Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

يعرض هنا بروتوكول بسيط للتمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حوالي 1 أسبوع.

Abstract

يتم توزيع الأوعية الدموية في كل مكان داخل جميع أنسجة الجسم وتؤدي وظائف متنوعة. وبالتالي ، فإن اشتقاق الخلايا البطانية الوعائية الناضجة ، التي تبطن لومن الأوعية الدموية ، من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أمر بالغ الأهمية للعديد من تطبيقات هندسة الأنسجة وتجديدها. في الجسم الحي ، تشتق الخلايا البطانية البدائية من سلالة الأديم المتوسط ويتم تحديدها نحو أنواع فرعية محددة ، بما في ذلك الشرايين والوريدية والشعيرات الدموية والهيموجينية واللمفاوية. تعتبر الخلايا البطانية الدموية ذات أهمية خاصة لأنها ، أثناء التطور ، تؤدي إلى ظهور الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم ، والتي تولد بعد ذلك جميع سلالات الدم طوال الحياة. وبالتالي ، فإن إنشاء نظام لتوليد الخلايا البطانية الدموية في المختبر من شأنه أن يوفر فرصة لدراسة الانتقال من البطانة إلى المكونة للدم ، وقد يؤدي إلى إنتاج منتجات الدم البشري خارج الجسم الحي وتقليل الاعتماد على المتبرعين البشريين. في حين توجد عدة بروتوكولات لاشتقاق الخلايا البطانية السلفية والبدائية ، لم يتم وصف توليد الخلايا البطانية الدموية ذات الخصائص الجيدة من الخلايا الجذعية البشرية. هنا ، يتم تقديم طريقة لاشتقاق الخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في حوالي 1 أسبوع: بروتوكول تمايز مع خلايا خط بدائية تشكلت استجابة لمثبط GSK3β (CHIR99021) ، ثم تحريض سلالة الأديم المتوسط بوساطة bFGF ، تليها تطوير الخلايا البطانية البدائية التي يروج لها BMP4 و VEGF-A ، وأخيرا مواصفات الخلايا البطانية الدموية التي يسببها حمض الريتينويك. ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة محددة جيدا من الخلايا البطانية الدموية التي يمكن استخدامها لفهم تنظيمها الجزيئي والانتقال من البطانة إلى المكونة للدم ، والتي لديها القدرة على تطبيقها على التطبيقات العلاجية النهائية.

Introduction

الخلايا البطانية (ECs) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا التي تؤدي وظائف متعددة في جميع أنحاء جسم الإنسان وفي الأنسجة المهندسة. بالإضافة إلى دعم وتنظيم أنواع الخلايا الأخرى (مثل خلايا عضلة القلب1 ، الخلايا العظمية2) ، تشمل هذه الوظائف تشكيل حاجز انتقائي بين الدم والأنسجة والمساعدة في تكوين الأنسجة3. يتطلب تمايز ECs الناضجة أثناء التطور الطبيعي مسارات إشارات متنوعة. يتم اشتقاق ECs البدائية من أسلاف الأديم المتوسط ، ثم يتم تحديدها نحو الأنماط الظاهرية الشريانية والوريدية والشعيرية واللمفاويةالناضجة 4. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد مجموعة فرعية صغيرة من ECs في كيس الصفار خارج الجنين ومنطقة الشريان الأورطي والغدد التناسلية و Mesonephros الجنينية (AGM) لتصبح ECs دموية ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) التي تهاجر إلى كبد الجنين ونخاع عظم الجنين ، حيث تبقى بعد الولادة وتولد جميع أنواع خلايا الدم طوال الحياة4. تعد المجموعة المتنوعة من الأنماط الظاهرية EC ضرورية لجميع الأنسجة التنموية وصيانتها.

وبالتالي ، فإن ECs ومشتقاتها هي مكونات حاسمة في الدراسات التي تهدف إلى نمذجة وتوضيح آليات التنمية البشرية و / أو المرض ، وكذلك الطب التجديدي وتطبيقات هندسة الأنسجة5،6،7،8. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لهذه الأنواع من الدراسات هو عدم توفر ECs البشرية الأولية بالكمية المطلوبة. تشير التقديرات إلى أن ما لا يقل عن 3 × 108 ECs ستكون مطلوبة لغالبية التطبيقات العلاجية6. لحل هذه المشكلة ، تم اقتراح استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) نظرا لإمكانات نسبها المتنوعة وقدرتها على توليد أعداد كبيرة من النسل 6,9.

في الواقع ، تم إثبات فائدة الخلايا المشتقة من hESCs أو hiPSCs في دراسات متعددة تركز على نمذجة الأمراض وفحص الأدوية10،11،12. تم استخدام تقنية Organ-on-a-Chip (OOC) لتلخيص فسيولوجيا جسم الإنسان بأمانة أكبر من خلال دمج الخلايا والأنسجة في سقالات ثلاثية الأبعاد. علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق اتصال OOCs الفردية المتعددة (ما يسمى بالجسم أو الإنسان على رقاقة ، BOC / HOC) عبر الموائع الدقيقة للسماح بالحديث المتبادل بين الأجهزة ذات الاهتمام13،14،15. الأنسجة الداعمة ، مثل الأوعية الدموية ، هي مكونات حاسمة في OOCs و BOC / HOCs. يسمح دمج الأوعية الدموية بنقل العناصر الغذائية والأكسجين وعوامل paracrine في جميع أنحاء الأنسجة ، وبالتالي تعزيز البيئة المكروية المطلوبة الخاصة بالأنسجة3،12. وبالتالي ، فإن طرق اشتقاق ECs البشرية الناضجة ، مثل ECs الشريانية والوريدية واللمفاوية والدموية ، ضرورية لتطوير مناهج هندسة الأنسجة هذه.

تم نشر بروتوكولات متعددة توضح بالتفصيل خطوات اشتقاق ECs البدائية أو السلفية البشرية من hESCs أو hiPSCs5،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 . تعتمد العديد من هذه البروتوكولات على تكوين الجسم الجنيني (EB) أو الاستزراع المشترك ل ESCs / iPSCs مع طبقة مغذية للفئران من الخلايا اللحمية. تميل هذه الاستراتيجيات إلى أن تكون صعبة وتستغرق وقتا طويلا ، مع انخفاض غلة EC و / أو تلوث ECs البشرية بخلايا الفئران. البروتوكولات التي تعتمد بشكل صارم على ثقافة 2D دون استخدام الخلايا اللحمية غالبا ما تتطلب تحريضات طويلة ، واستخدام مجموعات معقدة من عوامل النمو و / أو مثبطات للتحريض ، وتمديد فترات التوسع بعد فصل الخلايا ، أو مزيج من هذه العوامل. يوفر تطوير المعرفة بمسارات الإشارات والعوامل المشاركة في اشتقاق أنواع EC الناضجة في الجسم الحي الأساس لبروتوكول تمايز مباشر وقوي في المختبر.

في السابق ، تم تحديد الأدوار الرئيسية لمسارات إشارات Notch و Retinoic Acid (RA) في مواصفات ECs الشريانية والدموية للفأر ، على التوالي ، أثناء التطوير. يلعب مسار إشارات Notch أدوارا متعددة في مواصفات وصيانة النمط الظاهري الشرياني EC. حدد العمل باستخدام نموذج الأوعية الدموية لشبكية العين في الفئران مسارا يؤدي فيه إجهاد قص السوائل إلى تحفيز محور إشارات Notch-Cx37-p27 ، مما يعزز توقف دورة الخلية G1 ، مما يتيح مواصفات EC الشريانية27. تم افتراض أن حالات دورة الخلية تلعب دورا في قرارات مصير الخلية من خلال توفير نوافذ مميزة من الفرص التي تتقبل فيها الخلايا إشارات معينة يمكن أن تحفز التعبير الجيني وتغيرات النمط الظاهري28. مكن هذا الاعتقال G1 بوساطة Notch من التعبير عن الجينات المخصبة في ECs الشريانية ، بما في ذلك ephrinB2 و Cx40 و DLL4 و Notch1 و Notch 4 (تمت مراجعته في29،30). وقد تبين أيضا أن مواصفات EC الدموية يتم الترويج لها في الجسم الحي عبر إشارات RA31,32. حددت دراسات إضافية أنه ، في اتجاه مجرى إشارات RA ، والتعبير عن c-Kit و Notch upregulation p27 ، مما يتيح المواصفات الدموية في كيس صفار الفئران و AGM33. يمكن تحديد ECs الدموية للفأر إلى الحد الأدنى من خلال التعبير عن كل من علامات البطانية (أي CD31 ، KDR) والمكونة للدم (أي c-Kit ، CD34)4. أخيرا ، تخضع ECs الدموية لانتقال بطاني إلى مكون للدم (EHT) لتشكيل HSPCs ، والتي يمكن أن تؤدي إلى ظهور جميع أنواع خلايا الدم4،34،35.

اختبر العمل الأخير ما إذا كان هذا التسلسل الهرمي للإشارات نفسه يمكن أن يعزز مواصفات EC البشرية المسببة للدم. للقيام بذلك ، تم تطوير بروتوكول زراعة 2D خال من المصل والتغذية لاشتقاق ECs الدموية من hESCs ، وتم تمييز ECs الدموية هذه على مستوى خلية واحدة على أنها CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. استفادت هذه الدراسة أيضا من مراسل مؤشر دورة الخلية الفلورية في كل مكان (FUCCI) ، والذي يحدد حالات دورة الخلية المختلفة ، باستخدام H9-hESCs التي تعبر عن بناء مراسل FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. في الدراسات التي أجريت على هذه الخلايا ، ثبت أن التهاب المفاصل الروماتويدي يعزز توقف دورة الخلية G1 المبكر في ECs ، وأن حالة G1 المبكرة تمكن من المواصفات الدموية في المختبر37. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل للتمييز بين هذه الخلايا البطانية البشرية البشرية والمقايسات التي تؤكد هويتها. توفر هذه الطريقة المباشرة وسيلة مفيدة لتوليد هذه المجموعة الفرعية المتخصصة من ECs للدراسات المستقبلية لآليات تطوير خلايا الدم البشرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف والكواشف

ملاحظة: ترد قائمة بالكواشف في جدول المواد.

  1. الحصول على خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات: H1-hESC ، H9-Fucci-hESC.
    ملاحظة: قد يكون توليد ECs الدموية أكثر كفاءة في خط الخلايا H1.
  2. تحضير مخزون بروتين المصفوفة: قم بتقسيم بروتين المصفوفة في أنابيب 1.5 مل مبردة مسبقا (على الثلج) بحيث يحتوي كل أنبوب على 1 ملغ من بروتين المصفوفة. 1 ملغ من بروتين المصفوفة يكفي لتغطية جميع الآبار من صفيحتين من 6 آبار (إجمالي 12 بئرا). قم بتخزين القسمة في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات التي تتضمن مصفوفة البروتين على الثلج أو عند 4 درجات مئوية. قم بإذابة قارورة المرق المجمدة من بروتين المصفوفة على الثلج عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بمجرد إذابتها ، حرك القارورة لضمان خلط المحتويات. قم بتبريد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لمدة ساعة واحدة على الأقل عند -20 درجة مئوية ونقلها إلى الثلج مباشرة قبل الاقتباس.
  3. تحضير ألواح مصفوفة مغلفة بالبروتين: إذابة حصص بروتين مصفوفة على الجليد عند 4 درجات مئوية. أضف 12.5 مل من DMEM: F12 المثلج البارد إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا على الثلج. باستخدام أطراف ماصة مبردة مسبقا ، انقل حصة واحدة (1 مجم) من بروتين المصفوفة إلى الأنبوب المخروطي واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. حاصل 1 مل من بروتين المصفوفة المخفف لكل بئر من ألواح 6 آبار مبردة مسبقا (على الجليد) باستخدام ماصة مصلية مبردة مسبقا. قم بتدوير الألواح وصخورها بحيث يتم طلاء البئر بالكامل بالتساوي. احتضان الألواح لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لبروتين المصفوفة بالتصلب. لف الأطباق بالبارافيلم وخزنها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. استخدام لوحات مصفوفة المغلفة بالبروتين في غضون 2 أسابيع من التحضير.
    ملاحظة: استخدم ألواح 6 آبار مغلفة بالبروتين للتمرير الروتيني للخلايا والتمايز إلى الخلايا البطانية البدائية والدموية المولدة للدم. نفذ جميع الخطوات على الجليد. قبل تبريد 6 ألواح آبار ، وأطراف ماصة ، وماصات مصلية ، وأنابيب مخروطية قبل الاستخدام لمدة 1 ساعة على الأقل عند -20 درجة مئوية. انقل هذه العناصر إلى الثلج عندما تكون جاهزة للاستخدام.
  4. تحضير وسط التمايز الأساسي بإضافة 5 مل من PFHM إلى 100 مل من وسط تمايز الخلايا الجذعية متعدد القدرات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. تحضير 0.1٪ BSA-PBS عن طريق إذابة 0.1 جم BSA في 100 مل PBS. يقوم المرشح بتعقيم BSA-PBS عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  6. تحضير 5 مليمتر حمض الهيدروكلوريك عن طريق تخفيف مخزون حمض الهيدروكلوريك (12 م) 1: 2,400 بالماء. اضبط الرقم الهيدروجيني على 3.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. يقوم المرشح بتعقيم المحلول عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بإعداد أسهم bFGF و BMP4 و VEGF-A وحمض الريتينويك (RA) و DLL4.
    1. bFGF: أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد إلى 100 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA-PBS. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدم مخزون bFGF في غضون 3 أشهر من التحضير. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
    2. BMP4: أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد إلى 1 مجم / مل في 5mM HCl ، درجة الحموضة 3.0. مزيد من التخفيف إلى 50 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA-PBS. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدم مخزون BMP4 في غضون 3 أشهر من التحضير. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
    3. VEGF-A: أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد إلى 1 مجم / مل في dH2O. مزيد من التخفيف إلى 100 ميكروغرام / مل في 0.1 ٪ BSA-PBS. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدم أسهم VEGF-A في غضون 3 أشهر من التحضير. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
    4. RA: أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد إلى 100 مللي متر في DMSO. القسمة وتخزينها في -80 درجة مئوية. استخدم مخزون RA في غضون 1 شهر من التحضير. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: حماية مخزون RA من الضوء.
    5. DLL4: أعد تكوين المسحوق المجفف بالتجميد إلى 1 مجم / مل في برنامج تلفزيوني. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدم مخزون DLL4 في غضون 12 شهرا من التحضير. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
  8. تحضير وسط تمايز الخلايا البطانية مباشرة قبل الاستخدام عن طريق تخفيف VEGF-A و BMP4 في وسط تمايز القاعدة (الخطوة 1.4) بحيث تكون التركيزات النهائية 25 نانوغرام / مل و 50 نانوغرام / مل على التوالي.
  9. قم بإعداد RA العامل مباشرة قبل الاستخدام عن طريق تخفيف مخزون 100 mM 1: 1,000 في DMSO إلى 100 ميكرومتر.
    ملاحظة: حماية RA العاملة من الضوء.
  10. قم بإعداد وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية مباشرة قبل الاستخدام عن طريق تخفيف VEGF-A و BMP4 و RA العامل في وسط التمايز الأساسي (الخطوة 1.4) بحيث تكون التركيزات النهائية 25 نانوغرام / مل و 50 نانوغرام / مل و 0.5 ميكرومتر على التوالي.
  11. قم بإعداد المخزن المؤقت لتلطيخ الأجسام المضادة عن طريق جعل HBSS يحتوي على 10٪ FBS ومكمل بكاشف مضاد للميكروبات مخفف 1: 500. قم بتصفية المخزن المؤقت المعقم واستخدمه على الفور.
  12. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا عن طريق جعل HBSS يحتوي على 1٪ FBS ومكمل بكاشف مضاد للميكروبات مخفف 1: 500. قم بتصفية المخزن المؤقت المعقم واستخدمه على الفور.
  13. تحضير 1 ملغ / مل من مخزون الفبرونيكتين بإضافة 5 مل من الماء المعقم إلى 5 ملغ من الفبرونيكتين المجفف بالتجميد. القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدم مخزون الفبرونيكتين قبل تاريخ انتهاء الصلاحية على ملصق المنتج المجفف بالتجميد. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
  14. تحضير الأطباق 35 ملم المغلفة بالفبرونيكتين. تمييع مخزون الفبرونيكتين (1 ملغ / مل) إلى 4 ميكروغرام / مل في الماء المعقم. أضف 1 مل من محلول طلاء الفبرونيكتين هذا إلى كل طبق واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. استخدم الأطباق مباشرة بعد الطلاء.
  15. قم بإعداد 3 أو 4 مل من الوسط القائم على ميثيل سلولوز باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتخزين القسمة في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم القسمة المتوسطة القائمة على ميثيل سلولوز قبل تاريخ انتهاء الصلاحية المشار إليه على ملصق منتج المخزون. قم بإذابة القسمة مباشرة قبل الاستخدام.
  16. قم بإعداد محلول طلاء DLL4 عن طريق تخفيف مخزون DLL4 البشري المؤتلف إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل في PBS.
  17. تحضير وتخزين وسط نمو الخلايا البطانية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  18. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحليل قياس التدفق الخلوي عن طريق جعل PBS يحتوي على 0.1٪ BSA. قم بتصفية المخزن المؤقت المعقم وخزنه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

2. زراعة الخلايا وتمرير hESCs

  1. اسمح للألواح المغلفة بالبروتين المصفوفة ، ووسط نمو الخلايا الجذعية ، و DMEM: F12 بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتنمية خطوط خلايا hESC في وسط نمو الخلايا الجذعية (2 مل / بئر) على ألواح 6 آبار مغلفة بالبروتين في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  3. افحص الخلايا يوميا وقم بإزالة الخلايا المتمايزة حسب الضرورة عن طريق كشطها برفق من اللوحة باستخدام طرف ماصة p200.
    ملاحظة: ستظهر الخلايا المتمايزة على محيط المستعمرات. ارجع إلى دليل المنتج المتوسط لنمو الخلايا الجذعية للحصول على أمثلة للخلايا المتمايزة في الثقافة.
  4. قم بتمرير الخلايا بمجرد وصولها إلى 70٪ -80٪ التقاء. لتمرير الخلايا ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    ملاحظة: يجب تقسيم الخلايا قبل الوصول إلى التقاء 70٪ -80٪ في حالة حدوث تمايز متزايد.
    1. قم بإزالة الوسط فوق الخلايا واغسله برفق باستخدام 1 مل DMEM: F12 لكل بئر.
    2. أضف 1 مل من DMEM: F12 لكل بئر.
    3. أضف 160 ميكرولتر / مل من Dispase لكل بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 45 دقيقة.
    4. بعد حضانة Dispase ، أضف 1 مل إضافي من DMEM: F12 لكل بئر وماصة برفق لرفع الخلايا.
      ملاحظة: تجنب فصل الخلايا إلى تعليق أحادي الخلية. تمرير الخلايا ككتل صغيرة.
    5. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 12 مل من DMEM: F12 واترك الخلايا تستقر عن طريق الجاذبية (~ 5-10 دقائق).
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 0.5 مل من وسط نمو الخلايا الجذعية لكل بئر من الخلايا المرفوعة للحصول على كتل صغيرة من الخلايا.
      ملاحظة: تجنب فصل الخلايا إلى تعليق أحادي الخلية. تمرير الخلايا ككتل صغيرة.
    7. قم بشفط محلول طلاء البروتين المصفوفة من آبار الصفيحة المطلية بالبروتين المصفوفة المحضرة وأضف 1.5 مل من وسط نمو الخلايا الجذعية لكل بئر.
    8. أضف الحجم المطلوب من الخلايا المعاد تعليقها (الخطوة 2.4.6) إلى كل بئر من الصفيحة المغلفة بالبروتين المحضرة.
    9. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . قم بتغيير الوسط كل 24 ساعة إلى وسط نمو الخلايا الجذعية الطازجة.

3. تمايز hESCs إلى الخلايا البطانية البدائية

  1. اليوم -1: زراعة ومرور الخلايا كما هو موضح أعلاه في القسم 2. بذر الخلايا (الخطوة 2.4.6) في كتل صغيرة (~ 50 ميكرومتر) بكثافة تقارب كتلتين لكل سنتيمتر مربع38.
    ملاحظة: قم بتقييم كثافة البذور وصقلها تجريبيا إذا لزم الأمر.
  2. اليوم 0: 24 ساعة بعد بذر الخلايا ، قم بشفط الوسط من كل بئر واغسل الخلايا برفق باستخدام 1 مل DMEM: F12 لكل بئر. أضف 1 مل من وسط التمايز الأساسي الذي يحتوي على 5 ميكرومتر GSK3i (CHIR99021 ، مضاف طازج) إلى كل بئر واحتضانه لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
    ملاحظة: بالنسبة لجميع خطوات الغسيل ، أضف وسائط الغسيل المشار إليها ببطء إلى اللوحة عن طريق السحب على جدار اللوحة جيدا. حرك اللوحة برفق بحيث يتم تغطية سطح البئر بالكامل بواسطة وسائط الغسيل. قم بإمالة اللوحة قليلا بحيث تتجمع وسائط الغسيل في وضع الساعة السادسة واستنشاق وسائط الغسيل بعناية.
  3. اليوم الأول: قم بشفط الوسط من كل بئر واغسل الخلايا برفق باستخدام 1 مل DMEM: F12 لكل بئر. أضف 1 مل من وسط التمايز الأساسي الذي يحتوي على 50 نانوغرام / مل bFGF (يضاف طازجا ، 1: 2000 من المخزون المجمد) إلى كل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  4. اليوم 2: استنشاق الوسط من كل بئر وغسل الخلايا برفق مع 1 مل من DMEM: F12 لكل بئر. أضف 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية إلى كل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  5. اليوم 3: استبدل الوسط فوق الخلايا ب 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية الطازج لكل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  6. اليوم 4: استبدل الوسط الموجود فوق الخلايا ب 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية الطازج لكل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  7. اليوم الخامس: يقوم نظام FACS بتنقية الخلايا لتقييم النمط الظاهري EC (الأقسام 4-5) أو الاحتفاظ بها في الثقافة والتمايز نحو الخلايا البطانية الدموية (القسم 6).

4. تنقية FACS للخلايا البطانية البدائية

  1. قم بشفط الوسط فوق الخلايا واغسله برفق مرة واحدة باستخدام 1 مل من DMEM: F12 لكل بئر.
  2. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلية لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 12 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، أو حتى تنفصل الخلايا.
  3. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 12 مل من DMEM: F12 والحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ، 1000 × جم.
  4. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 12 مل من DMEM: F12 لغسلها.
  5. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق, 1,000 × غرام.
  6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن تلطيخ الأجسام المضادة الجليدية الباردة وعد الخلايا. اضبط التركيز باستخدام محلول تلطيخ الأجسام المضادة بالثلج البارد إلى 1 × 105 خلايا / مل.
  7. قسم الخلايا بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة على الجليد ، يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 600 ميكرولتر خلايا بمعدل 1 × 105 خلايا / مل ، لتلطيخ الأجسام المضادة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى أربعة أنابيب من الخلايا لتلطيخ ECs البدائية: التحكم غير الملوث ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD31 ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD45 ، والعينة التي تحتوي على كل من الأجسام المضادة CD31 و CD45. يتم توفير معلومات حول الأجسام المضادة في جدول المواد.
  8. أضف الأجسام المضادة إلى الأنابيب التي تحتوي على الخلايا ، حسب الاقتضاء ، واحتضانها على الجليد وحمايتها من الضوء لمدة 30 دقيقة.
    1. تحكم غير ملوث: لا تضيف أي جسم مضاد.
    2. التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD31: أضف الجسم المضاد CD31 فقط.
    3. التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD45: أضف الجسم المضاد CD45 فقط.
    4. عينة: أضف كلا من الأجسام المضادة CD31 و CD45.
      ملاحظة: يجب تحسين تركيز الأجسام المضادة النهائي في العينة ، وكذلك الاقتران الفلوري ، بناء على الأجسام المضادة المحددة وفارز الخلايا المستخدم.
  9. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق منضدية 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم.
  10. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية في 600 ميكرولتر من مخزن الفرز البارد المثلج.
  11. قم بتصفية العينات من خلال أغطية المرشح الشبكية لأنابيب FACS سعة 5 مل وتخزين الخلايا على الجليد ، محمية من الضوء ، للحصول على FACS فوري.
  12. الحصول على الخلايا البطانية البدائية (CD31 + CD45-) ، عن طريق تنفيذ الخطوات التالية.
    1. تحديد عدد الخلايا السلبية CD45 والبوابة (CD45-).
    2. داخل (CD45-) ، حدد عدد الخلايا الإيجابية CD31 (CD31 +) وقم بفرز الخلايا إلى 6 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الباردة الثلجية. استخدم هذه الخلايا للتطبيقات النهائية (انظر القسم 5).

5. الفحص لتأكيد النمط الظاهري للخلية البطانية البدائية

  1. قم بتغطية ثلاثة آبار من لوحة 6 آبار بمحلول طلاء DLL4 سعة 1 مل / بئر لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 . كعنصر تحكم ، قم بتغطية الآبار الثلاثة الأخرى من اللوحة ب 1 مل / بئر PBS.
  2. قم بشفط محلول طلاء DLL4 و PBS ، ولوحة 25000 خلية بطانية بدائية مرتبة (انظر الخطوة 4.12) في 2 مل من وسط نمو الخلايا البطانية لكل بئر.
  3. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 .
  4. نضح الوسط فوق الخلايا واغسله مرة واحدة باستخدام 2 مل / بئر PBS. تحليل الخلايا عن طريق qPCR أو قياس التدفق الخلوي (للخلايا التي تعبر عن بنية FUCCI).
    1. لتحليل الخلايا بواسطة qPCR ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
      1. نضح السائل فوق الخلايا وعزل الحمض النووي الريبي في الخلايا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. قم بإجراء تفاعلات النسخ العكسي باستخدام مزيج رئيسي للنسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      3. قم بإجراء تفاعلات qPCR باستخدام مزيج رئيسي SYBR Green وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
        ملاحظة: يتم سرد البادئات المستخدمة (EFNB2 ، GJA5 ، GJA4 ، NR2F2 ، EPHB4 ، HEY2) في الجدول 1.
    2. لتحليل الخلايا التي تعبر عن بنية FUCCI عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
      1. نضح السائل فوق الخلايا وإضافة 500 ميكرولتر / بئر 0.25٪ تربسين-EDTA.
      2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 حتى يتم رفعها ، ~ 5 دقائق.
      3. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وحبيبات الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق 4 °C لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم.
      4. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحليل قياس التدفق الخلوي الجليدي.
      5. قم بتصفية العينات من خلال غطاء المرشح الشبكي لأنبوب FACS سعة 5 مل وقم بتخزين الخلايا على الجليد ، محميا من الضوء ، لتحليل قياس التدفق الخلوي الفوري.
      6. قم بتحليل النسبة المئوية للخلايا المطلية على DLL4 مقابل عنصر تحكم PBS في أوائل G1 (بدون لون) ، وأواخر G1 (mCherry + / mVenus-) ، و G1 / S (mCherry + / mVenus +) ، و S / G2 / M (mCherry- / mVenus +).

6. تمايز hESCs إلى الخلايا البطانية الدموية

ملاحظة: قم بتمييز الخلايا إلى اليوم 4 ECs البدائية ، كما هو موضح أعلاه في الأقسام 3.1-3.6.

  1. اليوم 5: شفط الوسط فوق الخلايا واغسل الخلايا برفق باستخدام 1 مل من DMEM: F12 لكل بئر. أضف 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية الطازج لكل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  2. اليوم 6: استبدل الوسط الموجود فوق الخلايا ب 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية الطازج لكل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  3. اليوم السابع: استبدل الوسط فوق الخلايا ب 1 مل من وسط تمايز الخلايا البطانية المنشأ حديثا لكل بئر واحتضان 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
  4. اليوم 8: عزل FACS الخلايا البطانية الدموية (انظر القسم 7).

7. عزل FACS للخلايا البطانية الدموية

  1. ارفع واغسل الخلايا كما هو موضح أعلاه في الأقسام 4.1-4.6.
  2. قسم الخلايا بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة على الجليد ، يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 600 ميكرولتر خلايا بمعدل 1 × 105 خلايا / مل ، لتلطيخ الأجسام المضادة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ثمانية أنابيب من الخلايا لتلطيخ الأجسام المضادة ل ECs المسببة للدم: التحكم غير الملوث ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD31 ، التحكم في الأجسام المضادة الفردية CD45 ، التحكم في الأجسام المضادة الفردية KDR ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة c-Kit ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD34 ، التحكم في الأجسام المضادة المفردة VE-cadherin ، والعينة التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة الستة.
    ملاحظة: يتم توفير معلومات الأجسام المضادة في جدول المواد.
  3. أضف الأجسام المضادة إلى الأنابيب التي تحتوي على الخلايا ، حسب الاقتضاء ، واحتضانها على الجليد وحمايتها من الضوء لمدة 30 دقيقة.
    1. تحكم غير ملوث: لا تضيف أجساما مضادة.
    2. التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD31: أضف الجسم المضاد CD31 فقط.
    3. التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD45: أضف الجسم المضاد CD45 فقط.
    4. التحكم في الأجسام المضادة الفردية KDR: أضف الجسم المضاد KDR فقط.
    5. التحكم في الأجسام المضادة المفردة c-Kit: أضف الجسم المضاد c-Kit فقط.
    6. التحكم في الأجسام المضادة المفردة CD34: أضف الجسم المضاد CD34 فقط.
    7. التحكم في الأجسام المضادة VE-cadherin المفرد: أضف فقط الجسم المضاد VE-cadherin.
    8. عينة: إضافة الأجسام المضادة CD31 و CD45 و KDR و c-Kit و CD34 و VE-cadherin.
      ملاحظة: يجب تحسين تركيز الأجسام المضادة النهائي في العينة ، وكذلك الاقتران الفلوري ، بناء على الأجسام المضادة المحددة وفارز الخلايا المستخدم.
  4. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم.
  5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز البارد.
  6. قم بتصفية العينات من خلال غطاء المرشح الشبكي لأنابيب FACS سعة 5 مل وتخزين الخلايا على الجليد ، محميا من الضوء ، للحصول على FACS فوري.
  7. للحصول على خلايا بطانية دموية (CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-) ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. تحديد عدد خلايا CD45 والبوابة (CD45-).
    2. ضمن (CD45-) ، حدد عدد خلايا CD31 + والبوابة (CD31 +).
    3. ضمن (CD31 +) ، حدد عدد خلايا VE-Cadherin والبوابة (CDH5-).
    4. ضمن (CDH5-) ، حدد عدد خلايا c-Kit + والبوابة (KIT +).
    5. ضمن (KIT +) ، حدد عدد خلايا CD34 + والبوابة (CD34 +).
    6. ضمن (CD34 +) ، حدد وفرز خلايا KDR + إلى 6 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا الباردة الثلجية. استخدم هذه الخلايا في التطبيقات النهائية (انظر القسم 8).

8. مقايسة وحدة تشكيل المستعمرة

  1. قم بإذابة حصص الوسط القائم على ميثيل سلولوز باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يكفي قسمة واحدة 3 مل لعينتين وحصة واحدة 4 مل تكفي لثلاث عينات.
  2. عد الخلايا البطانية الدموية التي تم فرزها والتي تم الحصول عليها في الخطوة 7.7.
  3. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، احسب حجم الخلايا التي تم فرزها لإضافتها إلى كل حصص متوسط قائم على ميثيل سلولوز بحيث تحتوي كل عينة على ما لا يقل عن 1000 خلية بطانية دموية.
    ملاحظة: يمكن ضبط عدد الخلايا حسب الضرورة.
  4. أضف الحجم المحسوب للخلايا إلى القسمة المتوسطة القائمة على ميثيل سلولوز ودوامة تماما. اسمح للمزارع المتوسطة القائمة على ميثيل سلولوز بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، أو حتى تتبدد الفقاعات.
  5. نضح محلول طلاء الفبرونيكتين من الأطباق المعدة 35 مم. باتباع تعليمات الشركة الصانعة ، قم بتوزيع 1 مل من الثقافة المتوسطة القائمة على ميثيل سلولوز لكل طبق 35 مم. قم بتدوير الطبق برفق لتوزيع الثقافة بالتساوي.
  6. ضع هذه الأطباق مقاس 35 مم ، بالإضافة إلى طبقين إضافيين مقاس 35 مم مملوءين بالماء المعقم ، داخل طبق زراعة الأنسجة مقاس 15 سم.
  7. احتضان الثقافات في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، ومراقبة الثقافات في اليومين 8 و 14.
    1. في اليوم 8 ، عد مستعمرات CFU-E و BFU-E.
    2. في اليوم 14 ، عد مستعمرات CFU-GM و CFU-GEMM.
      ملاحظة: راجع دليل الوسيط القائم على ميثيل سلولوز لتحديد المورفولوجيا لأنواع المستعمرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 مخططا يوضح مواصفات ECs البدائية و ECs الدموية من hESCs ، وصورة تمثيلية للخلايا بعد 24 ساعة من الطلاء. وفقا للمواصفات ، يتم تنقية ECs البدائية و ECs الدموية في أيام 5 و 8 ، على التوالي. يتم تعريف ECs البدائية على أنها CD31 + CD45- ويتم تعريف ECs الدموية على أنها CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. يظهر الشكل 2 استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي التمثيلية ل ECs البدائية وتنقية EC الدموية المولدة للدم. يتم تحديد الخلايا في البداية بناء على التعبير السلبي ل CD45 والتعبير الإيجابي ل CD31 للحصول على ECs البدائية المنقاة (الشكل 2 أ). للحصول على ECs المنقاة ، يتم عزل الخلايا في البداية كما في الشكل 2A ثم يتم تنقيتها بناء على التعبير الإيجابي أو السلبي (بالترتيب) VE-Cadherin (CDH5) و c-Kit (KIT) و CD34 و KDR (الشكل 2B).

لتقييم إمكانات الخلايا البطانية البدائية CD31 + CD45 المشتقة من H9-Fucci-hES ، المعزولة عبر FACS في اليوم الخامس من التمايز (قسم البروتوكول 4) ، لتؤدي إلى ظهور أنواع فرعية بطانية ، يتم زرع الخلايا المنقاة على ألواح مغلفة إما ب Notch ligand DLL4 للحث على المواصفات الشريانية ، أو PBS (التحكم) ، ويتم تحضينها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية ، 5٪ حاضنة CO2. ثم يتم تحليل الخلايا باستخدام مخزن تحلل الحمض النووي الريبي ، واستخراج الحمض النووي الريبي ، ونسخه عكسيا إلى cDNA ، ويتم إجراء qPCR لمقارنة مستويات التعبير الجيني في الخلايا المعالجة DLL4 مقابل الخلايا الضابطة. كما هو متوقع ، زادت الخلايا البطانية المزروعة على DLL4 من التعبير عن الجين المستجيب للشق HEY2 ، بالإضافة إلى الجينات المرتبطة بالشرايين EFNB2 و GJA5 و GJA4. بالإضافة إلى ذلك ، انخفضت هذه الخلايا أيضا في التعبير عن عامل النسخ الوريدي NR2F2 (الشكل 3 أ). بدلا من ذلك ، لتحديد تأثير معالجة DLL4 على حالة دورة الخلية ، يتم تحضين خلايا CD31 + CD45 المنقاة FACS على ألواح مغلفة إما ب DLL4 أو PBS لمدة 24 ساعة ، ورفعها وتحليلها بناء على تعبير hCdt1 (30/120) -mCherry (أواخر G1) و hGem (1/110) -mVenus (S / G2 / M). تمشيا مع النتائج التي تفيد بأن إشارات Notch تعزز توقف دورة الخلية G1 المتأخرة27 ، يتم القبض على نسبة أكبر من ECs البدائية في أواخر G1 بعد النمو في وجود DLL4 ، مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 3B ، C).

للتحقق من إمكانات المكونة للدم للخلايا البطانية الدموية ، يتم زرع الخلايا البطانية CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- المعزولة من خلال FACS (الطرق في القسم 7) في وسط قائم على ميثيل سلولوز تمت صياغته لنمو الخلايا السلفية المكونة للدم في مقايسات وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) ويسمح لها بالنمو لمدة 14 يوما. يتم حساب مستعمرات الكريات الحمر CFU-E ومستعمرات الكريات الحمراء لوحدة تشكيل الانفجار (BFU) -E في اليوم 8 (الشكل 4 أ ، ب) ، ويتم حساب الخلايا المحببة / البلاعم CFU-GM و GFU-GEMM (المحببة ، كريات الدم الحمراء ، الضامة ، وخلايا النواة) مستعمرات السلف المكونة للدم متعددة القدرات في اليوم 14 (الشكل 4C و D). لكل 1000 ECs دموية المغنطة ، يتم إنشاء ما يقرب من 20 CFU (الشكل 4F). يمكن أيضا رؤية الخلايا ذات مورفولوجيا الخلايا البطانية في الثقافات (الشكل 4E) ؛ هذه هي الخلايا البطانية الدموية التي تؤدي إلى أسلاف المكونة للدم متعددة السلالات على مستوى خلية واحدة37.

Figure 1
الشكل 1: بروتوكول لتحديد ECs البدائية والدموية (أ) رسم تخطيطي لبروتوكول التمايز. يتم طلاء الخلايا الجذعية الجنينية في اليوم -1 على ألواح مصفوفة مغلفة بالبروتين ويسمح لها بالالتصاق طوال الليل. ثم تتم معالجة الخلايا في اليومين 0 و 1 بمثبط GSK3i (CHIR99021) و bFGF ، على التوالي ، للحث على الخط البدائي ومواصفات الأديم المتوسط ، على التوالي. بدءا من اليوم 2 ، تتم معالجة الخلايا بمزيج من BMP4 و VEGF-A لتعزيز تطور EC البدائي. ECs البدائية (الدائرة الحمراء) يتم تنقية FACS في اليوم 5. بدلا من ذلك ، لتوليد ECs دموية ، يتم تبادل الوسط فوق ECs البدائية في اليوم 5 إلى وسط تمايز دموي جديد يحتوي على BMP4 و VEGF-A و RA. يتم استبدال هذه الوسيلة يوميا حتى اليوم 8 ، عندما يتم تنقية ECs (النجم الأحمر) FIXS. (ب) المستعمرات في اليوم 0 من التمايز ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تعديل اللوحة A من Qiu et al.37 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ل ECs الدموية المشتقة من hESCs. استراتيجية بوابة التدفق الخلوي التمثيلية لتنقية (أ) ECs البدائية و (B) ECs الدموية. لاحظ أنه نظرا لأن ECs الدموية مشتقة من ECs البدائية ، فإن استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي ل CD45 و CD31 متطابقة لكلا مجموعتي الخلية. تظهر في الصف العلوي من كل لوحة (عينة) خلايا تم تمييزها إلى ECs دموية كما هو موضح في قسم البروتوكول 6 وملطخة بالأجسام المضادة كما هو موضح في قسم البروتوكول 7.3.8. تظهر في الصف السفلي من كل لوحة (تحكم) خلايا غير ملوثة تم تمييزها لمدة 8 أيام دون علاج التهاب المفاصل الروماتويدي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: يؤدي تحريض DLL4 لخلايا H9-Fucci CD31 + CD45- البطانية البدائية إلى توقف G1 المتأخر وزيادة التعبير الجيني الشرياني. (أ) علاج DLL4 للخلايا البطانية البدائية المشتقة من CD31 + CD45- H9-hESC التي تعبر عن بناء Fucci المنقى في اليوم 5 من التمايز يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات الشريانية (i-iii) والجين المستجيب للشق Hey2 (v) ، الذي يصاحبه انخفاض مصاحب في التعبير عن الجين الوريدي NR2F2 (iv). (ب) مخططات FACS التمثيلية التي توضح توزيع حالة دورة الخلية ل 5000 CD31 + CD45 مشتق من H9-Fucci - نمت على PBS (التحكم) أو DLL4 لمدة 24 ساعة. (C) ينتج عن تحريض DLL4 زيادة بنسبة 15٪ في الخلايا في أواخر مرحلة G1 مقارنة بالسيطرة. البيانات هي متوسط العينات الثلاثية من نفس التجربة الموضحة في اللوحة (ب). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تحليل إمكانات المكونة للدم ل ECs الدموية المشتقة من hESCs. صور تمثيلية توضح مورفولوجيا H1-hESC المشتقة (A) مستعمرة الكريات الحمر CFU-E (شريط المقياس = 35 ميكرومتر) ، (B) مستعمرة الكريات الحمر BFU-E (شريط المقياس = 75 ميكرومتر) ، (C) مستعمرة الخلايا المحببة / البلاعم CFU-GM ، (D) مستعمرة السلف المكونة للدم CFU-GEMM متعددة القدرات ، و (E) مستعمرة الخلايا المحببة / البلاعم CFU-GM مع الخلايا البطانية الأساسية (ECs) (الأسهم الحمراء). (F) عدد وتوزيع وحدات CFU المكونة لكل 1000 خلية بطانية دموية مطلية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في (C-E). يمكن العثور على صور إضافية لوحدات CFU المتباينة باستخدام هذا البروتوكول في Qiu et al.37. تم تعديل اللوحة F من Qiu et al.37 بإذن من Elsevier. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم أمامي عكس
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGTGA GTCCGCATCGCTCTCATAGTA
جي جي ايه 5 CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
جي جي ايه 4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
HEY2 GCCCCCCTTGTCAGTATC CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTGG
NR2F2 GGACCACATACGGATCTTCCAA ACATCAGACAGACCACAGGCAT

الجدول 1: معلومات التمهيدي qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، يتم تحديد خطوات إنتاج الخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في حوالي أسبوع واحد باستخدام نظام زراعة 2D خال من تغذية الفئران والمصل (الشكل 1). يتوسع هذا البروتوكول في طريقة وصفها Sriram et al. (2015) للحصول على ECs38 البدائية. يتم توضيح الطبيعة البدائية وإمكانات المواصفات ل CD31 + CD45- ECs من خلال زراعة هذه الخلايا على ألواح مغلفة ب DLL4 ومراقبة تغيرات التعبير الجيني بما يتفق مع المواصفات الشريانية (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط اكتساب الهوية الشريانية بتوقف دورة الخلية G1 المتأخرة (الشكل 3) ، وهو ما يتوافق مع الدراسات السابقة27. بعد زراعة ECs البدائية لمدة 3 أيام إضافية في وجود 0.5 ميكرومتر RA و 25 نانوغرام / مل BMP4 و 50 نانوغرام / مل VEGF-A ، كان من الممكن توليد وعزل ECs الدموية FACS (الشكل 2) القادرة على ظهور CFU-erythroid ، BFU-erythroid ، CFU-المحببات / الضامة ، و CFU-المحببة ، كريات الدم الحمراء ، الضامة ، ومستعمرات الخلايا الضخمة (الشكل 4 ). باستخدام هذه الطريقة في دراسة نشرت مؤخرا ، لوحظ أن تغيرات التعبير الجيني على مدى فترة زمنية مدتها 8 أيام تتفق مع فقدان تعدد القدرات ، والخط البدائي ، وتحريض الأديم المتوسط ، واكتساب هوية الخلية البطانية ، وأخيرا الهوية المكونة للدم37. علاوة على ذلك ، تسبب علاج التهاب المفاصل الروماتويدي في إيقاف دورة الخلية G1 المبكر لتمكين مواصفات EC الدموية37.

في الآونة الأخيرة ، وصف Ohta et al. (2019) بروتوكولا للتمييز بين ECs الدموية من hPSCs39. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموصوف أعلاه يوفر مزايا كبيرة: 1) هذه الطريقة لا تتطلب تشكيل كرويات. 2) يستخدم هذا البروتوكول حاضنة قياسية 37 °C ، 5٪ CO2 بدلا من حاضنة نقص الأكسجين ، مما يلغي الحاجة إلى معدات متخصصة مخصصة ؛ و 3) يستخدم هذا البروتوكول وسيطا واحدا فقط (وسيط تمايز الخلايا الجذعية متعدد القدرات المكمل ب PFHM) ، وهي ميزة لتوفير التكاليف ، بينما يتطلب بروتوكول Ohta وسيطين للتحريض. وصفت دراسة أخرى نشرت مؤخرا بواسطة Galat et al. (2017) بروتوكولا تم فيه استخدام تحريض CHIR99021 لتوليد مجموعة من الخلايا البطانية الدموية CD34 + 40. عبرت هذه الخلايا أيضا عن CD31 وكانت قادرة على إثارة الخلايا البطانية عند زراعتها في ظل ظروف أحادية الطبقة أو الخلايا التي تعبر عن علامات النخاعي واللمفاوية بعد الزراعة المشتركة مع خلايا OP9 أو OP9-DLL4 ، على التوالي ، في وجود سيتوكينات إضافية. يمكن أن تؤدي الحاجة إلى زراعة مشتركة إضافية إلى تلوث محتمل لمجموعات الخلايا المرغوبة بخلايا الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن Ohta et al. و Galat et al. استخدموا فترة تحريض دموي كانت أقصر من تلك الموصوفة هنا (4 أيام و 5 أيام ، على التوالي مقابل 8 أيام) ، فقد عرف كلاهما ECs الدموية على أنها CD34 + ، في حين استخدم هذا البروتوكول تعريفا أكثر صرامة: CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- . بينما يتم التعرف على CD34 كعلامة على الخلايا المكونة للدم ، يتم التعبير عنها أيضا بواسطة أنواع أخرى من الخلايا غير المكونة للدم ، مثل الخلايا اللحمية المتوسطة والخلايا البطانية41. وبالتالي فإن تعريف ECs الدموية في هذا البروتوكول (CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-) أكثر صرامة ويمثل مجموعة سكانية أكثر تحديدا.

أحد القيود على استخدام hESCs أو hiPSCs في التطبيقات العلاجية هو العدد الكبير من الخلايا المطلوبة ، وتقتصر طرق اشتقاق 2D القياسية في المقام الأول على التمايز على نطاق صغير. باستخدام خطوط hiPSC ، أظهر Olmer et al. (2018) جدوى زيادة إنتاج CD31 + ECs الوظيفية التي عبرت عن علامات الخلايا الشريانية (DLL4) والوريدية (EPHB4) باستخدام إما ثقافة التعليق أو مفاعل حيوي للخزان المتحرك6. الأهم من ذلك ، أظهروا أنهم كانوا قادرين على الحصول على 1.18 × 107 CD31 + ECs التي تعبر عن CD34 و KDR من قارورة واحدة تحتوي على ثقافة تعليق 20 مل. من أجل الحصول على 3 × 108 ECs المطلوبة اللازمة لغالبية التطبيقات العلاجية ، ستكون هناك حاجة إلى ما يزيد قليلا عن دورقتين سعة 500 مل6. يجب أن تستكشف التجارب المستقبلية تطبيق تقنيات التحجيم على البروتوكول المقدم هنا لإنتاج ECs الدموية على نطاق واسع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL128064 و U2EB017103. تم تقديم مزيد من الدعم من خلال منحة CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 169 ، الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، الخلايا البطانية البشرية ، الخلايا البطانية الدموية ، الخلايا البطانية الشريانية ، بروتوكول زراعة الخلايا ، التمايز الموجه
التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter