er tilstrekkelige vedlegg til å danne en sammenfallende monolagskultur.
Når monolayer er etablert (Figur 3B), danner cellene tette koblinger, noe som skaper et brosteinsutseende (Figur 3B, Venstre panel). Hvis de ikke klarer å danne en sammenfallende monolayer (Figur 3B, Høyre panel), vil utseendet på monolayer ofte være "patchy", med regioner av god kvalitet celle vedlegg, men med større hull mellom disse regionene. Disse kulturene gir ikke en funksjonell barriere mellom basale og apikale rom og er ikke egnet for de beskrevne analysene. En samtidig monolayer orienterer sin VILLIN-inneholdende børstekant mot den apikale siden av epitelet, med kjernen plassert mot cellens basolaterale pol (Figur 4B). Mellom celler dannes intercellulære koblinger som består av multiproteinkomplekser, inkludert ZO-1 (Figur 4B). Deres tilstedeværelse er nøkkelen til å gi barrierefunksjonen til epitelkulturen.
Når den er sammensammenhengende, induserer overgangen til en ALI-kultur ytterligere differensiering av kulturen (Figur 3C). Små, runde begerceller vises, og selve monolayeren får et mer brettet utseende. Selv om begerceller er til stede i epitelet av nedsenket kultur (Figur 4A), er de mer fremtredende etter ALI-differensiering. Begerceller tilstede i epitelet utskiller slim, noe som fører til et disig utseende over toppen av epitelet. Begercellene og utskilt slim kan visualiseres ved farging for det utskilte mucinproteinet, MUC2 (Figur 4A, C og D) og økningen i begercellepopulasjonen kan måles ved en økning i MUC2-uttrykk (Supplerende figur 3A). Det er ikke nødvendig å fjerne dette gellignende slimlaget, og det vil holde seg til overflaten av epitelet og forbli etter gjentatte vasker. Hvis fjerning er nødvendig, fjerner vasking av kulturen med en mukolytisk forbindelse, for eksempel 10 mM N-acetylcysteine eller 50 μg / ml DTT overflødig slim. I tillegg til økningen i begercellepopulasjonen øker ALI-grensesnittet også tilstedeværelsen av enterokendokrine celler (som angitt av CHGA-uttrykk) (Supplerende figur 3B) og modne enterocytter (som angitt av KRT20-uttrykk) (Supplerende figur 3C).
Figur 1: Stadier av den apikale tarmorganoide generasjonen. (A) Representative bilder av en kuppel med organoider av ønsket størrelse på dag 4 (Venstre panel, Skala bar = 500 μm). Organoider er tynne inngjerdede, med et åpent lysrom (Høyre panel, Skalastang = 100 μm). (B) Representativt bilde av en brønn med omfattende aggregering etter 3 dager i suspensjon (Venstre panel, Skalastang = 200 μm). Bilde av klumpfragmenter rett etter skråstilling (Høyre panel, Skalalinje = 200 μm). (C) Representativt bilde av intestinale organoider i kuppel på dag 7. Organoider viser en utvidet lumen med dannelsen av små knopper på den basolaterale siden av epitelet (Venstre 20x forstørrelse, Høyre 100x forstørrelse av det merkede området, Skalastang = 200 μm). (D) Representativt bilde av intestinale organoider etter fjerning av ECM og påfølgende suspensjonskultur i 5 dager. Organoidene får en tett morfologi med et fortykket epitel og utsetter deres apikale side for mediet. (Venstre 20x forstørrelse, Høyre 100x forstørrelse av det merkede området, Skalalinje = 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunfluorescerende farging for cellepolaritetsmarkører i tarmorganoider. Apikale ut (A, B), og apikale inn (C,D) orienterte intestinale organoider ble farget med apikale markører ZO-1 og VILLIN, og med epitelmarkør E-CADHERIN (rød). DAPI (blå) ble brukt til å visualisere kjerner. Venstre paneler viser bilder tatt med 25x forstørrelse og høyre paneler viser bilder av forskjellige organoider ved 63x forstørrelse (bare panel C viser 25x og 63x forstørrelse av samme organoid). (A) Apikale intestinale organoider farget med VILLIN (grønn) og E-CADHERIN (rød) indikerer eksponeringen av den apikale siden til mediet. (B) Apikale ut intestinale organoider farget med ZO-1 (grønn) og E-CADHERIN (rød) viser tilstedeværelsen av tette veikryss og reversjon av apicobasal polaritet. (C) Matrigel-innebygd intestinal organoid farget med VILLIN (grønn) og E-CADHERIN (rød) som viser den apikale siden vendt mot organoid lumen. (D) Matrigel-innebygde tarmorganoider farget med ZO-1 (grønn) og E-CADHERIN (rød) som indikerer tilstedeværelsen av apikale tette veikryss mot organoidens lumen. (Skalastang = 100 μm). Organoider ble farget av immunfluorescens og avbildet ved hjelp av tidligere publiserte protokoller24,25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Etablering av tarmmonolayerkulturer. (A) Representativt bilde av 3D-organoider etter behandling med 0,05% Trypsin-EDTA. Organoider dissosieres til enkeltceller eller små celleklumper som forberedelse til såing av monolayerkulturer. Venstre panel: Eksempel på optimal såingstetthet for en monolagkultur, ca. 150 000 celler per 100 μL på en 6,5 mm cellekulturmembraninnsats. Høyre panel: Eksempel på suboptimal såing tetthet ved < 50,000 celler per 100 μL på en 6,5 mm cellekultur membran innsats. (B) Representativt brightfield-bilde av en nedsenket monolayerkultur. Venstre panel: 100% sammenfallende lag med det karakteristiske brosteinsutseendet. Høyre panel: ca. 50 % sammenfallende monolag. Hull sett i monolayeren (indikert med stiplet linje) lukkes over tid på grunn av fortsatt spredning av tarmstammecellene. (C) Representativt brightfield-bilde av en differensiert ALI-kultur etter 7 dager. (Skalastang = 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunfluorescent farging for differensierte cellemarkører i monolayerkulturer. (A) Z-stack bilde av immunfluorescerende farging av en nedsenket monolayerkultur for mucinproteinet MUC2, som indikerer tilstedeværelsen av begerceller i monolayerkulturen (grønn = MUC2, blå = DAPI). (B) Z-stack bilde av immunfluorescent farging av en nedsenket monolayer. VILLIN farging (grønn) langs den apikale enden av epitelet indikerer tilstedeværelsen av en børstekant og ZO-1 farging (rød) indikerer tilstedeværelsen av tette koblinger mellom celler (blå = DAPI). (C) Z-stack bilde av immunfluorescent farging av en ALI-differensiert monolayer kultur for mucin protein MUC2, indikerer tilstedeværelsen av et betydelig større antall begerceller i ALI monolayer kultur (grønn = MUC2, blå = DAPI). (D) Kryoseksjon av den ALI-differensierte monolayerkulturen, farget for tilstedeværelsen av MUC2 (grønn) og E-CADHERIN (rød) som indikerer tilstedeværelsen av begerceller i epitelet og sekresjonen av slim langs den apikale siden av monolayerkulturen. (Skalastang = 200 μm). Monolayerkulturer ble farget av immunfluorescens og avbildet ved hjelp av tidligere publiserte protokoller26,27. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Spektrum av fenotyper av apikalt intestinal organoid i kulturfjæring. (A,B,C) Ytterligere representative bilder av intestinal organoid morfologier opprettholdt i suspensjon 5 dager etter fjerning av ECM. Organoid polaritet har invertert. Organoidene har blitt tettere med et fortykket epitel og den apikale siden av organoidene vender utover. Organoider kan vise en rekke morfologier: langstrakt (A), cystisk (B) og uregelmessig (C). (Skalastang = 100 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Intestinale organoider klarer ikke å invertere polaritet i nærvær av gjenværende kjellermembranmatrisemedium i suspensjonskulturer. (A) Representativt bilde av ufullstendig ECM-fjerning og unnlatelse av å invertere polariteten til organoidene. Matrigelrester er til stede rundt organoidene og bidrar til å opprettholde epitelpolaritetsorientert apikal-in. Organoider viser en cystisk morfologi med et tynt epitel rundt lumen (Skala bar = 200 μm). (B) Representativt bilde av en ikke-invertert organoid som finnes under suspensjonskulturforhold. Nuclei (blå = DAPI) og E-CADHERIN (rød) er plassert på basolateral side, ZO-1 (grønn) uttrykkes til den apikale siden som vender mot lumen av organoiden. (Skalastang = 100 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Genuttrykk av differensierte cellemarkører i monolagkulturer. (A,B,C) Uttrykk for MUC2, CHGAog KRT20 i nedsenket og ALI-differensiert monolayerkultur generert i intestinal organoid differensieringsmedium i forhold til en 3D organoid kultur dyrket med intestinal organoid ekspansjonsmedium etablert via qPCR. Etablering av en nedsenket monolayerkultur øker uttrykket for hver differensiert cellemarkør; Differensiering som ALI-kultur øker imidlertid uttrykket for hver markør eksponentielt. Feilfelt = +/- SEM. Klikk her for å laste ned denne filen.
| MONOLAYER KULTURUTSTYR | ANTALL BRØNNER AV INTESTINALE ORGANOIDER Å HØSTE (fra 50 μL kuppel / per brønn som skal frøs) |
| 6,5 mm Transwell-innsats | 1 - 2 brønner |
| 12 mm Transwell-innsats | 3 - 4 brønner |
| 6-brønns plate | 6 - 8 brønner |
| 24-brønns plate | 3 - 4 brønner |
| 96-brønns plate | 1 - 2 brønner |
Tabell 1: Antall brønner med tarmorganoider å høste for ulike kulturvarer
Discussion
Epiteliale organoidmodeller har blitt kraftige plattformer som kan brukes til å modellere vevsorganisasjon, sykdomsprogresjon og identifisere terapeutiskestoffer 23,28,29. Organoid mikroinjeksjon har tilført verdi til organoidenes evne til å modellere smittsomme sykdommer, da det tillater patogeninteraksjon med den apikale siden av vertsepitelet. Nylige fremskritt innen mikroinjeksjonsteknikker har optimalisert injeksjonshastigheten i organoider og har oppnådd en hastighet på opptil 90 injiserte organoider per time. Barrierefunksjonen i injiserte organoider ble bevart, og den lave oksygenkonsentrasjonen inne i lumen tillot overlevelse av obligatoriske anaerobe injiserte bakterier30. Studier har imidlertid notert tilstedeværelsen av heterogenitet i organoidpopulasjoner i samme brønn. Disse forskjellene ble observert i størrelse og form31, uttrykksnivåer av nøkkelgener32, samt spredningshastigheter33. Differensialresponser i samme organoidpopulasjon til forbindelser som forskolin og PGE2, eller til koleratoksin, har også blitt beskrevet28,33. Disse resultatene fremhever behovet for høye organoidtall i studier og begrenser bruken av lysinjeksjon.
Konvensjonell organoidkultur er basert på innkapsling og forplantning av organoider i en hydrogel. Hydrogeler kan imidlertid utgjøre begrensninger på diffusjon og introdusere konsentrasjonsgradienter, noe som kan øke heterogeniteten34. Videre er det dokumentert høy variasjon, ikke bare mellom kulturer og givere, men også innenfor individuelle eksperimentelle forhold. Donorkilde, biokjemiske egenskaper til hydrogelen og organoidens iboende heterogenitet som kultursystem er viktige faktorer som kan øke eksperimentell variasjon og begrense reproduserbarheten av resultater oppnådd i nedstrømsapplikasjoner. Begge metodene beskrevet her gir et enkelt middel til å utsette den apikale siden av epitelet, noe som muliggjør modellering av forbindelser og patogener av interesse ved å direkte legge dem til kulturmediet. Reduksjonen i hydrogelutnyttelsen kan begrense eksperimentell variasjon fra tekniske feilkilder.
De apikale tarmorganoidene beholder nøkkelegenskapene til det organoide modellsystemet, og deres skalerbarhet gjør dem mer mottagelige for analyser med høy gjennomstrømning, sammenlignet med 2D-monolayeren. Men ettersom organoidene beholder sin 3D-struktur, er tilgjengeligheten av basalsiden begrenset og kan hindre studier som krever tilgang til begge sider samtidig.
Vi har vist at polaritetsinversjon av intestinale organoider er avhengig av effektiv og absolutt fjerning av ECM, samtidig som den intakte strukturen til organoidene bevares. Både bruken av dissosiasjonsløsningen for å fjerne ECM og den antitilknyttede løsningen for å forhindre organoider overholdelse av plasttøyet bidro til å forbedre den generelle effektiviteten til protokollen publisert av Co, J. Y. og kolleger22, spesielt med hensyn til antall apical-out organoider produsert for nedstrøms applikasjoner.
Videre observerte vi at vår protokoll støtter mer effektiv inversjon av organoider mindre enn 250 μm og bruk av større organoider kan resultere i redusert organoid utgang, på grunn av fragmentering forårsaket av pipettering. Brede tips, for eksempel de som er angitt i materialtabellen, kan tillate utnyttelse av større organoider. Imidlertid er brede spisser mindre effektive i ECM-dissosiasjon sammenlignet med standardtips på grunn av den lavere påførte mekaniske kraften. Gjentakende trinn 1.2.9-1.2.11 kan derfor være nødvendig for tilstrekkelig forstyrrelse og fullstendig fjerning av alle ECM-rester når du arbeider med større organoider.
Organoider i suspensjon kan overleve i minst 2 uker. Etter denne perioden observerte vi morfologiendringer og et økt antall celledød. Tilstedeværelsen av prolifererende celler i de apikale organoidene22 gjør det mulig å reetablere apikale tarmorganoidkulturer. Dette kan oppnås ved å dissosiere apikale organoider til enkeltceller og legge dem inn i ECM med intestinal organoid ekspansjonsmedium.
En begrensning som ofte oppstår i protokoller som beskriver etableringen av tarmorganoider i suspensjonskulturer, er genereringen av store aggregater. Dette påvirker flere variabler som effektivitet, reproduserbarhet av morfologiske egenskaper, permeabilitet til forbindelser og parakrinesignalering. I likhet med protokollen publisert av Co, J. Y. og kolleger, bekrefter vi her å ha oppnådd polaritetsinversjon av minst 97% av alle suspenderte organoider uten å skjære etter 3 dager i suspensjon. Men i motsetning til publikasjonen har vi innført et mekanisk dissosiasjonstrinn for å redusere dannelsen av store aggregater og øke utbyttet. Siden denne prosedyren kan skade epitelet til organoidene, utvidet vi organoidene inkubasjonsperioden i ytterligere 2 dager for å tillate fullstendig epitelgjenoppretting og sikre kulturer av høy kvalitet for nedstrøms applikasjoner. Innføringen av konstant agitasjon ved bruk av en inkubator shaker eller en spinnerflaske kan potensielt redusere fusjonshendelser, minimere fragmentering og øke oksygenering. Disse alternative tilnærmingene kan opprettholde kulturene i lengre varigheter, redusere celledød og tillate ytterligere differensiering av de apikale tarmorganoidene.
Etableringen av en organoid-avledet 2D-monolayer gir flere fordeler og ulemper sammenlignet med de inverterte polaritetsorganoidene. Protokollen beskrevet her tillater rask etablering av en sammenfallende monolayerkultur, vanligvis på mindre enn 7 dager og muligheten for langsiktig vedlikehold av kulturene i en lengre periode (opptil 10 uker). Protokollen og mediene som brukes her, tillater også effektiv differensiering av betydelig antall celler, ikke alltid funnet i andre organoid-avledede monolayerkulturer16. Etablering av en monolayer på en cellekulturinnsatsmembran gir samtidig tilgang til både de apikale og basolaterale sidene av epitelet, noe som gjør dem ideelle for studier i barriereintegritet og epiteltransport. Denne forenklede tilgangen gjør dem også mer mottagelige for studier av infeksjon og narkotikabehandling. Videre opprettholder disse kulturene mange av egenskapene som er unike for giveren, og opprettholder deres relevans for pasientspesifikke studier. ALI-kulturmetoden letter også differensiering av et mer funksjonelt epitel sammensatt av både sekretoriske og absorptive celletyper, noe som gjør det mer representativt for det menneskelige intestinale epitelet. Den relative stabiliteten til disse kulturene gjør det også mulig for dem å opprettholdes i en lengre periode, noe som gir mulighet for langsiktige studier. Imidlertid er begrensninger i denne tilnærmingen det høye antallet celler som kreves for å etablere en samtidig monolayer og behovet for å opprettholde fullstendig samløp for å ha en funksjonell separasjon mellom de apikale og basolaterale kamrene. Den karakteristiske kryptarkitekturen, som kan modelleres i 3D-organoidkulturene, går også tapt ved etablering av en monolayerkultur. Likevel, det eksperimentelt vennlige formatet til kulturen og hvor enkelt de apikale og basolaterale sidene av epitelet kan nås, gjør det til et kraftig verktøy for studiet av tarmfysiologi.
Disclosures
G. S., W.C., og S. S. er ansatte i STEMCELL Technologies Ltd., Cambridge (UK). M. S., F. E., S. L., A. E., og R. K.C. er ansatte i STEMCELL Technologies Inc., Vancouver (Canada).
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Horisont 2020-stipendet OrganoVIR 812673 på prosjektet Organoids for Virus Research - Et innovativt opplærings-ITN-program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
| Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
| Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
| Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
| Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
| D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
| Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
| IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
| Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |
References
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
- Schneeberger, K., Roth, S., Nieuwenhuis, E. E. S., Middendorp, S. Intestinal epithelial cell polarity defects in disease: lessons from microvillus inclusion disease. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Klunder, L. J., Faber, K. N., Dijkstra, G., Van Ijzendoorn, S. C. D. Mechanisms of cell polarity - Controlled epithelial homeostasis and immunity in the intestine. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 0227888 (2017).
- DiMarco, R. L., Hunt, D. R., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Improvement of paracellular transport in the Caco-2 drug screening model using protein-engineered substrates. Biomaterials. 129, 152-162 (2017).
- Sun, H., Chow, E. C., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhang, Y. -G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiological Reports. 2 (9), 12147 (2014).
- Nigro, G., Rossi, R., Commere, P. -H., Jay, P., Sansonetti, P. J. The cytosolic bacterial peptidoglycan sensor Nod2 affords stem cell protection and links microbes to gut epithelial regeneration. Cell Host & Microbe. 15 (6), 792-798 (2014).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infection and Immunity. 83 (1), 138-145 (2015).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
- Fernando, E. H., et al. A simple, cost-effective method for generating murine colonic 3D enteroids and 2D monolayers for studies of primary epithelial cell function. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 313 (5), 467-475 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: I. Uncoupling the roles of cell-cell and cell-substratum contact in establishing plasma membrane polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 137-151 (1990).
- Wang, A. Z., Ojakian, G. K., Nelson, W. J. Steps in the morphogenesis of a polarized epithelium: II. Disassembly and assembly of plasma membrane domains during reversal of epithelial cell polarity in multicellular epithelial (MDCK) cysts. Journal of Cell Science. 95 (1), 153-165 (1990).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Crowley, S. M., et al. Intestinal restriction of Salmonella Typhimurium requires caspase-1 and caspase-11 epithelial intrinsic inflammasomes. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008498 (2020).
- Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. Journal of Crohn's & Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Almeqdadi, M., Mana, M. D., Roper, J., Yilmaz, ÖH. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
- Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Kassis, T., Hernandez-Gordillo, V., Langer, R., Griffith, L. G. OrgaQuant: human intestinal organoid localization and quantification using deep convolutional neural networks. Scientific Reports. 9 (1), 12479 (2019).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340-349 (2015).
- Gunasekara, D. B., et al. Development of arrayed colonic organoids for screening of secretagogues associated with enterotoxins. Analytical Chemistry. 90 (3), 1941-1950 (2018).
- Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
