Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

Abstract

כלי הדם מופצים בכל מקום בתוך כל רקמות הגוף ומבצעים פונקציות מגוונות. לפיכך, נגזרת של תאי אנדותל וסקולריים בוגרים, המרפדים את לומן כלי הדם, מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא חיונית למגוון יישומים של הנדסת רקמות והתחדשות. in vivo, תאי אנדותל קדמוניים נגזרים מהשושלת המזודרמלית ומוגדרים לתת-סוגים ספציפיים, כולל עורקים, ורידים, נימים, המוגניים ולימפטיים. תאי אנדותל המוגניים מעניינים במיוחד מכיוון שבמהלך ההתפתחות הם מעוררים תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים, אשר לאחר מכן מייצרים את כל שושלות הדם לאורך החיים. לפיכך, יצירת מערכת ליצירת תאי אנדותל המוגניים במבחנה תספק הזדמנות לחקור את המעבר מהאנדותל-להמטופויטים, ועשויה להוביל לייצור ex vivo של מוצרי דם אנושיים ולהפחתת ההסתמכות על תורמים אנושיים. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים לגזירת תאי אנדותל אבניים וקדמוניים, לא תואר ייצור של תאי אנדותל המוגני מאופיינים היטב מתאי גזע אנושיים. כאן מוצגת שיטה לגזירת תאי אנדותל המוגני מתאי גזע עובריים אנושיים תוך כשבוע: פרוטוקול התמיינות עם תאי פס פרימיטיביים שנוצרו בתגובה למעכב GSK3β (CHIR99021), לאחר מכן אינדוקציה של שושלת מזודרם בתיווך bFGF, לאחר מכן התפתחות תאי אנדותל ראשוניים המקודמים על ידי BMP4 ו- VEGF-A, ולבסוף מפרט תאי אנדותל המוגני המושרה על ידי חומצה רטינואית. פרוטוקול זה מניב אוכלוסייה מוגדרת היטב של תאי אנדותל המוגני שניתן להשתמש בהם כדי להבין עוד יותר את הוויסות המולקולרי שלהם ואת המעבר האנדותל-להמטופוייטי, שיש לו פוטנציאל להיות מיושם על יישומים טיפוליים במורד הזרם.

Introduction

תאי אנדותל (ECs) הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המבצעים פונקציות מרובות בכל גוף האדם וברקמות מהונדסות. בנוסף לתמיכה וויסות סוגי תאים אחרים (כלומר, קרדיומיוציטים1, תאים אוסטאובלסטיים2), תפקודים אלה כוללים יצירת מחסום סלקטיבי בין הדם לרקמות וסיוע ביצירת רקמות3. הבחנה של ECs בוגרים במהלך התפתחות תקינה דורשת מסלולי איתות מגוונים. ECs קדמוניים נגזרים מאבות מזודרם, ולאחר מכן מוגדרים לעבר פנוטיפים עורקיים, ורידיים, נימיים ולימפתיים בוגרים4. בנוסף, תת-קבוצה קטנה של ECs בשק החלמון החוץ-עוברי ובאזור אבי העורקים-גונאד-מזונפרוס העוברי (AGM) מוגדרים גם הם כ-ECs המוגניים, אשר מעוררים תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) הנודדים לכבד העוברי ולמח העצם העוברי, שם הם נשארים לאחר הלידה ומייצרים את כל סוגי תאי הדם לאורך החיים4. המגוון המגוון של פנוטיפים של EC חיוני לכל פיתוח ותחזוקה של רקמות.

לפיכך, ECs ונגזרותיהם הם מרכיבים קריטיים במחקרים שמטרתם מידול, והבהרת מנגנונים של, התפתחות אנושית ו / או מחלה, כמו גם רפואה רגנרטיבית ויישומי הנדסת רקמות 5,6,7,8. עם זאת, המגבלה העיקרית עבור סוגים אלה של מחקרים היא חוסר הזמינות של ECs אנושיים ראשוניים בכמות הנדרשת. ההערכה היא כי מינימום של 3 x 108 ECs יידרש עבור רוב היישומים הטיפוליים6. כדי לפתור בעיה זו, הוצע השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ובתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בשל פוטנציאל השושלת המגוון שלהם ויכולתם לייצר מספר גדול של צאצאים 6,9.

ואכן, התועלת של תאים שמקורם בתאי גזע עובריים או hiPSCs הוכחה במחקרים רבים שהתמקדו במידול מחלות ובבדיקת תרופות10,11,12. טכנולוגיית איבר על שבב (OOC) שימשה כדי לשחזר בצורה נאמנה יותר את הפיזיולוגיה של גוף האדם על ידי שילוב תאים ורקמות בפיגומים תלת-ממדיים. יתר על כן, חיבור של מספר OOCs בודדים (מה שמכונה גוף או אדם על שבב, BOC/HOC) יכול להתבצע באמצעות מיקרופלואידיקה כדי לאפשר הצלבה בין האיברים המעניינים13,14,15. רקמות תומכות, כגון כלי הדם, הן מרכיבים קריטיים של OOCs ו- BOC / HOCs; שילוב כלי הדם מאפשר הובלה של חומרים מזינים, חמצן וגורמים פרקריניים ברחבי הרקמות, ובכך מקדם את המיקרו-סביבה הספציפית לרקמותהנדרשת 3,12. לפיכך, שיטות לגזירת ECs אנושיים בוגרים, כגון ECs עורקיים, ורידיים, לימפתיים והמוגניים, הן חיוניות לקידום גישות הנדסת רקמות אלה.

פורסמו פרוטוקולים מרובים המפרטים שלבים לנגזרת של ECs קדמוניים או אבות אנושיים מ- hESCs או hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . רבים מהפרוטוקולים הללו מסתמכים על היווצרות גוף עוברי (EB) או על תרבית משותפת של תאי גזע עובריים/iPSCs עם שכבת הזנה מורין של תאים סטרומליים. אסטרטגיות אלה נוטות להיות קשות וגוזלות זמן, עם תפוקות EC נמוכות ו / או זיהום של ECs אנושיים עם תאי מורין. פרוטוקולים המסתמכים אך ורק על תרבית דו-ממדית ללא שימוש בתאים סטרומליים דורשים לעתים קרובות אינדוקציות ארוכות, משתמשים בשילובים מורכבים של גורמי גדילה ו/או מעכבים לצורך אינדוקציה, יש תקופות התרחבות ממושכות לאחר הפרדת תאים, או שילוב של גורמים אלה. קידום הידע על מסלולי איתות וגורמים המעורבים בגזירת סוגי EC בוגרים in vivo מספק את הקרקע לפרוטוקול בידול חוץ גופי פשוט וחזק.

בעבר זוהו תפקידי מפתח עבור מסלולי איתות של Notch וחומצה רטינואית (RA) במפרט של ECs עורקיים והמוגני של מורין, בהתאמה, במהלך הפיתוח. מסלול האיתות Notch ממלא תפקידים מרובים במפרט ובתחזוקה של פנוטיפ EC עורקי. עבודה באמצעות מודל כלי הדם ברשתית מורין זיהתה מסלול שבו לחץ גזירה נוזלי משרה ציר איתות Notch-Cx37-p27, המקדם מעצר מחזור תאי G1, המאפשר מפרט EC עורקי27. ההשערה היא שמצבי מחזור התא ממלאים תפקיד בהחלטות על גורל התא על ידי מתן חלונות הזדמנויות ברורים שבהם התאים פתוחים לאותות מסוימים שיכולים לגרום לביטוי גנים ולשינויים פנוטיפיים28. מעצר G1 זה בתיווך Notch איפשר ביטוי של גנים המועשרים ב-ECs עורקיים, כולל אפריןB2, Cx40, DLL4, Notch1 ו-Notch 4 (שנסקרב-29,30). כמו כן, הוכח כי מפרט EC המוגני מקודם in vivo באמצעות איתות RA31,32. מחקרים נוספים זיהו כי, במורד הזרם של איתות RA, ביטוי של c-Kit ו- Notch מעלה את p27, המאפשר מפרט המוגני בשק החלמון מורין וב- AGM33. ניתן לזהות באופן מינימלי ECs המוגני של מורין על ידי ביטוי של סמני אנדותל (כלומר, CD31, KDR) והמטופויאטיים (כלומר, c-Kit, CD34)4. לבסוף, ECs המוגני עוברים מעבר אנדותל-להמטופוייטי (EHT) ליצירת HSPCs, אשר יכול להוליד את כל סוגי תאי הדם 4,34,35.

עבודות אחרונות בדקו אם אותה היררכיית איתות יכולה לקדם מפרט EC המוגני אנושי. לשם כך, פותח פרוטוקול תרבית דו-ממדית ללא סרום ומזין להפקת ECs המוגניים מ-hESCs, ו-ECs המוגניים אלה אופיינו ברמת תא יחיד כ-CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. מחקר זה ניצל גם את הכתב מחוון מחזור תא יוביקוויטינציה פלואורסצנטי (FUCCI), המזהה מצבי מחזור תאים שונים, תוך שימוש ב- H9-hESCs המבטאים את מבנה כתב FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. במחקרים עם תאים אלה, הוכח כי RA מקדם מעצר מוקדם של מחזור תאי G1 ב-ECs, ומצב G1 מוקדם מאפשר אפיון המוגני במבחנה37. כאן, פרוטוקול מפורט להתמיינות של תאי אנדותל המוגני אנושיים אלה ובדיקות המאשרות את זהותם מסופקים. שיטה פשוטה זו מספקת אמצעי שימושי ליצירת תת-קבוצה מיוחדת זו של ECs למחקרים עתידיים של מנגנונים של התפתחות תאי דם אנושיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ריאגנטים והכנת ריאגנטים

הערה: רשימת ריאגנטים מופיעה בטבלת החומרים.

  1. השג את קווי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    הערה: הדור של ECs המוגני עשוי להיות יעיל יותר בקו התאים H1.
  2. הכן מלאי חלבון מטריצה: Aliquot חלבון המטריצה לתוך צינורות מקורר מראש 1.5 מ"ל (על קרח) כך שכל צינור מכיל 1 מ"ג של חלבון מטריצה. 1 מ"ג של חלבון מטריקס מספיק כדי לצפות את כל הבארות של שתי צלחות 6 בארות (12 בארות בסך הכל). יש לאחסן את האליקוטים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
    הערה: בצע את כל השלבים הכוללים חלבון מטריצה על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. הפשירו את בקבוקון המלאי הקפוא של חלבון מטריקס על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר ההפשרה, סובבו את הבקבוקון כדי לוודא שהתכולה מעורבבת. Prechill 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge לפחות 1 שעה ב -20 °C ולהעביר לקרח מיד לפני aliquoting.
  3. הכינו צלחות מצופות חלבון מטריצה: אליקוטים של חלבון מטריצת הפשרה על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף 12.5 מ"ל של DMEM:F12 קר כקרח לצינור חרוטי מוכן מראש על קרח. תוך שימוש בקצות פיפטה מקוררים מראש, מעבירים אליקוט אחד (1 מ"ג) של חלבון מטריצה לצינור החרוטי ומערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. Aliquot 1 מ"ל של חלבון המטריצה המדולל לכל באר של צלחות 6 בארות מקוררות מראש (על קרח) באמצעות פיפטה סרולוגית מקוררת מראש. מערבלים ומנדנדים את הצלחות כך שהבאר כולה מצופה באופן שווה. דגרו את הצלחות למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לחלבון המטריצה להתמצק. עוטפים את הצלחות בפרפילם ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להשתמש בצלחות מצופות חלבון מטריצה תוך שבועיים מההכנה.
    הערה: השתמש בלוחות 6-well המצופים בחלבון מטריצה לצורך מעבר שגרתי של תאים והתמיינות לתאי אנדותל ראשוניים והמוגניים. בצע את כל השלבים על קרח. יש לצנן מראש צלחות 6 בארות, קצות פיפטה, פיפטות סרולוגיות וצינורות חרוטיים לפני השימוש במשך שעה אחת לפחות ב-20 מעלות צלזיוס. העבירו את הפריטים האלה לקרח כשהם מוכנים לשימוש.
  4. הכן את מדיום התמיינות הבסיס על ידי הוספת 5 מ"ל של PFHM ל -100 מ"ל של מדיום התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן 0.1% BSA-PBS על ידי המסת 0.1 גרם BSA ב 100 מ"ל PBS. מסנן לעקר BSA-PBS על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  6. יש להכין 5 mM HCl על ידי דילול מלאי HCl (12 M) 1:2,400 עם מים. התאם את ה-pH ל-3.0 באמצעות NaOH. מסנן לעקר את התמיסה על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. הכינו מלאי bFGF, BMP4, VEGF-A, חומצה רטינואית (RA) ו-DLL4.
    1. bFGF: שחזרו את האבקה הליופילית ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.1% BSA-PBS. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (75 °F). יש להשתמש במלאי bFGF תוך 3 חודשים מההכנה. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
    2. BMP4: צור מחדש את האבקה הליופילית ל-1 מ"ג/מ"ל ב-5mM HCl, pH 3.0. דילול נוסף ל-50 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.1% BSA-PBS. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (75 °F). השתמש במניות BMP4 תוך 3 חודשים מההכנה. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
    3. VEGF-A: שחזרו את האבקה הליופילית ל-1 מ"ג/מ"ל ב-dH2O. דילול נוסף ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.1% BSA-PBS. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (75 °F). יש להשתמש במלאי VEGF-A תוך 3 חודשים מההכנה. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
    4. RA: שחזר את האבקה הליופילית ל-100 mM ב-DMSO. Aliquot ולאחסן ב -80 °C (80 °F). השתמש במלאי RA תוך חודש אחד מההכנה. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
      הערה: הגן על מניות RA מפני אור.
    5. DLL4: שחזרו את האבקה הליופילית ל-1 מ"ג/מ"ל ב-PBS. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (75 °F). השתמש במלאי DLL4 תוך 12 חודשים מההכנה. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
  8. הכן את מדיום התמיינות תאי האנדותל מיד לפני השימוש על ידי דילול VEGF-A ו- BMP4 במדיום התמיינות בסיס (שלב 1.4) כך שהריכוזים הסופיים יהיו 25 ננוגרם/מ"ל ו-50 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה.
  9. הכן את ה-RA העובד מיד לפני השימוש על-ידי דילול מלאי של 100 mM ביחס של 1:1,000 ב-DMSO ל-100 מיקרומטר.
    הערה: הגן על RA עובד מפני אור.
  10. הכינו את מדיום התמיינות תאי האנדותל ההמוגני מיד לפני השימוש על ידי דילול VEGF-A, BMP4 ו-RA עובד במדיום התמיינות בסיס (שלב 1.4) כך שהריכוזים הסופיים יהיו 25 ננוגרם/מ"ל, 50 ננוגרם/מ"ל ו-0.5 מיקרומטר, בהתאמה.
  11. הכינו את מאגר מכתים הנוגדנים על ידי הכנת HBSS המכיל 10% FBS ותוסף עם ריאגנט אנטי מיקרוביאלי מדולל 1:500. סנן סטרילי את המאגר והשתמש בו באופן מיידי.
  12. הכן את מאגר מיון התאים על-ידי יצירת HBSS המכיל 1% FBS ותוסף עם מגיב אנטי-מיקרוביאלי מדולל 1:500. סנן סטרילי את המאגר והשתמש בו באופן מיידי.
  13. הכינו מלאי פיברונקטין במינון 1 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 5 מ"ל מים סטריליים ל-5 מ"ג פיברונקטין שעבר ליאופיליזציה. Aliquot ולאחסן ב -20 °C (75 °F). השתמש במלאי הפיברונקטין לפני תאריך התפוגה על תווית המוצר הליופילי. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
  14. מכינים את הכלים המצופים בפיברונקטין בקוטר 35 מ"מ. יש לדלל את מלאי הפיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל) ל-4 מיקרוגרם/מ"ל במים סטריליים. מוסיפים 1 מ"ל מתמיסת ציפוי פיברונקטין זו לכל צלחת ומדגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה. השתמשו בכלים מיד לאחר הציפוי.
  15. הכינו 3 או 4 מ"ל אליקוטים של מדיום מבוסס מתילצלולוז בהתאם להוראות היצרן. יש לאחסן את האליקוטים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. יש להשתמש ב-aliquots הבינוניים על בסיס מתילצלולוז לפני תאריך התפוגה המצוין על תווית המוצר במלאי. הפשירו את האליקוטים מיד לפני השימוש.
  16. הכן את תמיסת הציפוי DLL4 על-ידי דילול מלאי DLL4 אנושי רקומביננטי לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS.
  17. הכן ואחסן את מדיום צמיחת תאי האנדותל בהתאם להוראות היצרן.
  18. הכן את מאגר ניתוח הציטומטריה של הזרימה על ידי יצירת PBS המכיל 0.1% BSA. מסננים סטריליים את המאגר ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

2. תרבית תאים והעברה של תאי גזע עובריים

  1. אפשרו ללוחות המצופים בחלבון המטריצה, למדיום הגדילה של תאי הגזע ול-DMEM:F12 להתחמם לטמפרטורת החדר.
  2. לגדל את קווי תאי ה-hESC במדיום גדילת תאי גזע (2 מ"ל/באר) על לוחות 6 בארות מצופים חלבון מטריצה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  3. בדוק את התאים מדי יום והסר את התאים הממוינים לפי הצורך על-ידי גירוד עדין שלהם מהצלחת באמצעות קצה פיפטה p200.
    הערה: תאים ממוינים יופיעו בשולי מושבות. עיין במדריך המוצר של מדיום גידול תאי גזע לקבלת דוגמאות לתאים ממוינים בתרבית.
  4. מעבירים את התאים ברגע שהם מגיעים למפגש של 70%-80%. כדי לעבור תאים, בצע את השלבים הבאים.
    הערה: יש לפצל את התאים לפני שהם מגיעים למפגש של 70%-80% אם מתרחשת התמיינות מוגברת.
    1. הסר את המדיום מעל התאים ושטוף בעדינות עם 1 מ"ל DMEM:F12 לכל באר.
    2. הוסף 1 מ"ל של DMEM:F12 לכל באר.
    3. יש להוסיף 160 μL/mL של Dispase לכל באר ולדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 למשך 45 דקות.
    4. לאחר הדגירה של Dispase, יש להוסיף 1 מ"ל נוספים של DMEM:F12 לכל באר ופיפטה עדינה כדי להרים את התאים.
      הערה: הימנע מניתוק התאים לתרחיף חד-תאי. מעבירים את התאים כגושים קטנים.
    5. העבירו את התאים לצינור חרוטי המכיל 12 מ"ל של DMEM:F12 ואפשרו לתאים להתיישב בכוח הכבידה (~5-10 דקות).
    6. הסר את הסופרנטנט ושלח בעדינות את הכדור ב-0.5 מ"ל של מדיום צמיחת תאי גזע לכל באר של תאים מורמים כדי להשיג גושים קטנים של תאים.
      הערה: הימנע מניתוק התאים לתרחיף חד-תאי. מעבירים את התאים כגושים קטנים.
    7. שאפו את תמיסת ציפוי חלבון המטריצה מהבארות של הלוח המצופה בחלבון מטריצה מוכנה והוסיפו 1.5 מ"ל של מדיום צמיחת תאי הגזע לכל באר.
    8. הוסף את הנפח הרצוי של תאים שעברו החייאה (שלב 2.4.6) לכל באר של צלחת מצופה חלבון מטריצה מוכנה.
    9. דגירה של הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 . שנה את המדיום כל 24 שעות למדיום צמיחת תאי גזע טריים.

3. התמיינות של hESCs לתאי אנדותל ראשוניים

  1. יום -1: תרבית ומעבר התאים כמתואר לעיל בסעיף 2. זרע את התאים (שלב 2.4.6) בגושים קטנים (~50 מיקרומטר) בצפיפות של כ-2 גושים לסנטימטר מרובע38.
    הערה: הערך את צפיפות הזרעים ושכלל באופן אמפירי במידת הצורך.
  2. יום 0: 24 שעות לאחר זריעת התאים, שאפו את המדיום מכל באר ושטפו בעדינות את התאים עם 1 מ"ל DMEM:F12 לכל באר. יש להוסיף 1 מ"ל ממדיום ההתמיינות הבסיסי המכיל 5 μM GSK3i (CHIR99021, נוסף טרי) לכל באר ולדגירה במשך 24 שעות (37 °C, 5% CO2).
    הערה: עבור כל שלבי הכביסה, הוסיפו באיטיות את מצע הכביסה המצוין לצלחת על ידי ניתור היטב על דופן הצלחת. מסובבים בעדינות את הצלחת כך שכל פני השטח של הבאר מכוסים על ידי מדיית שטיפה. הטה מעט את הצלחת כך שמדיית הכביסה תתקרב למצב השעה שש ושאף בזהירות את מדיית הכביסה.
  3. יום 1: שאפו את המדיום מכל באר ושטפו בעדינות את התאים עם 1 מ"ל DMEM:F12 לכל באר. הוסיפו 1 מ"ל ממדיום ההבחנה הבסיסי המכיל 50 ננוגרם/מ"ל bFGF (נוסף טרי, 1:2,000 ממלאי קפוא) לכל באר ודגרו 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  4. יום 2: שאפו את המדיום מכל באר ושטפו בעדינות את התאים עם 1 מ"ל של DMEM:F12 לכל באר. מוסיפים 1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי האנדותל לכל באר ודוגרים 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  5. יום 3: החליפו את המדיום שמעל התאים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי אנדותל טרי לכל באר ודגרו 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  6. יום 4: החליפו את המדיום שמעל התאים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי אנדותל טרי לכל באר ודגרו 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  7. יום 5: FACS מטהרים את התאים כדי להעריך פנוטיפ EC (סעיפים 4-5) או לשמור בתרבית ולהתמיין לתאי אנדותל המוגניים (סעיף 6).

4. טיהור FACS של תאי אנדותל ראשוניים

  1. שאפו את המדיום מעל התאים ושטפו בעדינות פעם אחת עם 1 מ"ל של DMEM:F12 לכל באר.
  2. יש להוסיף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל באר ולדגור על התאים למשך 12 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 , או עד שהתאים מתנתקים.
  3. העבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי המכיל 12 מ"ל של DMEM:F12 וכדור על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות, 1,000 x גרם.
  4. יש להסיר את ה-supernatant ולהשהות את הכדור ב-12 מ"ל של DMEM:F12 כדי לשטוף.
  5. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות, 1,000 x גרם.
  6. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדור התא במאגר מכתים נוגדנים קרים כקרח וספור את התאים. התאם את הריכוז באמצעות חיץ מכתים של נוגדנים קרים כקרח ל-1 x10 5 תאים למ"ל.
  7. חלקו את התאים באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח, שכל אחד מהם מכיל מינימום של 600 תאי μL ב-1 x 105 תאים /מ"ל, לצביעת נוגדנים.
    הערה: ארבע שפופרות של תאים נדרשות לצביעת ECs ראשוניים: בקרה לא מוכתמת, בקרת נוגדנים בודדים CD31, בקרת נוגדנים בודדים CD45 ודגימה המכילה נוגדנים CD31 ו- CD45. מידע על נוגדנים מסופק בטבלת החומרים.
  8. מוסיפים נוגדנים לצינורות המכילים תאים, לפי הצורך, ודוגרים על קרח ומוגנים מפני אור למשך 30 דקות.
    1. בקרה לא מוכתמת: אין להוסיף נוגדן.
    2. בקרת נוגדן יחיד CD31: יש להוסיף נוגדן CD31 בלבד.
    3. בקרת נוגדן יחיד CD45: הוסף רק נוגדן CD45.
    4. דוגמה: הוסף נוגדנים מסוג CD31 ו-CD45.
      הערה: ריכוז הנוגדנים הסופי בדגימה, כמו גם הצמדים הפלואורסצנטיים, צריכים להיות אופטימליים בהתבסס על הנוגדנים הספציפיים וממיין התאים שבהם נעשה שימוש.
  9. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה שולחנית של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 1,000 x גרם.
  10. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדורי התא ב-600 μL של חיץ מיון קר כקרח.
  11. מסננים את הדגימות דרך מכסי מסנן הרשת של צינורות FACS של 5 מ"ל ומאחסנים את התאים על קרח, מוגנים מפני אור, לקבלת FACS מיידי.
  12. השג תאי אנדותל קדמוניים (CD31+ CD45-), על ידי ביצוע השלבים הבאים.
    1. זהה את אוכלוסיית התאים והשער השליליים ל-CD45 (CD45-).
    2. בתוך (CD45-), זהה את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-CD31 (CD31+) ומיין תאים למאגר מיון תאים קרים כקרח של 6 מ"ל. השתמש בתאים אלה עבור יישומים במורד הזרם (ראה סעיף 5).

5. בדיקה לאישור פנוטיפ תאי אנדותל קדמוני

  1. מצפים שלוש בארות של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל / טוב DLL4 פתרון ציפוי במשך 30 דקות בחממה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 . כבקרה, לעג מעיל את שלוש הבארות האחרות של הצלחת עם 1 מ"ל / טוב PBS.
  2. שאפו את תמיסת הציפוי DLL4 ואת PBS, וצפו 25,000 תאי אנדותל ראשוניים ממוינים (ראו שלב 4.12) ב-2 מ"ל של מדיום צמיחת תאי אנדותל לכל באר.
  3. לדגור על התאים במשך 24 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  4. שאפו את המדיום מעל התאים ושטפו פעם אחת עם 2 מ"ל/ובכן PBS. נתחו את התאים על ידי qPCR או ציטומטריה של זרימה (עבור תאים המבטאים את מבנה ה-FUCCI).
    1. כדי לנתח את התאים על-ידי qPCR, בצע את השלבים הבאים.
      1. שאפו את הנוזל שמעל התאים ובודדו את הרנ"א בתאים באמצעות ערכת מיצוי RNA על פי פרוטוקול היצרן.
      2. בצע תגובות שעתוק לאחור עם תערובת מאסטר של תמלול הפוך בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      3. בצע תגובות qPCR עם תערובת מאסטר SYBR Green בהתאם לפרוטוקול היצרן.
        הערה: פריימרים בשימוש (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) מפורטים בטבלה 1.
    2. כדי לנתח תאים המבטאים את מבנה ה- FUCCI על ידי ציטומטריה של זרימה, בצע את השלבים הבאים.
      1. שאפו את הנוזל מעל התאים והוסיפו 500 μL/well 0.25% טריפסין-EDTA.
      2. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO2 עד הרמה, ~ 5 דקות.
      3. מעבירים את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה וכובלים את התאים במיקרוצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-1,000 x גרם.
      4. שאפו את ה-supernatant והחזירו את הכדור ב-500 μL של חיץ ניתוח ציטומטריה של זרימה קרה כקרח.
      5. מסננים את הדגימות דרך מכסה מסנן הרשת של צינור FACS של 5 מ"ל ומאחסנים את התאים על קרח, מוגנים מפני אור, לניתוח ציטומטריה של זרימה מיידית.
      6. נתחו את אחוז התאים המצופים ב-DLL4 לעומת בקרת PBS ב-G1 מוקדם (ללא צבע), G1 מאוחר (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) ו-S/G2/M (mCherry-/mVenus+).

6. התמיינות של hESCs לתאי אנדותל המוגניים

הערה: להבדיל את התאים ליום 4 ECs ראשוניים, כמתואר לעיל בסעיפים 3.1-3.6.

  1. יום 5: שאפו את המדיום מעל התאים ושטפו בעדינות את התאים עם 1 מ"ל של DMEM:F12 לכל באר. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי אנדותל המוגני טרי לכל באר ולדגור 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  2. יום 6: החלף את המדיום שמעל התאים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי אנדותל המוגני טרי לכל באר ודגירה 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  3. יום 7: החלף את המדיום שמעל התאים ב-1 מ"ל של מדיום התמיינות תאי אנדותל המוגני טרי לכל באר ודגור 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  4. יום 8: FACS מבודד תאי אנדותל המוגניים (ראה סעיף 7).

7. בידוד FACS של תאי אנדותל המוגניים

  1. להרים ולשטוף את התאים כמתואר לעיל בסעיפים 4.1-4.6.
  2. חלקו את התאים באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה על קרח, שכל אחד מהם מכיל מינימום של 600 תאי μL ב-1 x 105 תאים /מ"ל, לצביעת נוגדנים.
    הערה: שמונה צינורות של תאים נדרשים לצביעת נוגדנים של ECs המומוגניים: בקרה לא מוכתמת, בקרת נוגדנים בודדים CD31, בקרת נוגדנים בודדים CD45, בקרת נוגדנים בודדים KDR, בקרת נוגדנים בודדים c-Kit, בקרת נוגדנים בודדים CD34, בקרת נוגדנים בודדים של VE-cadherin, ודגימה המכילה את כל ששת הנוגדנים.
    הערה: מידע על נוגדנים מסופק בטבלת החומרים.
  3. מוסיפים נוגדנים לצינורות המכילים תאים, לפי הצורך, ודוגרים על קרח ומוגנים מפני אור למשך 30 דקות.
    1. בקרה לא מוכתמת: אין להוסיף נוגדנים.
    2. בקרת נוגדן יחיד CD31: יש להוסיף נוגדן CD31 בלבד.
    3. בקרת נוגדן יחיד CD45: הוסף רק נוגדן CD45.
    4. בקרת נוגדנים בודדים של KDR: יש להוסיף רק נוגדן KDR.
    5. בקרת נוגדנים בודדים c-Kit: יש להוסיף רק נוגדן c-Kit.
    6. בקרת נוגדן יחיד CD34: הוסף רק נוגדן CD34.
    7. בקרת נוגדן יחיד VE-cadherin: יש להוסיף רק נוגדן VE-cadherin.
    8. דוגמה: הוסף נוגדנים מסוג CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 ו-VE-cadherin.
      הערה: ריכוז הנוגדנים הסופי בדגימה, כמו גם הצמדים הפלואורסצנטיים, צריכים להיות אופטימליים בהתבסס על הנוגדנים הספציפיים וממיין התאים שבהם נעשה שימוש.
  4. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 1,000 x גרם.
  5. הסירו את הסופר-נאטנט והניחו מחדש את הכדורים ב-600 מיקרו-ליטר של חיץ מיון קר כקרח.
  6. מסננים את הדגימות דרך מכסה מסנן הרשת של צינורות FACS של 5 מ"ל ומאחסנים תאים על קרח, מוגנים מפני אור, לקבלת FACS מיידי.
  7. כדי להשיג תאי אנדותל המוגוגניים (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-cadherin- CD45-), בצע את השלבים הבאים.
    1. זהה את אוכלוסיית תאי CD45 ואת השער (CD45-).
    2. בתוך (CD45-), זהה את אוכלוסיית התאים והשער של CD31+ (CD31+).
    3. בתוך (CD31+), זהה את אוכלוסיית תאי ה-VE-קדהרין ואת השער (CDH5-).
    4. בתוך (CDH5-), זהה את אוכלוסיית התאים והשער c-Kit+ (KIT+).
    5. בתוך (KIT+), זהה את אוכלוסיית התאים והשער של CD34+ (CD34+).
    6. בתוך (CD34+), זהה ומיין את תאי KDR+ למאגר מיון תאים קרים כקרח של 6 מ"ל. השתמש בתאים אלה ביישומים במורד הזרם (ראה סעיף 8).

8. בחינת יחידה יוצרת מושבה

  1. להפשיר את האליקוטים של מדיום מבוסס מתילצלולוז בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: אליקוט אחד של 3 מ"ל מספיק לשתי דגימות ואליקוט אחד של 4 מ"ל מספיק לשלוש דגימות.
  2. ספרו את תאי האנדותל ההמוגני הממוינים המתקבלים בשלב 7.7.
  3. בהתאם להוראות היצרן, חשב את נפח התאים הממוינים כדי להוסיף לכל אליקוט בינוני מבוסס מתילצלולוז, כך שכל דגימה תכיל מינימום של 1,000 תאי אנדותל המוגניים.
    הערה: ניתן להתאים את מספר התאים לפי הצורך.
  4. הוסף את נפח התאים המחושב לליקוט הבינוני מבוסס מתילצלולוז ולמערבולת ביסודיות. אפשרו לתרביות הבינוניות המבוססות על מתילצלולוז לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, או עד שהבועות יתפוגגו.
  5. שאפו את תמיסת ציפוי הפיברונקטין מהכלים המוכנים של 35 מ"מ. בהתאם להוראות היצרן, יש להוציא 1 מ"ל של תרבית בינונית מבוססת מתילצלולוז לכל צלחת של 35 מ"מ. מסובבים בעדינות את המנה כדי לפזר את התרבות באופן שווה.
  6. הניחו את הכלים בקוטר 35 מ"מ, כמו גם שתי מנות נוספות בקוטר 35 מ"מ מלאות במים סטריליים, בתוך צלחת תרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ.
  7. לדגום את התרביות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 , ולהתבונן בתרבויות בימים 8 ו -14.
    1. ביום 8, ספרו את מושבות CFU-E ו-BFU-E.
    2. ביום ה-14, ספרו את מושבות CFU-GM ו-CFU-GEMM.
      הערה: עיין במדריך המדיום המבוסס על מתילצלולוז לזיהוי מורפולוגי של סוגי מושבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שרטוט סכמטי המתאר את המפרט של ECs קדמוניים ו- ECs המוגניים מ- hESCs, ותמונה מייצגת של תאים 24 שעות לאחר הציפוי מוצגים באיור 1. לאחר המפרט, ECs ראשוניים ו- ECs המוגניים מטוהרים FACS בימים 5 ו- 8, בהתאמה. ECs פרימורדיאליים מוגדרים כ- CD31+ CD45- ו- ECs המוגניים מוגדרים כ- CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. אסטרטגיית גידור ציטומטרית מייצגת עבור ECs ראשוניים וטיהור EC המוגני מוצגת באיור 2. התאים מגודרים בתחילה על סמך הביטוי השלילי של CD45 והביטוי החיובי של CD31 כדי לקבל ECs ראשוניים מטוהרים (איור 2A). כדי להשיג ECs המוגוגניים מטוהרים, התאים מגודרים בתחילה כמו באיור 2A, ולאחר מכן מטוהרים עוד יותר על סמך ביטוי חיובי או שלילי של (לפי הסדר) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 ו-KDR (איור 2B).

כדי להעריך את הפוטנציאל של תאי אנדותל ראשוניים CD31+ CD45- שמקורם ב-H9-Fucci-hES, שבודדו באמצעות FACS ביום 5 של ההתמיינות (פרוטוקול סעיף 4), כדי להוליד תת-סוגים של אנדותל, התאים המטוהרים נזרעים על צלחות המצופות ב-Notch ligand DLL4 כדי לגרום למפרט עורקי, או PBS (בקרה), ודוגרים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חממה 5% CO2. לאחר מכן התאים שוכבים עם מאגר RNA lysis, הרנ"א מופק, ומתועתק לאחור ל-cDNA, ו-qPCR מבוצע כדי להשוות את רמות ביטוי הגנים בתאי ה-DLL4 שטופלו לעומת תאי הביקורת. כצפוי, לתאי אנדותל הגדלים על DLL4 יש ביטוי מוגבר של הגן המגיב Notch HEY2, כמו גם של הגנים הקשורים לעורקים EFNB2, GJA5 ו- GJA4. בנוסף, לתאים האלה יש גם ביטוי מופחת של גורם השעתוק הוורידי NR2F2 (איור 3A). לחלופין, כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול ב-DLL4 על מצב מחזור התא, תאי CD31+ CD45 המטוהרים של FACS מודגרים על צלחות המצופות ב-DLL4 או ב-PBS במשך 24 שעות, מורמים ומנותחים על סמך הביטוי של hCdt1(30/120)-mCherry (מאוחר G1) ו-hGem(1/110)-mVenus (S/G2/M). בהתאם לממצאים שלפיהם איתות Notch מקדם מעצר מאוחר של מחזור תאי G127, אחוז גדול יותר של ECs ראשוניים נעצרים בסוף G1 לאחר גידול בנוכחות DLL4, בהשוואה לתאי בקרה (איור 3B,C).

כדי לאמת את הפוטנציאל ההמטופויאטי של תאי אנדותל המוגניים, תאי האנדותל CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- תאי אנדותל שבודדו באמצעות FACS (שיטות בסעיף 7) נזרעים בתווך מבוסס מתילצלולוז שפותח לצמיחה של תאי אב המטופויאטיים במבחני יחידה יוצרת מושבה (CFU) ומורשים לגדול במשך 14 יום. מושבות אריתרואידיות CFU-E ומושבות אריתרואידיות של יחידות יוצרות פיצוץ (BFU)-E נספרות ביום 8 (איור 4A,B), ו-CFU-GM גרנולוציטים/מקרופאגים ו-GFU-GEMM (גרנולוציטים, אריתרואידים, מקרופאגים ומגה-קריוציטים) מושבות אב המטופויאטיות רב-פוטנטיות נספרות ביום 14 (איור 4C ו-D). לכל 1,000 ECs המוגוגניים מצופה, נוצרים כ-20 CFU (איור 4F). ניתן לראות גם תאים עם מורפולוגיה של תאי אנדותל בתרביות (איור 4E); אלה הם תאי האנדותל ההמוגני המולידים אבות המטופויאטיים מרובי שושלות ברמת תא יחיד37.

Figure 1
איור 1: פרוטוקול למפרט של ECs קדמוניים והמוגניים . (A) דיאגרמה סכמטית של פרוטוקול ההבחנה. תאי גזע עובריים מצופים ביום -1 על לוחות מצופים חלבון מטריקס ומותר להם להתחבר למשך הלילה. לאחר מכן המטופלים בתאים בימים 0 ו-1 באמצעות מעכב GSK3i (CHIR99021) ו-bFGF, בהתאמה, כדי לגרום לרצף פרימיטיבי ולמפרט מזודרם, בהתאמה. החל מהיום השני, התאים מטופלים בשילוב של BMP4 ו- VEGF-A כדי לקדם התפתחות EC ראשונית. ECs ראשוניים (עיגול אדום) הם FACS מטוהרים ביום 5. לחלופין, כדי ליצור ECs המוגניים, המדיום שמעל ה- ECs הראשוניים מוחלף ביום 5 למדיום התמיינות המוגני טרי המכיל BMP4, VEGF-A ו- RA. מדיום זה מוחלף מדי יום עד יום 8, כאשר ECs המוגני (כוכב אדום) מטוהרים FACS. (B) מושבות ביום 0 של הבחנה, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לוח א' שונה מ-Qiu et al.37 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח FACS של ECs המונוגניים שמקורם ב-hESCs. אסטרטגיית גידור ציטומטרית מייצגת לטיהור (A) ECs ראשוניים ו- (B) ECs המוגניים. שים לב שמכיוון ש- ECs המוגניים נגזרים מ- ECs קדמוניים, אסטרטגיית גיטור הציטומטריה של זרימה עבור CD45 ו- CD31 זהה עבור שתי אוכלוסיות התאים. בשורה העליונה של כל פאנל (דגימה) מוצגים תאים שהתמיינו ל-ECs המונוגניים כמתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול והוכתמו בנוגדנים כמתואר בסעיף 7.3.8 בפרוטוקול. בשורה התחתונה של כל לוח (בקרה) מוצגים תאים לא מוכתמים שהתמיינו במשך 8 ימים ללא טיפול RA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: DLL4-אינדוקציה של H9-Fucci CD31+ CD45- תאי אנדותל ראשוניים גורמת למעצר מאוחר של G1 ולביטוי גנים עורקי מוגבר. (A) טיפול ב-DLL4 ב-CD31+ CD45- H9-hESC- תאי אנדותל ראשוניים שמקורם בתאי אנדותל ראשוניים המבטאים את מבנה פוצ'י המטוהרים ביום 5 של ההתמיינות מביאים לביטוי מוגבר של גנים עורקיים (i-iii) והגן המגיב Notch Hey2 (v), אשר מלווה בירידה מקבילה בביטוי הגן הוורידי NR2F2 (iv). (B) חלקות FACS מייצגות המציגות את התפלגות מצב מחזור התא של 5,000 CD31+ CD45 שמקורו ב-H9-Fucci שגודלו על PBS (בקרה) או DLL4 במשך 24 שעות. (C) אינדוקציה של DLL4 גורמת לעלייה של 15% בתאים בשלב G1 המאוחר בהשוואה לבקרה. הנתונים הם הממוצע של דגימות משולשות מאותו ניסוי המוצג בפאנל (B). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח הפוטנציאל ההמטופויטי של ECs המונוגניים שמקורם ב-hESCs. תמונות מייצגות המציגות מורפולוגיה של מושבת אב המטופויאטית נגזרת H1-hESC (A) מושבת אריתרואיד CFU-E (סרגל קשקשים = 35 מיקרומטר), (B) מושבת אריתרואיד BFU-E (סרגל קשקשים = 75 מיקרומטר), (C) מושבת גרנולוציטים/מקרופאגים CFU-GM, (D) מושבת אבות המטופויאטית רב-פוטנטית CFU-GEM, ו-(E) מושבת גרנולוציטים/מקרופאגים CFU-GM עם תאי אנדותל בסיסיים (ECs) (חיצים אדומים). (F) מספר והתפלגות של יחידות יוצרות CFU לכל 1,000 תאי אנדותל המוגני מצופה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר אינץ' (C-E). תמונות נוספות של יחידות יוצרות מושבה המובחנות באמצעות פרוטוקול זה ניתן למצוא ב- Qiu et al.37. לוח F שונה מ- Qiu et al.37 באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם קדימה הפוך
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGA GTCCGCATCCTCTCATAGTA
GJA5 CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
GJA4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
היי2 GCCCGCCCTTGTCAGTATC CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG
NR2F2 GGACCACATACGGATCTTCCAA ACATCAGACAGACCACAGGCAT

טבלה 1: מידע על פריימר qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

להלן מפורטים השלבים להפקת תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע עובריים אנושיים תוך כשבוע באמצעות מערכת תרבית דו-ממדית נטולת מורין וסרום (איור 1). פרוטוקול זה מרחיב על שיטה המתוארת על ידי Sriram et al. (2015) כדי להשיג ECsראשוני 38. האופי הראשוני ופוטנציאל המפרט של CD31+ CD45- ECs מודגם על-ידי התרבות התאים האלה על לוחות מצופים DLL4 והתבוננות בשינויים בביטוי גנים התואמים את מפרט העורקים (איור 3). בנוסף, העלייה בזהות העורקית קשורה לעצירה מאוחרת של מחזור תאי G1 (איור 3), מה שעולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים27. לאחר גידול ECs ראשוניים במשך 3 ימים נוספים בנוכחות 0.5 μM RA, 25 ng/mL BMP4 ו-50 ng/mL VEGF-A, ניתן היה ליצור ולבודד ECs המוגניים של FACS (איור 2) המסוגלים להוליד CFU-אריתרואיד, BFU-אריתרואיד, CFU-גרנולוציטים/מקרופאג'ים, ומושבות CFU-גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים ומגה-קריוציטים (איור 4) ). באמצעות שיטה זו במחקר שפורסם לאחרונה, נצפו שינויים בביטוי גנים במשך פרק זמן של 8 ימים התואמים את אובדן פלוריפוטנטיות, פס פרימיטיבי והשראת מזודרם, רכישת זהות תאי אנדותל, ולבסוף זהות המטופויטית37. יתר על כן, טיפול RA גרם למעצר מוקדם של מחזור תאי G1 כדי לאפשר מפרט ECהמוגני 37.

לאחרונה, Ohta et al. (2019) תיארו פרוטוקול להבחנה של ECs המוגני מ- hPSCs39. עם זאת, הפרוטוקול שתואר לעיל מציע יתרונות משמעותיים: 1) שיטה זו אינה דורשת היווצרות של ספרואידים; 2) פרוטוקול זה משתמש בחממה סטנדרטית של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ולא בחממה היפוקסית, ומבטל את הצורך בציוד ייעודי ייעודי; ו-3) פרוטוקול זה משתמש במדיום אחד בלבד (מדיום התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים בתוספת PFHM), יתרון לחיסכון בעלויות, בעוד שפרוטוקול Ohta דורש שני מדיומים לאינדוקציה. מחקר נוסף שפורסם לאחרונה על ידי Galat et al. (2017) תיאר פרוטוקול שבו אינדוקציה CHIR99021 נוצלה ליצירת אוכלוסייה של CD34+ תאי אנדותל המוגני40. תאים אלה ביטאו גם CD31 והיו מסוגלים להוליד תאי אנדותל כאשר תרבית בתנאים חד-שכבתיים או תאים המבטאים סמנים מיאלואידים ולימפואידים לאחר שיתוף פעולה עם תאי OP9 או OP9-DLL4, בהתאמה, בנוכחות ציטוקינים נוספים. הדרישה לתרבית משותפת נוספת עלולה להוביל לזיהום פוטנציאלי של אוכלוסיות התאים הרצויות בתאי מורין. בנוסף, למרות ש-Ohta et al. ו-Galat et al. השתמשו בתקופת אינדוקציה המוגנית שהייתה קצרה יותר מזו שתוארה כאן (4 ימים ו-5 ימים, בהתאמה לעומת 8 ימים), שניהם הגדירו ECs המוגניים כ-CD34+, בעוד שפרוטוקול זה השתמש בהגדרה מחמירה יותר: CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- . בעוד CD34 מוכר כסמן של תאים המטופויאטיים, הוא מתבטא גם על ידי סוגי תאים אחרים שאינם המטופויאטיים, כגון תאים סטרומליים מזנכימליים ותאי אנדותל41. ההגדרה של ECs המוגניים בפרוטוקול זה (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) היא לפיכך קפדנית יותר ומייצגת אוכלוסייה מוגדרת יותר.

מגבלה אחת לשימוש ב-hESCs או hiPSCs ביישומים טיפוליים היא המספר הגדול של התאים הנדרשים, ושיטות נגזרות דו-ממדיות סטנדרטיות מוגבלות בעיקר להתמיינויות בקנה מידה קטן. תוך שימוש בקווי hiPSC, Olmer et al. (2018) הדגימו את ההיתכנות של הגדלת הייצור של CD31+ ECs פונקציונליים שביטאו הן סמני תאים עורקיים (DLL4) והן ורידיים (EPHB4) תוך שימוש בתרבית תרחיף או בביוריאקטור של מיכל מעורבב6. חשוב מכך, הם הראו שהם הצליחו להשיג 1.18 x 107 CD31+ ECs המבטאים יחד CD34 ו- KDR מבקבוקון יחיד המכיל תרבית מתלה של 20 מ"ל. על מנת להשיג את הצורך 3 x 108 ECs הדרושים עבור רוב היישומים הטיפוליים, קצת יותר משני צלוחיות 500 מ"ל יידרשו6. ניסויים עתידיים צריכים לבחון את היישום של טכניקות קנה מידה לפרוטוקול המוצג כאן לייצור בקנה מידה גדול של ECs המוגניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענקי NIH HL128064 ו- U2EB017103. תמיכה נוספת ניתנה על ידי מענק CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 169 תאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים תאי אנדותל אנושיים תאי אנדותל המוגניים תאי אנדותל עורקיים פרוטוקול תרבית תאים התמיינות מכוונת
התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter