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Developmental Biology

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Abstract

Blutgefäße sind ubiquitär in allen Geweben des Körpers verteilt und erfüllen vielfältige Funktionen. Daher ist die Ableitung reifer vaskulärer Endothelzellen, die Blutgefäßlumen auskleiden, aus humanen pluripotenten Stammzellen entscheidend für eine Vielzahl von Tissue Engineering- und Regenerationsanwendungen. In vivo stammen primordiale Endothelzellen aus der mesodermalen Linie und sind für bestimmte Subtypen spezifiziert, einschließlich arterieller, venöser, kapillarer, hämogener und lymphatischer Typen. Hämogene Endothelzellen sind von besonderem Interesse, da sie während der Entwicklung hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen hervorbringen, die dann im Laufe des Lebens alle Blutlinien erzeugen. Daher würde die Schaffung eines Systems zur Erzeugung hämogener Endothelzellen in vitro die Möglichkeit bieten, den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen, und könnte zu einer Ex-vivo-Produktion menschlicher Blutprodukte und einer geringeren Abhängigkeit von menschlichen Spendern führen. Während mehrere Protokolle für die Ableitung von Vorläufer- und primordialen Endothelzellen existieren, wurde die Erzeugung gut charakterisierter hämogener Endothelzellen aus menschlichen Stammzellen nicht beschrieben. Hier wird eine Methode zur Gewinnung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt: ein Differenzierungsprotokoll mit primitiven Streakzellen, die als Reaktion auf GSK3β-Inhibitor (CHIR99021) gebildet wurden, dann Mesoderm-Linieninduktion vermittelt durch bFGF, gefolgt von primordialer Endothelzellentwicklung, die durch BMP4 und VEGF-A gefördert wird, und schließlich hämogene Endothelzellspezifikation, die durch Retinsäure induziert wird. Dieses Protokoll liefert eine gut definierte Population hämogener Endothelzellen, die verwendet werden können, um ihre molekulare Regulation und ihren endothelialen zu hämatopoetischen Übergang besser zu verstehen, was das Potenzial hat, auf nachgelagerte therapeutische Anwendungen angewendet zu werden.

Introduction

Endothelzellen (ECs) sind eine heterogene Population von Zellen, die im gesamten menschlichen Körper und in technisch hergestellten Geweben mehrere Funktionen erfüllen. Neben der Unterstützung und Regulierung anderer Zelltypen (z. B. Kardiomyozyten1, osteoblastische Zellen2) umfassen diese Funktionen die Bildung einer selektiven Barriere zwischen Blut und Geweben und die Unterstützung der Gewebebildung3. Die Differenzierung reifer ECs während der normalen Entwicklung erfordert vielfältige Signalwege. Primordiale ECs werden von Mesoderm-Vorläuferzellen abgeleitet und dann für reife arterielle, venöse, kapillare und lymphatische Phänotypen spezifiziert4. Darüber hinaus wird eine kleine Untergruppe von ECs im extraembryonalen Dottersack und in der embryonalen Aorta-Gonad-Mesonephros-Region (AGM) ebenfalls als hämogene ECs spezifiziert, aus denen hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) hervorgehen, die in die fetale Leber und das fetale Knochenmark wandern, wo sie postnatal verbleiben und alle Blutzelltypen während des gesamten Lebens erzeugen4. Die Vielfalt der EC-Phänotypen ist essentiell für die gesamte Gewebeentwicklung und -erhaltung.

Daher sind ECs und ihre Derivate kritische Komponenten von Studien zur Modellierung und Aufklärung von Mechanismen der menschlichen Entwicklung und/oder Krankheit sowie von Anwendungen der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering 5,6,7,8. Die Haupteinschränkung für diese Art von Studien ist jedoch die mangelnde Verfügbarkeit von primären Human-ECs in der erforderlichen Menge. Es wurde geschätzt, dass für die meisten therapeutischen Anwendungen mindestens 3 x 108 ECs erforderlich wären6. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) aufgrund ihres vielfältigen Abstammungspotenzials und ihrer Fähigkeit, eine große Anzahl von Nachkommen zu erzeugen, vorgeschlagen 6,9.

Tatsächlich wurde die Nützlichkeit von Zellen, die aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen gewonnen wurden, in mehreren Studien nachgewiesen, die sich auf Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening konzentrierten10,11,12. Die Organ-on-a-Chip (OOC) -Technologie wurde verwendet, um die Physiologie des menschlichen Körpers genauer zu rekapitulieren, indem Zellen und Gewebe in dreidimensionale Gerüste integriert wurden. Darüber hinaus kann die Verbindung mehrerer einzelner OOCs (ein sogenannter Body- oder Human-on-a-Chip, BOC/HOC) über Mikrofluidik erreicht werden, um ein Übersprechen zwischen den interessierenden Organen13,14,15 zu ermöglichen. Stützgewebe wie das Gefäßsystem sind kritische Bestandteile von OOCs und BOC/HOCs; Die Einbeziehung des Gefäßsystems ermöglicht den Transport von Nährstoffen, Sauerstoff und parakrinen Faktoren durch das Gewebe und fördert dadurch die erforderliche gewebespezifische Mikroumgebung 3,12. Daher sind Methoden zur Ableitung reifer humaner ECs, wie arterielle, venöse, lymphatische und hämogene ECs, entscheidend für die Weiterentwicklung dieser Tissue Engineering-Ansätze.

Es wurden mehrere Protokolle veröffentlicht, in denen die Schritte für die Ableitung humaner Ur- oder Vorläufer-ECs aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen detailliert beschrieben sind 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Viele dieser Protokolle beruhen auf der Bildung von Embryoiden Körpern (EB) oder der Kokultur von ESCs / iPSCs mit einer murinen Feederschicht von Stromazellen. Diese Strategien sind in der Regel schwierig und zeitaufwendig, mit geringen EC-Erträgen und/oder Kontamination menschlicher ECs mit Mauszellen. Protokolle, die strikt auf 2D-Kultur ohne die Verwendung von Stromazellen angewiesen sind, erfordern oft lange Induktionen, verwenden komplexe Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitoren für die Induktion, haben verlängerte Expansionszeiten nach der Zelltrennung oder eine Kombination dieser Faktoren. Die Weiterentwicklung des Wissens über Signalwege und Faktoren, die an der Ableitung reifer EC-Typen in vivo beteiligt sind, bildet die Grundlage für ein einfaches und robustes In-vitro-Differenzierungsprotokoll.

Zuvor wurden Schlüsselrollen für Notch- und Retinsäure (RA)-Signalwege bei der Spezifikation von murinen arteriellen bzw. hämogenen ECs während der Entwicklung identifiziert. Der Notch-Signalweg spielt mehrere Rollen bei der Spezifikation und Aufrechterhaltung des arteriellen EC-Phänotyps. Die Arbeit mit dem murinen retinalen Vaskularisationsmodell identifizierte einen Weg, in dem Flüssigkeitsscherspannung eine Notch-Cx37-p27-Signalachse induziert, die den G1-Zellzyklusstillstand fördert, was die arterielle EC-Spezifikation27 ermöglicht. Es wurde angenommen, dass Zellzykluszustände eine Rolle bei Zellschicksalsentscheidungen spielen, indem sie unterschiedliche Gelegenheitsfenster bieten, in denen Zellen für bestimmte Signale empfänglich sind, die Genexpression und phänotypische Veränderungen induzieren können28. Dieser Notch-vermittelte G1-Arrest ermöglichte die Expression von Genen, die in arteriellen ECs angereichert sind, einschließlich EphrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 und Notch 4 (überprüft in29,30). Es wurde auch gezeigt, dass die hämogene EC-Spezifikation in vivo über die RA-Signalisierung31,32 gefördert wird. Zusätzliche Studien zeigten, dass die Expression von c-Kit und Notch p27 stromabwärts der RA-Signalisierung hochreguliert, was eine hämogene Spezifikation im Murindottersack und AGM33 ermöglicht. Murine hämogene ECs können minimal durch Expression sowohl endothelialer (d.h. CD31, KDR) als auch hämatopoetischer (d.h. c-Kit, CD34) Marker identifiziert werden4. Schließlich durchlaufen hämogene ECs einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang (EHT), um HSPCs zu bilden, die zu allen Blutzelltypen 4,34,35 führen können.

Neuere Arbeiten haben getestet, ob dieselbe Signalhierarchie die humane hämogene EC-Spezifikation fördern kann. Dazu wurde ein serum- und feederfreies 2D-Kulturprotokoll zur Ableitung hämogener ECs aus hES-Zellen entwickelt, und diese hämogenen ECs wurden auf Einzelzellebene als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- charakterisiert. Diese Studie nutzte auch den FUCCI-Reporter (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), der verschiedene Zellzykluszustände unter Verwendung von H9-hES-Zellen identifiziert, die das FUCCI-Reporterkonstrukt (H9-FUCCI-hESC) ausdrücken36. In Studien mit diesen Zellen wurde gezeigt, dass RA den frühen G1-Zellzyklus-Arrest in ECs fördert und der frühe G1-Zustand eine hämogene Spezifikation in vitroermöglicht 37. Hierin werden ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung dieser humanen hämogenen Endothelzellen und Assays zur Bestätigung ihrer Identität bereitgestellt. Diese einfache Methode bietet ein nützliches Mittel, um diese spezialisierte Untergruppe von ECs für zukünftige Studien der Mechanismen der Entwicklung menschlicher Blutzellen zu generieren.

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Protocol

1. Reagenzien und Reagenzienzubereitung

HINWEIS: Eine Liste der Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle.

  1. Erhalten Sie die humanen pluripotenten Stammzelllinien: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    HINWEIS: Die Erzeugung von hämogenen ECs kann in der H1-Zelllinie effizienter sein.
  2. Matrixproteinvorräte vorbereiten: Aliquot das Matrixprotein in vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen (auf Eis) geben, so dass jedes Röhrchen 1 mg Matrixprotein enthält. 1 mg Matrixprotein reicht aus, um alle Vertiefungen von zwei 6-Well-Platten (insgesamt 12 Wells) zu beschichten. Lagern Sie die Aliquots bis zum Gebrauch bei -20 °C.
    HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit Matrixprotein auf Eis oder bei 4 °C durch. Die gefrorene Durchstechflasche mit Matrixprotein über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen die Durchstechflasche schwenken, um sicherzustellen, dass der Inhalt gemischt wird. 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mindestens 1 h bei -20 °C vorkühlen und unmittelbar vor dem Aliquotieren auf Eis überführen.
  3. Matrixprotein-beschichtete Platten vorbereiten: Matrixprotein-Aliquots auf Eis bei 4 °C auftauen. 12,5 mL eiskaltes DMEM:F12 in ein vorgekühltes konisches Röhrchen auf Eis geben. Unter Verwendung vorgekühlter Pipettenspitzen ein Aliquot (1 mg) Matrixprotein in das konische Röhrchen übertragen und durch Pipettieren auf und ab gut mischen. Aliquot 1 ml des verdünnten Matrixproteins in jede Vertiefung vorgekühlter 6-Well-Platten (auf Eis) unter Verwendung einer vorgekühlten serologischen Pipette. Schwenken und schaukeln Sie die Platten, so dass der gesamte Brunnen gleichmäßig beschichtet ist. Inkubieren Sie die Platten für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur, damit sich das Matrixprotein verfestigen kann. Die Platten mit Parafilm umwickeln und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern. Verwenden Sie Matrixprotein-beschichtete Platten innerhalb von 2 Wochen nach der Zubereitung.
    HINWEIS: Verwenden Sie die mit Matrixprotein beschichteten 6-Well-Platten für den routinemäßigen Übergang von Zellen und die Differenzierung zu primordialen und hämogenen Endothelzellen. Führen Sie alle Schritte auf Eis aus. 6-Well-Platten, Pipettenspitzen, serologische Pipetten und konische Röhrchen vor Gebrauch mindestens 1 h bei -20 °C vorkühlen. Übertragen Sie diese Gegenstände auf Eis, wenn sie einsatzbereit sind.
  4. Bereiten Sie das Basendifferenzierungsmedium vor, indem Sie 5 ml PFHM zu 100 ml pluripotentem Stammzelldifferenzierungsmedium hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
  5. 0,1% BSA-PBS durch Auflösen von 0,1 g BSA in 100 mL PBS herstellen. Filter sterilisieren BSA-PBS durch Passieren eines 0,22 μm Filters und lagern bei 4 °C.
  6. 5 mM HCl durch Verdünnen der Brühe HCl (12 M) 1:2,400 mit Wasser herstellen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 3,0 ein. Filter sterilisieren die Lösung durch einen 0,22 μm Filter und lagern bei 4 °C.
  7. Bereiten Sie bFGF-, BMP4-, VEGF-A-, Retinsäure (RA) und DLL4-Aktien vor.
    1. bFGF: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie bFGF-Bestände innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    2. BMP4: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver auf 1 mg / ml in 5 mM HCl, pH 3,0. Weiter auf 50 μg/ml in 0,1% BSA-PBS verdünnen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die BMP4-Bestände innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    3. VEGF-A: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 1 mg/ml indH2O. Weiter auf 100 μg/ml in 0,1% BSA-PBS verdünnen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die VEGF-A-Brühen innerhalb von 3 Monaten nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
    4. RA: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver auf 100 mM in DMSO. Aliquot und bei -80 °C lagern. Verwenden Sie die RA-Bestände innerhalb von 1 Monat nach der Zubereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
      HINWEIS: RA-Aktien vor Licht schützen.
    5. DLL4: Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver zu 1 mg / ml in PBS. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die DLL4-Bestände innerhalb von 12 Monaten nach der Vorbereitung. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  8. Das Endothelzelldifferenzierungsmedium wird unmittelbar vor der Anwendung durch Verdünnen von VEGF-A und BMP4 in Basendifferenzierungsmedium (Schritt 1.4) so hergestellt, dass die Endkonzentrationen 25 ng/ml bzw. 50 ng/ml betragen.
  9. Bereiten Sie die Arbeits-RA unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie 100 mM Brühe 1:1.000 in DMSO auf 100 μM verdünnen.
    HINWEIS: Schützen Sie funktionierende RA vor Licht.
  10. Das hämogene Endothelzelldifferenzierungsmedium wird unmittelbar vor der Anwendung durch Verdünnen von VEGF-A, BMP4 und arbeitender RA im Basendifferenzierungsmedium (Schritt 1.4) so hergestellt, dass die Endkonzentrationen 25 ng/ml, 50 ng/ml bzw. 0,5 μM betragen.
  11. Bereiten Sie den Antikörperfärbepuffer vor, indem Sie HBSS mit 10% FBS herstellen und mit 1:500 verdünntem antimikrobiellen Reagenz ergänzen. Den Puffer steril filtern und sofort verwenden.
  12. Bereiten Sie den Zellsortierpuffer vor, indem Sie HBSS mit 1% FBS herstellen und mit 1:500 verdünntem antimikrobiellem Reagenz ergänzen. Den Puffer steril filtern und sofort verwenden.
  13. Bereiten Sie 1 mg / ml Fibronektinvorräte vor, indem Sie 5 ml steriles Wasser zu 5 mg lyophilisiertem Fibronektin hinzufügen. Aliquot und bei -20 °C lagern. Verwenden Sie die Fibronektinvorräte vor dem Verfallsdatum auf dem Etikett des lyophilisierten Produkts. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  14. Bereiten Sie die mit Fibronektin beschichteten 35-mm-Schalen vor. Die Fibronektinvorräte (1 mg/ml) werden in sterilem Wasser auf 4 μg/ml verdünnt. Fügen Sie 1 ml dieser Fibronektin-Beschichtungslösung zu jeder Schale hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min bis 1 h. Verwenden Sie das Geschirr unmittelbar nach dem Beschichten.
  15. Bereiten Sie 3 oder 4 ml Aliquots eines Mediums auf Methylcellulosebasis gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Lagern Sie die Aliquots bis zum Gebrauch bei -20 °C. Verwenden Sie die Aliquots des Mediums auf Methylcellulosebasis vor dem auf dem Etikett des Standardprodukts angegebenen Verfallsdatum. Die Aliquots unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
  16. Die DLL4-Beschichtungslösung wird hergestellt, indem rekombinanter humaner DLL4-Bestand auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml in PBS verdünnt wird.
  17. Bereiten Sie das Wachstumsmedium der Endothelzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und lagern Sie es.
  18. Bereiten Sie den Durchflusszytometrie-Analysepuffer vor, indem Sie PBS mit 0,1% BSA herstellen. Den Puffer steril filtrieren und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.

2. Zellkultur und Passaging von hES-Zellen

  1. Lassen Sie die mit Matrixprotein beschichteten Platten, das Wachstumsmedium der Stammzellen und DMEM:F12 auf Raumtemperatur erwärmen.
  2. Züchten Sie die hESC-Zelllinien in Stammzellwachstumsmedium (2 ml / Well) auf Matrixprotein-beschichteten 6-Well-Platten in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator .
  3. Überprüfen Sie die Zellen täglich und entfernen Sie die differenzierten Zellen nach Bedarf, indem Sie sie vorsichtig mit einer p200-Pipettenspitze von der Platte abkratzen.
    HINWEIS: Differenzierte Zellen erscheinen an der Peripherie von Kolonien. Beispiele für differenzierte Zellen in Kultur finden Sie im Produkthandbuch des Stammzellwachstumsmediums.
  4. Durchdringen Sie die Zellen, sobald sie 70% -80% Konfluenz erreicht haben. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um Zellen zu durchlaufen.
    HINWEIS: Die Zellen sollten geteilt werden, bevor eine Konfluenz von 70% -80% erreicht wird, wenn eine erhöhte Differenzierung auftritt.
    1. Entfernen Sie das Medium über den Zellen und waschen Sie es vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung.
    2. Fügen Sie 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung hinzu.
    3. 160 μL/ml Dispase pro Vertiefung zugeben und die Zellen bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator für 45 min inkubieren.
    4. Nach der Dispase-Inkubation fügen Sie zusätzlich 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung hinzu und pipetten Sie vorsichtig, um die Zellen anzuheben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Durchdringen Sie die Zellen als kleine Klumpen.
    5. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen mit 12 mL DMEM:F12 und lassen Sie die Zellen durch Schwerkraft absetzen (~5-10 min).
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 0,5 ml Stammzellwachstumsmedium pro Vertiefung der angehobenen Zellen, um kleine Zellklumpen zu erhalten.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Zellen in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Durchdringen Sie die Zellen als kleine Klumpen.
    7. Die Matrixproteinbeschichtungslösung wird aus den Vertiefungen der vorbereiteten Matrixprotein-beschichteten Platte abgesaugt und 1,5 ml des Stammzellwachstumsmediums pro Vertiefung hinzugefügt.
    8. Fügen Sie das gewünschte Volumen der resuspendierten Zellen (Schritt 2.4.6) in jede Vertiefung der vorbereiteten Matrixprotein-beschichteten Platte hinzu.
    9. Die Platte in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator inkubieren. Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden in ein frisches Stammzellwachstumsmedium.

3. Differenzierung von hES-Zellen zu primordialen Endothelzellen

  1. Tag -1: Kultur und Durchgang der Zellen wie oben in Abschnitt 2 beschrieben. Die Zellen (Schritt 2.4.6) werden in kleinen Klumpen (~50 μm) mit einer Dichte von etwa 2 Klumpen pro Quadratzentimeter38 ausgesät.
    HINWEIS: Bewerten Sie die Samendichte und verfeinern Sie sie bei Bedarf empirisch.
  2. Tag 0: 24 h nach der Aussaat der Zellen das Medium aus jeder Vertiefung absaugen und die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung waschen. 1 ml des Basendifferenzierungsmediums mit 5 μM GSK3i (CHIR99021, frisch zugegeben) in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
    HINWEIS: Fügen Sie für alle Waschschritte langsam die angegebenen Waschmedien auf die Platte hinzu, indem Sie gegen die Wand der Platte pipettieren. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, so dass die gesamte Oberfläche des Brunnens mit Waschmedien bedeckt ist. Neigen Sie die Platte leicht, so dass sich das Waschmedium auf der Sechs-Uhr-Position sammelt, und saugen Sie die Waschmedien vorsichtig ab.
  3. Tag 1: Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml des Basendifferenzierungsmediums mit 50 ng/mL bFGF (frisch zugegeben, 1:2.000 aus gefrorenem Material) in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
  4. Tag 2: Saugen Sie das Medium aus jeder Vertiefung ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml des Endothelzelldifferenzierungsmediums in jede Vertiefung geben und 24 h (37 °C, 5%CO2) inkubieren.
  5. Tag 3: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  6. Tag 4: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  7. Tag 5: FACS reinigen die Zellen, um den EC-Phänotyp zu beurteilen (Abschnitte 4-5) oder halten sie in Kultur und differenzieren Sie sich in Richtung hämogene Endothelzellen (Abschnitt 6).

4. FACS-Reinigung von primordialen Endothelzellen

  1. Das Medium über den Zellen absaugen und einmal vorsichtig mit 1 ml DMEM:F12 pro Vertiefung waschen.
  2. Fügen Sie 1 ml Zellablösungslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 12 min in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator oder bis die Zellen dissoziiert haben.
  3. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit 12 mL DMEM:F12 und Pellet durch Zentrifugieren für 5 min, 1.000 x g überführt.
  4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml DMEM:F12 zum Waschen.
  5. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min, 1.000 x g.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem Antikörper-Färbepuffer und zählen Sie die Zellen. Stellen Sie die Konzentration mit eiskaltem Antikörper-Färbepuffer auf 1 x 105 Zellen/ml ein.
  7. Teilen Sie die Zellen gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 μL-Zellen bei 1 x 105 Zellen/ml enthalten, um Antikörper zu färben.
    HINWEIS: Für die Färbung von primordialen ECs sind vier Zellröhrchen erforderlich: ungefärbte Kontrolle, CD31-Einzelantikörperkontrolle, CD45-Einzelantikörperkontrolle und Probe, die sowohl CD31- als auch CD45-Antikörper enthält. Informationen über Antikörper finden Sie in der Materialtabelle.
  8. Fügen Sie gegebenenfalls Antikörper in die Röhrchen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie auf Eis und geschützt vor Licht für 30 Minuten.
    1. Ungefärbte Kontrolle: Fügen Sie keine Antikörper hinzu.
    2. CD31-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD31-Antikörper hinzu.
    3. CD45-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD45-Antikörper hinzu.
    4. Beispiel: Fügen Sie sowohl CD31- als auch CD45-Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Die endgültige Antikörperkonzentration in der Probe sowie die fluoreszierenden Konjugate sollten basierend auf den spezifischen Antikörpern und dem verwendeten Zellsortierer optimiert werden.
  9. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren in einer 4 °C Tischmikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g.
  10. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 600 μL eiskaltem Sortierpuffer.
  11. Die Proben werden durch die Mesh-Filterkappen aus 5-ml-FACS-Röhrchen abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis lagern, um sofortiges FACS zu erhalten.
  12. Erhalten Sie primordiale Endothelzellen (CD31+ CD45-), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Identifizieren Sie die CD45-negative Zellpopulation und das Gate (CD45-).
    2. Identifizieren Sie innerhalb von (CD45-) die CD31-positive (CD31+) Zellpopulation und sortieren Sie die Zellen in 6 ml eiskalte Zellsortierpuffer. Verwenden Sie diese Zellen für nachgelagerte Anwendungen (siehe Abschnitt 5).

5. Assay zur Bestätigung des primordialen Endothelzellphänotyps

  1. Beschichten Sie drei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 1 ml/Well-DLL4-Beschichtungslösung für 30 min in einem 37 °C, 5% CO 2-Inkubator. Als Kontrolle die anderen drei Vertiefungen der Platte mit 1 ml / Well-PBS nachlackieren.
  2. Die DLL4-Beschichtungslösung und PBS werden abgesaugt und 25.000 sortierte primordiale Endothelzellen (siehe Schritt 4.12) in 2 ml Endothelzellwachstumsmedium pro Vertiefung eingraviert.
  3. Die Zellen 24 h lang in einem 37 °C, 5%CO2 Inkubator inkubieren.
  4. Das Medium über den Zellen absaugen und einmal mit 2 ml/Well-PBS waschen. Analysieren Sie die Zellen mittels qPCR oder Durchflusszytometrie (für Zellen, die das FUCCI-Konstrukt exprimieren).
    1. Um die Zellen mittels qPCR zu analysieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Saugen Sie die Flüssigkeit über den Zellen ab und isolieren Sie die RNA in den Zellen mit einem RNA-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      2. Führen Sie umgekehrte Transkriptionsreaktionen mit einem Reverse-Transkriptions-Mastermix gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
      3. Führen Sie qPCR-Reaktionen mit einem SYBR Green-Mastermix gemäß Herstellerprotokoll durch.
        HINWEIS: Die verwendeten Primer (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    2. Um Zellen, die das FUCCI-Konstrukt exprimieren, durch Durchflusszytometrie zu analysieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Die Flüssigkeit über den Zellen absaugen und 500 μL/well 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen.
      2. Die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, bis sie angehoben werden, ~5 min.
      3. Die Zellen werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Zellen in einer 4 °C Mikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g pelletiert.
      4. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL eiskaltem Durchflusszytometrie-Analysepuffer.
      5. Die Proben werden durch die Netzfilterkappe eines 5-ml-FACS-Röhrchens abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis aufbewahren, um eine sofortige Durchflusszytometrie-Analyse durchzuführen.
      6. Analysieren Sie den Prozentsatz der Zellen, die auf DLL4 im Vergleich zur PBS-Kontrolle im frühen G1 (keine Farbe), späten G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) und S/G2/M (mCherry-/mVenus+) plattiert sind.

6. Differenzierung von hES-Zellen zu hämogenen Endothelzellen

HINWEIS: Differenzieren Sie die Zellen zu Tag 4 primordialen ECs, wie oben in den Abschnitten 3.1-3.6 beschrieben.

  1. Tag 5: Saugen Sie das Medium über den Zellen ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM: F12 pro Vertiefung. 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung zugeben und 24 h (37 °C, 5% CO2) inkubieren.
  2. Tag 6: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  3. Tag 7: Ersetzen Sie das Medium über den Zellen durch 1 ml frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie 24 h (37 °C, 5%CO2).
  4. Tag 8: FACS isoliert hämogene Endothelzellen (siehe Abschnitt 7).

7. FACS-Isolierung hämogener Endothelzellen

  1. Die Zellen werden wie oben in den Abschnitten 4.1-4.6 beschrieben angehoben und gewaschen.
  2. Teilen Sie die Zellen gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 μL-Zellen bei 1 x 105 Zellen/ml enthalten, um Antikörper zu färben.
    HINWEIS: Für die Antikörperfärbung hämogener ECs sind acht Zellröhrchen erforderlich: ungefärbte Kontrolle, CD31-Einzelantikörperkontrolle, CD45-Einzelantikörperkontrolle, KDR-Einzelantikörperkontrolle, c-Kit-Einzelantikörperkontrolle, CD34-Einzelantikörperkontrolle, VE-Cadherin-Einzelantikörperkontrolle und Probe, die alle sechs Antikörper enthält.
    HINWEIS: Informationen zu Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle.
  3. Fügen Sie gegebenenfalls Antikörper in die Röhrchen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie auf Eis und geschützt vor Licht für 30 Minuten.
    1. Ungefärbte Kontrolle: Fügen Sie keine Antikörper hinzu.
    2. CD31-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD31-Antikörper hinzu.
    3. CD45-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD45-Antikörper hinzu.
    4. KDR-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur KDR-Antikörper hinzu.
    5. c-Kit Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur c-Kit Antikörper hinzu.
    6. CD34-Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur CD34-Antikörper hinzu.
    7. VE-Cadherin Einzelantikörperkontrolle: Fügen Sie nur VE-Cadherin-Antikörper hinzu.
    8. Beispiel: Fügen Sie CD31-, CD45-, KDR-, c-Kit-, CD34- und VE-Cadherin-Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Die endgültige Antikörperkonzentration in der Probe sowie die fluoreszierenden Konjugate sollten basierend auf den spezifischen Antikörpern und dem verwendeten Zellsortierer optimiert werden.
  4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren in einer 4 °C Mikrozentrifuge für 5 min bei 1.000 x g.
  5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 600 μL eiskaltem Sortierpuffer.
  6. Die Proben werden durch die Netzfilterkappe aus 5-ml-FACS-Röhrchen abseihen und die Zellen lichtgeschützt auf Eis lagern, um sofortiges FACS zu erhalten.
  7. Um hämogene Endothelzellen (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) zu erhalten, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Identifizieren Sie die CD45-Zellpopulation und das Gate (CD45-).
    2. Identifizieren Sie innerhalb (CD45-) die CD31+-Zellpopulation und das Gate (CD31+).
    3. Identifizieren Sie innerhalb von (CD31+) die VE-Cadherin-Zellpopulation und das Gate (CDH5-).
    4. Identifizieren Sie innerhalb (CDH5-) die c-Kit+-Zellpopulation und das Gate (KIT+).
    5. Identifizieren Sie innerhalb von (KIT+) die CD34+-Zellpopulation und das Gate (CD34+).
    6. Identifizieren und sortieren Sie innerhalb von (CD34+) die KDR+-Zellen in einen 6-ml-Eiskaltzellensortierpuffer. Verwenden Sie diese Zellen in nachgelagerten Anwendungen (siehe Abschnitt 8).

8. Colony Forming Unit Assay

  1. Die Aliquots des Mediums auf Methylcellulosebasis gemäß den Anweisungen des Herstellers auftauen.
    HINWEIS: Ein Aliquot von 3 ml ist für zwei Proben und ein Aliquot von 4 ml für drei Proben ausreichend.
  2. Zählen Sie die sortierten hämogen Endothelzellen, die in Schritt 7.7 erhalten wurden.
  3. Berechnen Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers das Volumen der sortierten Zellen, die zu jedem aliquoten Medium auf Methylcellulosebasis hinzugefügt werden sollen, so dass jede Probe mindestens 1.000 hämogene Endothelzellen enthält.
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen kann nach Bedarf angepasst werden.
  4. Fügen Sie das berechnete Volumen der Zellen dem aliquoten und Wirbel auf Methylcellulosebasis gründlich hinzu. Lassen Sie die Mediumkulturen auf Methylcellulosebasis 10 min bei Raumtemperatur ruhen oder bis sich die Blasen auflösen.
  5. Die Fibronektin-Beschichtungslösung aus den vorbereiteten 35-mm-Schalen absaugen. Entsprechend den Anweisungen des Herstellers 1 ml Mediumkultur auf Methylcellulosebasis pro 35-mm-Schale abgeben. Drehen Sie die Schale vorsichtig, um die Kultur gleichmäßig zu verteilen.
  6. Legen Sie diese 35-mm-Schalen sowie zwei weitere 35-mm-Schalen, die mit sterilem Wasser gefüllt sind, in eine 15-cm-Gewebekulturschale.
  7. Inkubieren Sie die Kulturen in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator und beobachten Sie die Kulturen an Tag 8 und 14.
    1. Zählen Sie an Tag 8 die Kolonien CFU-E und BFU-E.
    2. Zählen Sie an Tag 14 die Kolonien CFU-GM und CFU-GEMM.
      HINWEIS: Zur morphologischen Identifizierung von Kolonietypen finden Sie im Handbuch für Methylcellulose-basierte Medien.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Spezifikation von primordialen ECs und hämogenen ECs aus hES-Zellen sowie ein repräsentatives Bild der Zellen 24 h nach der Beschichtung. Nach der Spezifikation werden primordiale ECs und hämogene ECs an den Tagen 5 bzw. 8 FACS gereinigt. Primordiale ECs sind definiert als CD31+ CD45- und hämogene ECs sind definiert als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Eine repräsentative durchflusszytometrische Gating-Strategie für primordiale ECs und hämogene EC-Reinigung ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Zellen werden zunächst basierend auf der negativen Expression von CD45 und der positiven Expression von CD31 gesteuert, um gereinigte primordiale ECs zu erhalten (Abbildung 2A). Um gereinigte hämogene ECs zu erhalten, werden die Zellen zunächst wie in Abbildung 2A eingezäunt und dann basierend auf positiver oder negativer Expression von (in der Reihenfolge) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 und KDR weiter gereinigt (Abbildung 2B).

Um das Potenzial von H9-Fucci-hES-abgeleiteten primordialen CD31+ CD45-Endothelzellen, die am Tag 5 der Differenzierung mittels FACS isoliert wurden (Protokollabschnitt 4), zu bewerten, um endotheliale Subtypen hervorzubringen, werden die gereinigten Zellen auf Platten ausgesät, die entweder mit dem Notch-Liganden DLL4 beschichtet sind, um eine arterielle Spezifikation zu induzieren, oder PBS (Kontrolle) und für 24 h bei 37 °C inkubiert. 5%CO2-Inkubator. Die Zellen werden dann mit RNA-Lysepuffer lysiert, die RNA extrahiert und umgekehrt in cDNA transkribiert, und qPCR wird durchgeführt, um Genexpressionsniveaus in den DLL4-behandelten vs. Kontrollzellen zu vergleichen. Wie erwartet, haben Endothelzellen, die auf DLL4 gezüchtet wurden, eine erhöhte Expression des Notch-responsiven Gens HEY2 sowie der arteriell assoziierten Gene EFNB2, GJA5 und GJA4. Darüber hinaus haben diese Zellen auch eine verminderte Expression des venösen Transkriptionsfaktors NR2F2 (Abbildung 3A). Alternativ, um die Wirkung der DLL4-Behandlung auf den Zellzykluszustand zu bestimmen, werden die FACS-gereinigten CD31+ CD45-Zellen auf mit DLL4 oder PBS beschichteten Platten für 24 h inkubiert, angehoben und basierend auf der Expression von hCdt1(30/120)-mCherry (spätes G1) und hGem(1/110)-mVenus (S/G2/M) analysiert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen, dass die Notch-Signalisierung den späten G1-Zellzyklus-Arrest27 fördert, wird ein größerer Prozentsatz der primordialen ECs im späten G1 nach dem Wachstum in Gegenwart von DLL4 im Vergleich zu Kontrollzellen blockiert (Abbildung 3B, C).

Um das hämatopoetische Potenzial hämatopoetischer Endothelzellen zu überprüfen, werden die CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- Endothelzellen, die durch FACS isoliert wurden (Methoden in Abschnitt 7), in einem Methylcellulose-basierten Medium ausgesät, das für das Wachstum hämatopoetischer Vorläuferzellen in koloniebildenden Einheiten (CFU) Assays formuliert wurde, und sie dürfen 14 Tage lang wachsen. CFU-E erythroide Kolonien und blastbildende Einheit (BFU)-E erythroide Kolonien werden an Tag 8 gezählt (Abbildung 4A,B), und CFU-GM Granulozyten/Makrophagen und GFU-GEMM (Granulozyten, Erythroide, Makrophagen und Megakaryozyten) multipotente hämatopoetische Vorläuferkolonien werden am Tag 14 gezählt (Abbildung 4C und D). Pro 1.000 beschichtete hämogene ECs werden etwa 20 KBE erzeugt (Abbildung 4F). Zellen mit Endothelzellmorphologie sind auch in den Kulturen zu sehen (Abbildung 4E); Dies sind die hämogenen Endothelzellen, die auf Einzelzellebene hämatopoetische Vorläuferzellen mit mehreren Linien hervorbringen37.

Figure 1
Abbildung 1: Protokoll zur Spezifikation von primordialen und hämogenen ECs . (A) Schematische Darstellung des Differenzierungsprotokolls. Embryonale Stammzellen werden am Tag -1 auf mit Matrixprotein beschichteten Platten plattiert und über Nacht anhaften. Die Zellen werden dann an den Tagen 0 und 1 mit GSK3i-Inhibitor (CHIR99021) bzw. bFGF behandelt, um eine primitive Streifen- bzw. Mesoderm-Spezifikation zu induzieren. Ab Tag 2 werden die Zellen mit einer Kombination aus BMP4 und VEGF-A behandelt, um die primordiale EC-Entwicklung zu fördern. Primordiale ECs (roter Kreis) werden an Tag 5 FACS-gereinigt. Alternativ wird zur Erzeugung hämogener ECs das Medium über den primordialen ECs an Tag 5 gegen ein frisches hämogenes Differenzierungsmedium ausgetauscht, das BMP4, VEGF-A und RA enthält. Dieses Medium wird täglich bis Tag 8 ersetzt, wenn hämogene ECs (roter Stern) FACS gereinigt werden. (B) Kolonien am Tag 0 der Differenzierung, Maßstabsbalken = 100 μm. Panel A wurde von Qiu et al.37 mit Genehmigung von Elsevier modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: FACS-Analyse hämogener ECs aus hES-Zellen. Repräsentative durchflusszytometrische Gating-Strategie zur Reinigung von (A) primordialen ECs und (B) hämogenen ECs. Da hämogene ECs von primordialen ECs abgeleitet sind, ist die Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für CD45 und CD31 für beide Zellpopulationen identisch. In der oberen Zeile jedes Panels (Probe) sind Zellen dargestellt, die gemäß Abschnitt 6 des Protokolls zu hämogenen ECs differenziert und gemäß Abschnitt 7.3.8 mit Antikörpern gefärbt wurden. In der unteren Reihe jedes Panels (Kontrolle) sind ungefärbte Zellen dargestellt, die 8 Tage lang ohne RA-Behandlung differenziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: DLL4-Induktion von H9-Fucci CD31+ CD45- primordialen Endothelzellen führt zu einem späten G1-Arrest und einer erhöhten arteriellen Genexpression. (A) DLL4-Behandlung von CD31+ CD45- H9-hESC-abgeleiteten primordialen Endothelzellen, die das am Tag 5 der Differenzierung gereinigte Fucci-Konstrukt exprimieren, führt zu einer erhöhten Expression arterieller Gene (i-iii) und des Notch-responsiven Gens Hey2 (v), was mit einer gleichzeitigen Abnahme der Expression des venösen Gens NR2F2 (iv) einhergeht. (B) Repräsentative FACS-Diagramme, die die Zellzykluszustandsverteilung von 5.000 H9-Fucci-abgeleitetem CD31+ CD45- zeigen, die auf PBS (Kontrolle) oder DLL4 für 24 h gezüchtet wurden. (C) DLL4-Induktion führt zu einem 15%igen Anstieg der Zellen in der späten G1-Phase im Vergleich zur Kontrolle. Die Daten sind der Durchschnitt der dreifachen Proben aus demselben Experiment, das in Panel (B) gezeigt wird. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse des hämatopoetischen Potenzials hämatopoetischer ECs aus hES-Zellen. Repräsentative Bilder zeigen die Morphologie der H1-hESC abgeleiteten (A) CFU-E erythroiden Kolonie (Maßstabsbalken = 35 μm), (B) BFU-E erythroide Kolonie (Maßstabsbalken = 75 μm), (C) CFU-GM Granulozyten/Makrophagenkolonie, (D) CFU-GEMM multipotente hämatopoetische Vorläuferkolonie und (E) CFU-GM Granulozyten/Makrophagenkolonie mit darunter liegenden Endothelzellen (ECs) (rote Pfeile). (F) Anzahl und Verteilung der gebildeten KBE pro 1.000 plattierte hämogene Endothelzellen. Maßstabsbalken = 100 μm in (C-E). Weitere Bilder von CFUs, die mit diesem Protokoll differenziert wurden, finden sich in Qiu et al.37. Panel F wurde von Qiu et al.37 mit Genehmigung von Elsevier modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Name Vorwärts Rückwärts
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGTGA GTCCGCATCGCTCTCATAGTA
GJA5 CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
GJA4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
HEY2 GCCCGCCCTTGTCAGTATC CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG
NR2F2 GGACCACATACGGATCTTCCAA ACATCAGACAGACCACAGGCAT

Tabelle 1: Informationen zum qPCR-Primer

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Discussion

Hier werden die Schritte zur Herstellung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche unter Verwendung eines murinfütterungs- und serumfreien 2D-Kultursystems skizziert (Abbildung 1). Dieses Protokoll erweitert eine von Sriram et al. (2015) beschriebene Methode, um primordiale ECs38 zu erhalten. Die ursprüngliche Natur und das Spezifikationspotenzial der CD31+ CD45-ECs werden demonstriert, indem diese Zellen auf DLL4-beschichteten Platten kultiviert und Genexpressionsänderungen beobachtet werden, die mit der arteriellen Spezifikation übereinstimmen (Abbildung 3). Darüber hinaus ist der Gewinn der arteriellen Identität mit einem späten G1-Zellzyklus-Arrest verbunden (Abbildung 3), was mit früheren Studien übereinstimmt27. Nach der Kultivierung primordialer ECs für weitere 3 Tage in Gegenwart von 0,5 μM RA, 25 ng/ml BMP4 und 50 ng/mL VEGF-A war es möglich, hämogene ECs zu erzeugen und zu isolieren (Abbildung 2), die in der Lage sind, CFU-Erythroid, BFU-Erythroide, CFU-Granulozyten/Makrophagen und CFU-Granulozyten-, Erythrozyten-, Makrophagen- und Megakaryozytenkolonien hervorzubringen (Abbildung 4 ). Unter Verwendung dieser Methode in einer kürzlich veröffentlichten Studie wurden Genexpressionsänderungen über einen Zeitraum von 8 Tagen beobachtet, die mit dem Verlust der Pluripotenz, primitiven Streifen und Mesoderminduktion, dem Erwerb der Endothelzellidentität und schließlich der hämatopoetischen Identität übereinstimmen37. Darüber hinaus induzierte die RA-Behandlung einen frühen G1-Zellzyklus-Arrest, um die hämogene EC-Spezifikation37 zu ermöglichen.

Kürzlich beschrieben Ohta et al. (2019) ein Protokoll zur Differenzierung hämogener ECs aus hPSCs39. Das oben beschriebene Protokoll bietet jedoch erhebliche Vorteile: 1) Diese Methode erfordert keine Bildung von Sphäroide; 2) Dieses Protokoll verwendet einen Standard-Inkubator mit 37 °C und 5%CO2 anstelle eines hypoxischen Inkubators, wodurch die Notwendigkeit einer speziellen Spezialausrüstung entfällt. und 3) dieses Protokoll verwendet nur ein Medium (pluripotentes Stammzelldifferenzierungsmedium, ergänzt mit PFHM), ein Kostenvorteil, während das Ohta-Protokoll zwei Medien für die Induktion benötigt. Eine weitere kürzlich veröffentlichte Studie von Galat et al. (2017) beschrieb ein Protokoll, in dem die CHIR99021-Induktion verwendet wurde, um eine Population von CD34+ hämogenen Endothelzellen40 zu erzeugen. Diese Zellen exprimierten auch CD31 und waren in der Lage, Endothelzellen hervorzubringen, wenn sie unter Monoschichtbedingungen kultiviert wurden, oder Zellen, die myeloische und lymphatische Marker exprimierten, nachdem sie mit OP9- bzw. OP9-DLL4-Zellen in Gegenwart zusätzlicher Zytokine kokultiviert wurden. Die Notwendigkeit einer zusätzlichen Kokultur könnte zu einer möglichen Kontamination gewünschter Zellpopulationen mit Mauszellen führen. Obwohl Ohta et al. und Galat et al. eine hämogene Induktionsperiode verwendeten, die kürzer war als die hier beschriebene (4 Tage bzw. 5 Tage vs. 8 Tage), definierten beide hämogene ECs als CD34+, während dieses Protokoll eine strengere Definition verwendete: CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- . Während CD34 als Marker für hämatopoetische Zellen anerkannt ist, wird es auch von anderen nicht-hämatopoetischen Zelltypen wie mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen41 exprimiert. Die Definition von hämogenen ECs in diesem Protokoll (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) ist daher strenger und stellt eine definiertere Population dar.

Eine Einschränkung für den Einsatz von hES-Zellen oder hiPS-Zellen in therapeutischen Anwendungen ist die große Anzahl von Zellen, die benötigt werden, und Standard-2D-Ableitungsmethoden beschränken sich hauptsächlich auf kleinräumige Differenzierungen. Unter Verwendung von hiPSC-Linien demonstrierten Olmer et al. (2018) die Machbarkeit der Skalierung der Produktion von funktionellen CD31+ ECs, die sowohl arterielle (DLL4) als auch venöse (EPHB4) Zellmarker exprimierten, entweder unter Verwendung einer Suspensionskultur oder eines Rührtank-Bioreaktors6. Wichtig ist, dass sie zeigten, dass sie in der Lage waren, 1,18 x 107 CD31+ ECs zu erhalten, die CD34 und KDR aus einem einzigen Kolben mit 20 ml Suspensionskultur co-exprimieren. Um die für die meisten therapeutischen Anwendungen erforderlichen 3 x 108 ECs zu erhalten, wären etwas mehr als zwei 500-ml-Kolbenerforderlich 6. Zukünftige Experimente sollten die Anwendung von Skalierungstechniken auf das hier vorgestellte Protokoll für die großtechnische Produktion von hämogenen ECs untersuchen.

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Disclosures

Der Autor hat nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Zuschüsse HL128064 und U2EB017103 unterstützt. Weitere Unterstützung wurde durch CT Innovations 15-RMB-YALE-04 Grant bereitgestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

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References

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Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen
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Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

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