Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Rettet differensiering av hemogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Presentert her er en enkel protokoll for rettet differensiering av hemogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller på omtrent 1 uke.

Abstract

Blodkar er allestedsnærværende fordelt i alle vev i kroppen og utfører ulike funksjoner. Dermed er avledning av modne vaskulære endotelceller, som strekker blodkarets lumen, fra humane pluripotente stamceller, avgjørende for en rekke vevstekniske og regenereringsapplikasjoner. In vivo er primordiale endotelceller avledet fra mesodermal avstamning og er spesifisert mot spesifikke subtyper, inkludert arterielle, venøse, kapillære, hemogene og lymfatiske. Hemogene endotelceller er av spesiell interesse fordi de under utviklingen gir opphav til hematopoietiske stamceller og stamceller, som deretter genererer alle blodlinjer gjennom livet. Dermed vil det å skape et system for å generere hemogene endotelceller in vitro gi en mulighet til å studere endotel-til-hematopoietisk overgang, og kan føre til ex vivo-produksjon av humane blodprodukter og redusert avhengighet av humane givere. Mens det finnes flere protokoller for utledning av stamceller og urendotelceller, er det ikke beskrevet generering av godt karakteriserte hemogene endotelceller fra humane stamceller. Her presenteres en metode for utledning av hemogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uke: en differensieringsprotokoll med primitive strekceller dannet som respons på GSK3β-hemmer (CHIR99021), deretter mesoderm-avstamningsinduksjon mediert av bFGF, etterfulgt av primordial endotelcelleutvikling fremmet av BMP4 og VEGF-A, og til slutt hemogen endotelcellespesifikasjon indusert av retinsyre. Denne protokollen gir en veldefinert populasjon av hemogene endotelceller som kan brukes til å forstå deres molekylære regulering og endotel-til-hematopoietisk overgang, som har potensial til å bli brukt på nedstrøms terapeutiske applikasjoner.

Introduction

Endotelceller (ECs) er en heterogen populasjon av celler som utfører flere funksjoner i hele kroppen og i konstruert vev. I tillegg til å støtte og regulere andre celletyper (dvs. kardiomyocytter1, osteoblastiske celler2), inkluderer disse funksjonene å danne en selektiv barriere mellom blod og vev og bistå i vevsdannelse3. Differensiering av modne ECs under normal utvikling krever ulike signalveier. Primordial ECs er avledet fra mesoderm forfedre, og er deretter spesifisert mot modne arterielle, venøse, kapillære og lymfatiske fenotyper4. I tillegg er en liten delmengde av ECs i den ekstraembryoniske eggeplommesekken og embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) -regionen også spesifisert til å bli hemogene ECs, noe som gir opphav til hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCs) som migrerer til fosterets lever og fosterbenmarg, hvor de forblir postnatalt og genererer alle blodcelletyper gjennom livet4. Det mangfoldige utvalget av EC-fenotyper er avgjørende for all vevsutvikling og vedlikehold.

Dermed er ECs og deres derivater kritiske komponenter i studier rettet mot modellering og belysning av mekanismer for menneskelig utvikling og / eller sykdom, samt regenerativ medisin og vevstekniske applikasjoner 5,6,7,8. Hovedbegrensningen for denne typen studier er imidlertid mangelen på tilgjengelighet av primære humane ECs i mengden som kreves. Det er anslått at det vil være behov for minst 3 x 108 ECs for de fleste terapeutiske anvendelser6. For å løse dette problemet har bruk av humane embryonale stamceller (hESCs) og humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) blitt foreslått på grunn av deres mangfoldige avstamningspotensial og deres evne til å generere et stort antall avkom 6,9.

Faktisk har nytten av celler avledet fra hESCs eller hiPSCs blitt demonstrert i flere studier fokusert på sykdomsmodellering og narkotikascreening10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) -teknologi har blitt brukt til å rekapitulere menneskekroppens fysiologi mer trofast ved å integrere celler og vev i tredimensjonale stillaser. Videre kan tilkobling av flere individuelle OOC-er (en såkalt kropps- eller menneske-på-en-chip, BOC / HOC) oppnås via mikrofluidikk for å tillate krysstale mellom organene av interesse13,14,15. Støttende vev, som vaskulaturen, er kritiske komponenter i OOC og BOC / HOCs; Inkorporering av vaskulatur muliggjør transport av næringsstoffer, oksygen og parakrine faktorer gjennom vevet, og fremmer dermed det nødvendige vevsspesifikke mikromiljøet 3,12. Dermed er metoder for å utlede modne humane ECs, som arterielle, venøse, lymfatiske og hemogene ECs, avgjørende for å fremme disse vevstekniske tilnærmingene.

Flere protokoller er publisert som beskriver trinn for utledning av humane ur- eller stamcelle-ECer fra hESCs eller hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Mange av disse protokollene er avhengige av embryoid kroppsdannelse (EB) eller samkultur av ESC / iPSCs med et murine materlag av stromale celler. Disse strategiene har en tendens til å være vanskelige og tidkrevende, med lave EC-utbytter og / eller forurensning av humane ECs med murine celler. Protokoller som er avhengige av 2D-kultur uten bruk av stromale celler, krever ofte lange induksjoner, benytter komplekse kombinasjoner av vekstfaktorer og / eller hemmere for induksjon, har utvidede ekspansjonsperioder etter celleseparasjon, eller en kombinasjon av disse faktorene. Avansert kunnskap om signalveier og faktorer involvert i utledning av modne EC-typer in vivo gir grunnlaget for en enkel og robust in vitro differensieringsprotokoll.

Tidligere ble nøkkelroller for hakk og retinsyre (RA) signalveier i spesifikasjonen av henholdsvis murine arterielle og hemogene ECs under utvikling identifisert. Notch-signalveien spiller flere roller i spesifikasjonen og vedlikeholdet av arteriell EC-fenotype. Arbeid ved hjelp av murine retinal vaskulariseringsmodell identifiserte en vei der væskeskjærspenning induserer en Notch-Cx37-p27-signalakse, som fremmer G1-cellesyklusarrest, noe som muliggjør arteriell EC-spesifikasjon27. Cellesyklustilstander har blitt antatt å spille en rolle i celleskjebnebeslutninger ved å gi forskjellige mulighetsvinduer der celler er mottakelige for visse signaler som kan indusere genuttrykk og fenotypiske endringer28. Denne Notch-medierte G1-arrestasjonen muliggjorde uttrykket av gener beriket i arterielle ECer, inkludert ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 og Notch 4 (gjennomgått i29,30). Det har også vist seg at hemogen EC-spesifikasjon fremmes in vivo via RA-signalering31,32. Ytterligere studier identifiserte at, nedstrøms for RA-signalering, ekspresjon av c-Kit og Notch oppregulerer p27, noe som muliggjør hemogen spesifikasjon i murine eggeplommesekk og AGM33. Murine hemogene ECs kan minimalt identifiseres ved ekspresjon av både endotel (dvs. CD31, KDR) og hematopoietisk (dvs. c-Kit, CD34) markører4. Til slutt gjennomgår hemogene ECs en endotel-til-hematopoietisk overgang (EHT) for å danne HSPC, noe som kan gi opphav til alle blodcelletyper 4,34,35.

Nylig arbeid testet om det samme signalhierarkiet kan fremme menneskelig hemogen EC-spesifikasjon. For å gjøre dette ble det utviklet en serum- og materfri 2D-kulturprotokoll for å utlede hemogene ECs fra hESCs, og disse hemogene ECene ble karakterisert på enkeltcellenivå som CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. Denne studien benyttet seg også av Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) reporter, som identifiserer forskjellige cellesyklustilstander, ved hjelp av H9-hESCs som uttrykker FUCCI-reporterkonstruksjonen (H9-FUCCI-hESC) 36. I studier med disse cellene ble det vist at RA fremmer tidlig G1-cellesyklusarrest i ECs, og tidlig G1-tilstand muliggjør hemogen spesifikasjon in vitro37. Her er det gitt en detaljert protokoll for differensiering av disse humane hemogene endotelceller og analyser som bekrefter deres identitet. Denne enkle metoden gir et nyttig middel til å generere denne spesialiserte delmengden av ECs for fremtidige studier av mekanismer for menneskelig blodcelleutvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reagenser og reagenspreparat

MERK: En liste over reagenser er gitt i Materialfortegnelse.

  1. Få tak i de humane pluripotente stamcellelinjene: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    MERK: Genereringen av hemogene ECs kan være mer effektiv i H1-cellelinjen.
  2. Forbered matriksproteinlagre: Aliquot matriksproteinet i forkjølte 1,5 ml rør (på is) slik at hvert rør inneholder 1 mg matriksprotein. 1 mg matriksprotein er nok til å belegge alle brønner med to 6-brønnsplater (12 brønner totalt). Oppbevar aliquotene ved -20 °C til bruk.
    NOTAT: Utfør alle trinnene som involverer matriksprotein på is eller ved 4 ° C. Tine det frosne hetteglasset med matriksprotein på is ved 4 °C over natten. Når hetteglasset er tint, for å sikre at innholdet blandes. Forkjøl 1,5 ml mikrosentrifugerør i minst 1 time ved -20 °C og overfør til is umiddelbart før aliquoting.
  3. Klargjør matriksproteinbelagte plater: Tin matriksprotein aliquots på is ved 4 °C. Tilsett 12,5 ml iskald DMEM:F12 i et forkjølt konisk rør på is. Bruk forkjølte pipettespisser, overfør en aliquot (1 mg) matriksprotein til det koniske røret og bland godt ved pipettering opp og ned. Aliquot 1 ml av det fortynnede matriksproteinet til hver brønn med forkjølte 6-brønnsplater (på is) ved bruk av en forkjølt serologisk pipette. Virvle og rock platene slik at hele brønnen er belagt jevnt. Inkuber platene i minst 30 minutter ved romtemperatur for å la matriksproteinet stivne. Pakk platene inn med parafilm og oppbevar ved 4 °C til bruk. Bruk matriksproteinbelagte plater innen 2 uker etter tilberedning.
    MERK: Bruk matriksproteinbelagte 6-brønnsplater for rutinemessig passering av celler og differensiering til primordiale og hemogene endotelceller. Utfør alle trinnene på is. Forkjøl 6-brønns plater, pipettespisser, serologiske pipetter og koniske rør før bruk i minst 1 time ved -20 °C. Overfør disse gjenstandene til is når de er klare til bruk.
  4. Forbered basisdifferensieringsmediet ved å tilsette 5 ml PFHM til 100 ml pluripotent stamcelledifferensieringsmedium. Oppbevares ved 4 °C.
  5. Forbered 0,1% BSA-PBS ved å oppløse 0,1 g BSA i 100 ml PBS. Filter steriliserer BSA-PBS ved å passere gjennom et 0,22 μm filter og oppbevares ved 4 °C.
  6. Forbered 5 mM HCl ved å fortynne lager HCl (12 M) 1: 2,400 med vann. Juster pH til 3,0 ved hjelp av NaOH. Filtersteriliser oppløsningen ved å passere gjennom et 0,22 μm filter og oppbevares ved 4 °C.
  7. Forbered bFGF-, BMP4-, VEGF-A-, retinsyre- (RA) og DLL4-aksjer.
    1. bFGF: Rekonstituer det lyofiliserte pulveret til 100 μg/ml i 0,1 % BSA-PBS. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Bruk bFGF-aksjer innen 3 måneder etter tilberedning. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
    2. BMP4: Rekonstituer det frysetørkede pulveret til 1 mg/ml i 5 m² HCl, pH 3,0. Fortynn ytterligere til 50 μg/ml i 0,1 % BSA-PBS. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Bruk BMP4-stamløsningene innen 3 måneder etter tilberedning. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
    3. VEGF-A: Rekonstituer det frysetørkede pulveret til 1 mg/ml i dH2O. Fortynn ytterligere til 100 μg / ml i 0,1% BSA-PBS. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Bruk VEGF-A-aksjene innen 3 måneder etter tilberedning. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
    4. RA: Rekonstituer det lyofiliserte pulveret til 100 mM i DMSO. Aliquot og oppbevares ved -80 °C. Bruk RA-lagrene innen 1 måned etter tilberedning. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
      MERK: Beskytt RA-lagre mot lys.
    5. DLL4: Rekonstituer det lyofiliserte pulveret til 1 mg/ml i PBS. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Bruk DLL4-lagrene innen 12 måneder etter tilberedning. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
  8. Klargjør endotelcelledifferensieringsmediet umiddelbart før bruk ved å fortynne VEGF-A og BMP4 i basedifferensieringsmedium (trinn 1.4) slik at de endelige konsentrasjonene er henholdsvis 25 ng / ml og 50 ng / ml.
  9. Forbered arbeids-RA umiddelbart før bruk ved å fortynne 100 mM lager 1: 1000 i DMSO til 100 μM.
    MERK: Beskytt fungerende RA mot lys.
  10. Forbered det hemogene endotelcelledifferensieringsmediet umiddelbart før bruk ved å fortynne VEGF-A, BMP4 og arbeide RA i basedifferensieringsmedium (trinn 1.4) slik at de endelige konsentrasjonene er henholdsvis 25 ng / ml, 50 ng / ml og 0,5 μM.
  11. Forbered antistofffargingsbufferen ved å lage HBSS som inneholder 10% FBS og supplere med 1:500 fortynnet antimikrobielt reagens. Steril filtrer bufferen og bruk umiddelbart.
  12. Forbered cellesorteringsbufferen ved å lage HBSS som inneholder 1% FBS og supplere med 1:500 fortynnet antimikrobielt reagens. Steril filtrer bufferen og bruk umiddelbart.
  13. Forbered 1 mg / ml fibronektinlagre ved å tilsette 5 ml sterilt vann til 5 mg lyofilisert fibronektin. Aliquot og oppbevares ved -20 °C. Bruk fibronektinlagrene før utløpsdatoen på etiketten med lyofilisert produkt. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
  14. Forbered fibronektinbelagte 35 mm retter. Fortynn fibronektinlagrene (1 mg/ml) til 4 μg/ml i sterilt vann. Tilsett 1 ml av denne fibronektinbeleggløsningen til hver tallerken og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter til 1 time. Bruk oppvasken umiddelbart etter belegg.
  15. Forbered 3 eller 4 ml aliquots metylcellulosebasert medium etter produsentens instruksjoner. Oppbevar aliquotene ved -20 °C til bruk. Bruk metylcellulosebaserte medium aliquots før utløpsdatoen som er angitt på etiketten på lagerproduktet. Tine aliquots umiddelbart før bruk.
  16. Klargjør DLL4-beleggløsningen ved å fortynne rekombinant human DLL4-stammasse til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml i PBS.
  17. Forbered og oppbevar endotelcellevekstmediet i henhold til produsentens instruksjoner.
  18. Forbered bufferen for flowcytometrianalysen ved å lage PBS som inneholder 0,1 % BSA. Steril filtrering av bufferen og oppbevares ved 4 °C til bruk.

2. Cellekultur og passasjering av hESCs

  1. La matriksproteinbelagte plater, stamcellevekstmedium og DMEM: F12 varmes til romtemperatur.
  2. Dyrk hESC-cellelinjene i stamcellevekstmedium (2 ml / brønn) på matriksproteinbelagte 6-brønnsplater i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
  3. Kontroller cellene daglig og fjern de differensierte cellene etter behov ved å skrape dem forsiktig av platen ved hjelp av en p200 pipettespiss.
    MERK: Differensierte celler vil vises i periferien av kolonier. Se produkthåndboken for stamcellevekstmedium for eksempler på differensierte celler i kultur.
  4. Passasje cellene når de når 70% -80% sammenløp. Hvis du vil gå gjennom celler, utfører du følgende trinn.
    MERK: Celler bør deles før de når 70% -80% sammenløp hvis økt differensiering oppstår.
    1. Fjern mediet over cellene og vask forsiktig med 1 ml DMEM: F12 per brønn.
    2. Tilsett 1 ml DMEM: F12 per brønn.
    3. Tilsett 160 μL / ml Dispase per brønn og inkuber cellene ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 45 minutter.
    4. Etter Dispase inkubasjon, tilsett ytterligere 1 ml DMEM: F12 per brønn og forsiktig pipette for å løfte cellene.
      MERK: Unngå å dissosiere cellene i en enkeltcellet suspensjon. Passasje cellene som små klumper.
    5. Overfør cellene til et konisk rør som inneholder 12 ml DMEM: F12 og la cellene slå seg ned med tyngdekraften (~ 5-10 min).
    6. Fjern supernatanten og resuspender forsiktig pelleten i 0,5 ml stamcellevekstmedium per brønn av løftede celler for å oppnå små klumper av celler.
      MERK: Unngå å dissosiere cellene i en enkeltcellet suspensjon. Passasje cellene som små klumper.
    7. Aspirer matriksproteinbeleggløsningen fra brønnene til den fremstilte matriksproteinbelagte platen og tilsett 1,5 ml av stamcellevekstmediet per brønn.
    8. Tilsett ønsket volum resuspenderte celler (trinn 2.4.6) til hver brønn i den tilberedte matriksproteinbelagte platen.
    9. Inkuber platen i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator. Bytt medium hver 24. time til friskt stamcellevekstmedium.

3. Differensiering av hESCs til primordiale endotelceller

  1. Dag -1: Kultur og passasje av cellene som beskrevet ovenfor i avsnitt 2. Frø cellene (trinn 2.4.6) i små klumper (~ 50 μm) med en tetthet på ca. 2 klumper per kvadratcentimeter38.
    MERK: Evaluer frøtettheten og avgrens empirisk om nødvendig.
  2. Dag 0: 24 timer etter sådd av cellene, aspirer mediet fra hver brønn og vask cellene forsiktig med 1 ml DMEM: F12 per brønn. Tilsett 1 ml av basisdifferensieringsmediet inneholdende 5 μM GSK3i (CHIR99021, tilsatt ferskt) til hver brønn og inkubert i 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
    MERK: For alle vasketrinnene, legg sakte det angitte vaskemediet til platen ved å pipettere mot plateveggen. Virvle platen forsiktig slik at hele overflaten av brønnen er dekket av vaskemedier. Vipp platen litt slik at vaskemediet samler seg klokken seks, og aspirer vaskemediet forsiktig.
  3. Dag 1: Aspirer mediet fra hver brønn og vask cellene forsiktig med 1 ml DMEM: F12 per brønn. Tilsett 1 ml av basisdifferensieringsmediet som inneholder 50 ng/ml bFGF (tilsatt fersk, 1:2 000 fra frossen kraft) til hver brønn og inkubert 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  4. Dag 2: Aspirer mediet fra hver brønn og vask cellene forsiktig med 1 ml DMEM: F12 per brønn. Tilsett 1 ml av endotelcelledifferensieringsmediet til hver brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  5. Dag 3: Erstatt mediet over cellene med 1 ml nyopparbeidet endotelcelledifferensieringsmedium per brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  6. Dag 4: Erstatt mediet over cellene med 1 ml nypreparert endotelcelledifferensieringsmedium per brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  7. Dag 5: FACS renser cellene for å vurdere EF-fenotype (avsnitt 4-5) eller holde seg i kultur og differensiere mot hemogene endotelceller (avsnitt 6).

4. FACS-rensing av primordiale endotelceller

  1. Aspirer mediet over cellene og vask forsiktig en gang med 1 ml DMEM: F12 per brønn.
  2. Tilsett 1 ml celleløsning per brønn og inkuber cellene i 12 minutter i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, eller til cellene har dissosiert.
  3. Overfør de dissosierte cellene til et konisk rør som inneholder 12 ml DMEM: F12 og pellet ved sentrifugering i 5 minutter, 1000 x g.
  4. Fjern supernatanten og resuspend pelleten i 12 ml DMEM: F12 for å vaske.
  5. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 minutter, 1000 x g.
  6. Fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i iskald antistofffargingsbuffer og tell cellene. Juster konsentrasjonen ved hjelp av iskald antistofffargingsbuffer til 1 x 105 celler / ml.
  7. Del cellene jevnt i mikrosentrifugerør på is, som hver inneholder minimum 600 μL-celler ved 1 x 105 celler/ml, for antistofffarging.
    MERK: Fire rør av celler er nødvendig for farging av ur-ECs: ufarget kontroll, CD31 enkelt antistoffkontroll, CD45 enkelt antistoffkontroll, og prøve som inneholder både CD31 og CD45 antistoffer. Informasjon om antistoffer er gitt i materialtabell.
  8. Tilsett antistoffer mot rørene som inneholder celler, etter behov, og inkuber på is og beskyttet mot lys i 30 minutter.
    1. Ufarget kontroll: Ikke legg til antistoff.
    2. CD31 enkelt antistoffkontroll: Legg bare til CD31 antistoff.
    3. CD45 enkelt antistoffkontroll: Legg bare til CD45 antistoff.
    4. Eksempel: Legg til både CD31- og CD45-antistoffer.
      MERK: Den endelige antistoffkonsentrasjonen i prøven, samt de fluorescerende konjugatene, bør optimaliseres basert på de spesifikke antistoffene og cellesorteringen som brukes.
  9. Pellet cellene ved sentrifugering i en 4 °C mikrosentrifuge i 5 minutter ved 1000 x g.
  10. Fjern supernatanten og resuspender cellepellets i 600 μL iskald sorteringsbuffer.
  11. Sil prøvene gjennom maskefilterhettene på 5 ml FACS-rør og oppbevar cellene på is, beskyttet mot lys, for umiddelbar FACS.
  12. Få tak i opprinnelige endotelceller (CD31+ CD45-) ved å utføre følgende trinn.
    1. Identifiser CD45-negativ cellepopulasjon og gate (CD45-).
    2. Innenfor (CD45-), identifiser CD31-positiv (CD31+) cellepopulasjon og sorter celler i 6 ml iskald cellesorteringsbuffer. Bruk disse cellene til nedstrømsprogrammer (se avsnitt 5).

5. Analyse for å bekrefte primordial endotelcellefenotype

  1. Belegg tre brønner på en 6-brønns plate med 1 ml/brønn DLL4 beleggløsning i 30 minutter i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator. Som en kontroll, mock-coat de tre andre brønnene på platen med 1 ml / brønn PBS.
  2. Aspirer DLL4-beleggløsningen og PBS, og plate 25 000 sorterte primordiale endotelceller (se trinn 4.12) i 2 ml endotelcellevekstmedium per brønn.
  3. Inkuber cellene i 24 timer i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
  4. Aspirer mediet over cellene og vask en gang med 2 ml / brønn PBS. Analyser cellene ved qPCR eller flowcytometri (for celler som uttrykker FUCCI-konstruksjonen).
    1. Hvis du vil analysere cellene etter qPCR, utfører du følgende trinn.
      1. Aspirer væsken over cellene og isoler RNA i cellene ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll.
      2. Utfør revers transkripsjonsreaksjoner med en hovedmiks for reverstranskripsjon i henhold til produsentens protokoll.
      3. Utfør qPCR-reaksjoner med en SYBR Green masterblanding i henhold til produsentens protokoll.
        MERK: Primere som brukes (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) er oppført i tabell 1.
    2. For å analysere celler som uttrykker FUCCI-konstruksjonen ved flowcytometri, utfør følgende trinn.
      1. Aspirer væsken over cellene og tilsett 500 μL / brønn 0,25% trypsin-EDTA.
      2. Inkuber cellene ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator til de er løftet, ~5 min.
      3. Overfør cellene til et mikrosentrifugerør og pellets cellene i en 4 °C mikrosentrifuge i 5 minutter ved 1000 x g.
      4. Aspirer supernatanten og resuspendere pelleten i 500 μL iskald strømningscytometrianalysebuffer.
      5. Sil prøvene gjennom maskefilterhetten på et 5 ml FACS-rør og oppbevar cellene på is, beskyttet mot lys, for umiddelbar flowcytometrianalyse.
      6. Analyser prosentandelen av celler belagt på DLL4 vs. PBS-kontroll i tidlig G1 (ingen farge), sen G1 (mCherry + / mVenus-), G1 / S (mCherry + / mVenus +) og S / G2 / M (mCherry - / mVenus +).

6. Differensiering av hESCs til hemogene endotelceller

MERK: Differensier cellene til dag 4 ur-ECs, som beskrevet ovenfor i pkt. 3.1-3.6.

  1. Dag 5: Aspirer mediet over cellene og vask cellene forsiktig med 1 ml DMEM: F12 per brønn. Tilsett 1 ml nylaget hemogent endotelcelledifferensieringsmedium per brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  2. Dag 6: Erstatt mediet over cellene med 1 ml nylaget hemogent endotelcelledifferensieringsmedium per brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  3. Dag 7: Erstatt mediet over cellene med 1 ml nylaget hemogent endotelcelledifferensieringsmedium per brønn og inkuber 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
  4. Dag 8: FACS isolerer hemogene endotelceller (se avsnitt 7).

7. FACS-isolering av hemogene endotelceller

  1. Løft og vask cellene som beskrevet ovenfor i pkt. 4.1-4.6.
  2. Del cellene jevnt i mikrosentrifugerør på is, som hver inneholder minimum 600 μL-celler ved 1 x 105 celler/ml, for antistofffarging.
    MERK: Åtte rør av celler er nødvendig for antistofffarging av hemogene ECs: unstained kontroll, CD31 enkelt antistoff kontroll, CD45 enkelt antistoff kontroll, KDR enkelt antistoff kontroll, c-Kit enkelt antistoff kontroll, CD34 enkelt antistoff kontroll, VE-cadherin enkelt antistoff kontroll, og prøve som inneholder alle seks antistoffer.
    MERK: Antistoffinformasjon er gitt i Materialfortegnelse.
  3. Tilsett antistoffer mot rørene som inneholder celler, etter behov, og inkuber på is og beskyttet mot lys i 30 minutter.
    1. Ufarget kontroll: Ikke legg til antistoff.
    2. CD31 enkelt antistoffkontroll: Legg bare til CD31 antistoff.
    3. CD45 enkelt antistoffkontroll: Legg bare til CD45 antistoff.
    4. KDR enkelt antistoffkontroll: Legg bare KDR antistoff.
    5. c-Kit enkelt antistoff kontroll: Legg bare c-Kit antistoff.
    6. CD34 enkelt antistoffkontroll: Legg bare til CD34 antistoff.
    7. VE-cadherin enkelt antistoff kontroll: Legg bare VE-cadherin antistoff.
    8. Eksempel: Legg til CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 og VE-cadherin antistoffer.
      MERK: Den endelige antistoffkonsentrasjonen i prøven, samt de fluorescerende konjugatene, bør optimaliseres basert på de spesifikke antistoffene og cellesorteringen som brukes.
  4. Pellet cellene ved sentrifugering i en 4 °C mikrosentrifuge i 5 minutter ved 1000 x g.
  5. Fjern supernatanten og resuspend pellets i 600 μL iskald sorteringsbuffer.
  6. Sil prøvene gjennom maskefilterhetten på 5 ml FACS-rør og lagre celler på is, beskyttet mot lys, for umiddelbar FACS.
  7. Hvis du vil oppnå hemogene endotelceller (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-), utfører du følgende trinn.
    1. Identifiser CD45-cellepopulasjonen og -porten (CD45-).
    2. Innenfor (CD45-), identifiser CD31+-cellepopulasjonen og -porten (CD31+).
    3. Innenfor (CD31+), identifiser VE-Cadherin-cellepopulasjonen og porten (CDH5-).
    4. Innenfor (CDH5-), identifiser c-Kit + cellepopulasjonen og porten (KIT +).
    5. Innenfor (KIT+), identifiser CD34+-cellepopulasjonen og -porten (CD34+).
    6. Innenfor (CD34+), identifiser og sorter KDR+-cellene i 6 ml iskald cellesorteringsbuffer. Bruk disse cellene i nedstrømsprogrammer (se avsnitt 8).

8. Kolonidannende enhetsanalyse

  1. Tine aliquots av metylcellulosebasert medium etter produsentens instruksjoner.
    MERK: En 3 ml aliquot er tilstrekkelig for to prøver og en 4 ml aliquot er tilstrekkelig for tre prøver.
  2. Tell de sorterte hemogene endotelcellene oppnådd i trinn 7.7.
  3. Følg produsentens instruksjoner, beregne volumet av sorterte celler for å legge til hvert metylcellulosebasert medium aliquot slik at hver prøve vil inneholde minst 1000 hemogene endotelceller.
    MERK: Antall celler kan justeres etter behov.
  4. Tilsett det beregnede volumet av celler til det metylcellulosebaserte mediet aliquot og vortex grundig. La de metylcellulosebaserte mediumkulturene sitte ved romtemperatur i 10 minutter, eller til boblene forsvinner.
  5. Aspirer fibronektinbeleggløsningen fra de tilberedte 35 mm retter. Følg produsentens instruksjoner, dispenser 1 ml metylcellulosebasert mediumkultur per 35 mm tallerken. Roter parabolen forsiktig for å fordele kulturen jevnt.
  6. Plasser disse 35 mm fatene, samt ytterligere to 35 mm tallerkener fylt med sterilt vann, i en 15 cm vevskulturskål.
  7. Inkuber kulturene i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, og observer kulturene på dag 8 og 14.
    1. På dag 8, telle CFU-E og BFU-E koloniene.
    2. På dag 14 teller du CFU-GM- og CFU-GEMM-koloniene.
      MERK: Se den metylcellulosebaserte mediumhåndboken for morfologisk identifikasjon av kolonityper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et skjema som beskriver spesifikasjonen av ur-ECs og hemogene ECs fra hESCs, og et representativt bilde av celler 24 timer etter plating er vist i figur 1. Etter spesifikasjon blir ur-ECs og hemogene ECs FACS renset på henholdsvis dag 5 og 8. Primordial ECs er definert som CD31+ CD45- og hemogene ECs er definert som CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. En representativ flowcytometrisk gatingstrategi for ur-ECs og hemogen EC-rensing er vist i figur 2. Celler er i utgangspunktet inngjerdet basert på det negative uttrykket av CD45 og positivt uttrykk av CD31 for å oppnå rensede ur-ECs (figur 2A). For å oppnå rensede hemogene ECs, blir celler først inngjerdet som i figur 2A og blir deretter ytterligere renset basert på positivt eller negativt uttrykk av (i rekkefølge) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 og KDR (figur 2B).

For å vurdere potensialet til H9-Fucci-hES-avledede primordiale CD31+ CD45-endotelceller, isolert via FACS på dag 5 av differensiering (protokoll avsnitt 4), for å gi opphav til endotelundertyper, blir de rensede cellene sådd på plater belagt med enten Notch ligand DLL4 for å indusere arteriell spesifikasjon, eller PBS (kontroll), og inkuberes i 24 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellene lyseres deretter med RNA-lysebuffer, RNA ekstraheres og reverseres transkribert til cDNA, og qPCR utføres for å sammenligne genuttrykksnivåer i DLL4-behandlede vs. kontrollceller. Som forventet har endotelceller dyrket på DLL4 økt ekspresjon av det Notch-responsive genet HEY2, samt de arterielle assosierte genene EFNB2, GJA5 og GJA4. I tillegg har disse cellene også redusert ekspresjon av den venøse transkripsjonsfaktoren NR2F2 (figur 3A). Alternativt, for å bestemme effekten av DLL4-behandling på cellesyklustilstand, inkuberes FACS-rensede CD31+ CD45-celler på plater belagt med enten DLL4 eller PBS i 24 timer, løftes og analyseres basert på uttrykket av hCdt1(30/120)-mCherry (sen G1) og hGem(1/110)-mVenus (S/G2/M). I samsvar med funnene om at Notch-signalering fremmer sen G1-cellesyklusarrest27, blir en større prosentandel av primordial ECs arrestert i sen G1 etter vekst i nærvær av DLL4, sammenlignet med kontrollceller (figur 3B, C).

For å verifisere det hematopoietiske potensialet til hemogene endotelceller, blir CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- endotelceller isolert gjennom FACS (metoder i avsnitt 7) sådd i et metylcellulosebasert medium formulert for vekst av hematopoietiske stamceller i kolonidannende enhetsanalyser (CFU) og får vokse i 14 dager. CFU-E erytroidkolonier og blastdannende enhet (BFU)-E erytroidkolonier telles på dag 8 (figur 4A,B), og CFU-GM granulocytt/makrofag og GFU-GEMM (granulocytt, erytroid-, makrofag- og megakaryocytt) multipotente hematopoietiske stamcellekolonier telles på dag 14 (figur 4C og D). Per 1000 hemogene ECs belagt, genereres ca. 20 CFU (figur 4F). Celler med endotelcellemorfologi kan også ses i kulturene (figur 4E); Dette er de hemogene endotelcellene som gir opphav til hematopoietiske forfedre med flere linjer på et enkeltcellenivå37.

Figure 1
Figur 1: Protokoll for spesifikasjon av ur- og hemogene ECs . (A) Skjematisk diagram over differensieringsprotokollen. Embryonale stamceller er belagt på dag -1 på matriksproteinbelagte plater og får feste seg over natten. Cellene behandles deretter på dag 0 og 1 med GSK3i-hemmer (CHIR99021) og bFGF, henholdsvis for å indusere henholdsvis primitiv strek og mesodermspesifikasjon. Fra og med dag 2 behandles cellene med en kombinasjon av BMP4 og VEGF-A for å fremme urutvikling. Primordial ECs (rød sirkel) er FACS renset på dag 5. Alternativt, for å generere hemogene ECs, byttes mediet over de opprinnelige ECene på dag 5 til friskt hemogent differensieringsmedium som inneholder BMP4, VEGF-A og RA. Dette mediet erstattes daglig til dag 8, når hemogene ECs (rød stjerne) er FACS-renset. (B) Kolonier på dag 0 av differensiering, skala bar = 100 μm. Panel A er endret fra Qiu et al.37 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: FACS-analyse av hemogene ECs avledet fra hESCs. Representativ flowcytometrisk gatingstrategi for rensing av (A) ur-ECs og (B) hemogene ECs. Merk at siden hemogene ECs er avledet fra primordial ECs, er flowcytometri-gatingstrategien for CD45 og CD31 identisk for begge cellepopulasjoner. Vist i den øverste raden av hvert panel (prøve) er celler som ble differensiert til hemogene ECs som beskrevet i protokoll avsnitt 6 og farget med antistoffer som beskrevet i protokoll pkt. 7.3.8. Vist i den nederste raden av hvert panel (kontroll) er ufargede celler som ble differensiert i 8 dager uten RA-behandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: DLL4-induksjon av H9-Fucci CD31+ CD45- primordiale endotelceller resulterer i sen G1-arrestasjon og økt arteriell genuttrykk. (A) DLL4-behandling av CD31+ CD45- H9-hESC-avledede primordiale endotelceller som uttrykker Fucci-konstruksjonen renset på dag 5 av differensiering, resulterer i økt ekspresjon av arterielle gener (i-iii) og Notch-responsivt gen Hey2 (v), som er ledsaget av en samtidig reduksjon i uttrykket av det venøse genet NR2F2 (iv). (B) Representative FACS-plott som viser cellesyklustilstandsfordelingen på 5,000 H9-Fucci-avledet CD31+ CD45- dyrket på PBS (kontroll) eller DLL4 i 24 timer. (C) DLL4-induksjon resulterer i en 15% økning i celler i sen G1-fase sammenlignet med kontroll. Data er gjennomsnittet av tredoble prøver fra det samme eksperimentet vist i panel (B). Feilfelt angir standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyse av hematopoietisk potensial for hemogene ECs avledet fra hESCs. Representative bilder som viser morfologi av H1-hESC-avledet (A) CFU-E erytroidkoloni (skalabar = 35 μm), (B) BFU-E erytroidkoloni (skalabar = 75 μm), (C) CFU-GM granulocytt/makrofagkoloni, (D) CFU-GEMM multipotent hematopoietisk stamcellekoloni og (E) CFU-GM granulocytt/makrofagkoloni med underliggende endotelceller (ECs) (røde piler). (F) antall og fordeling av CFU dannet per 1000 belagte hemogene endotelceller. Skalalinje = 100 μm i (C-E). Ytterligere bilder av CFUer differensiert ved hjelp av denne protokollen finnes i Qiu et al.37. Panel F er modifisert fra Qiu et al.37 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Navn Fremover Omvendt
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGTGA GTCCGCATCGCTCATAGTA
GJA5 CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
GJA4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
HEI2 GCCCGCCCTTGTCAGTATC CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG
NR2F2 GGACCACATACGGATCTTCCAA ACATCAGACAGACCACAGGCAT

Tabell 1: informasjon om qPCR-primer

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her skisseres trinnene for å produsere hemogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uke ved bruk av et murine mater- og serumfritt 2D-dyrkningssystem (figur 1). Denne protokollen utdyper en metode beskrevet av Sriram og medarbeidere (2015) for å oppnå ur-ECs38. Den opprinnelige naturen og spesifikasjonspotensialet til CD31 + CD45-ECs demonstreres ved å dyrke disse cellene på DLL4-belagte plater og observere genuttrykksendringer i samsvar med arteriell spesifikasjon (figur 3). I tillegg er gevinsten av arteriell identitet assosiert med sen G1-cellesyklusarrest (figur 3), noe som er i samsvar med tidligere studier27. Etter dyrking av ur-ECs i ytterligere 3 dager i nærvær av 0,5 μM RA, 25 ng / ml BMP4 og 50 ng / ml VEGF-A, var det mulig å generere og FACS-isolere hemogene ECs (figur 2) som er i stand til å gi opphav til CFU-erytroid, BFU-erytroid, CFU-granulocytt / makrofag og CFU-granulocytt, erytrocytt, makrofag og megakaryocyttkolonier (figur 4 ). Ved bruk av denne metoden i en nylig publisert studie ble genuttrykk endret over en 8-dagers tidsperiode forenlig med tap av pluripotens, primitiv strek og mesoderminduksjon, oppkjøp av endotelcelleidentitet og til slutt hematopoietisk identitet ble observert37. Videre induserte RA-behandling tidlig G1-cellesyklusarrest for å muliggjøre hemogen EC-spesifikasjon37.

Nylig beskrev Ohta et al (2019) en protokoll for differensiering av hemogene ECs fra hPSCs39. Protokollen beskrevet ovenfor gir imidlertid betydelige fordeler: 1) denne metoden krever ikke dannelse av sfæroider; 2) denne protokollen benytter en standard 37 ° C, 5% CO2 inkubator i stedet for en hypoksisk inkubator, og eliminerer behovet for dedikert spesialutstyr; og 3) denne protokollen benytter bare ett medium (pluripotent stamcelledifferensieringsmedium supplert med PFHM), en kostnadsbesparende fordel, mens Ohta-protokollen krever to medier for induksjon. En annen nylig publisert studie av Galat et al (2017) beskrev en protokoll der CHIR99021-induksjon ble brukt til å generere en populasjon av CD34+ hemogene endotelceller40. Disse cellene uttrykte også CD31 og var i stand til å gi opphav til endotelceller når de ble dyrket under monolagsbetingelser eller celler som uttrykker myeloide og lymfoide markører etter samtidig dyrking med henholdsvis OP9- eller OP9-DLL4-celler i nærvær av ytterligere cytokiner. Behovet for ytterligere samkultur kan føre til potensiell kontaminering av ønskede cellepopulasjoner med murine celler. I tillegg, selv om Ohta og medarbeidere og Galat og medarbeidere benyttet en hemogen induksjonsperiode som var kortere enn den som er beskrevet her (henholdsvis 4 dager og 5 dager vs. 8 dager), definerte begge hemogene ECs som CD34+, mens denne protokollen benyttet en strengere definisjon: CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- . Mens CD34 er anerkjent som en markør for hematopoietiske celler, uttrykkes den også av andre ikke-hematopoietiske celletyper, som mesenkymale stromale celler og endotelceller41. Definisjonen av hemogene ECs i denne protokollen (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-) er derfor strengere og representerer en mer definert populasjon.

En begrensning for bruk av hESCs eller hiPSCs i terapeutiske applikasjoner er det store antallet celler som kreves, og standard 2D-derivasjonsmetoder er primært begrenset til småskala differensieringer. Ved hjelp av hiPSC-linjer demonstrerte Olmer et al (2018) muligheten for å skalere opp produksjonen av funksjonelle CD31+ ECs som uttrykte både arterielle (DLL4) og venøse (EPHB4) cellemarkører ved bruk av enten suspensjonskultur eller en omrørt tank bioreaktor6. Viktigere, de viste at de var i stand til å oppnå 1,18 x 107 CD31+ ECs som co-express CD34 og KDR fra en enkelt kolbe som inneholder 20 ml suspensjonskultur. For å oppnå de nødvendige 3 x 108 ECs som er nødvendige for de fleste terapeutiske anvendelser, vildet være nødvendig med litt over to 500 ml kolber 6. Fremtidige eksperimenter bør utforske anvendelsen av skaleringsteknikker til protokollen som presenteres her for storskala produksjon av hemogene ECs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-tilskuddene HL128064 og U2EB017103. Ytterligere støtte ble gitt av CT Innovations 15-RMB-YALE-04 tilskudd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

Tags

Developmental Biology pluripotente humane stamceller humane endotelceller hemogene endotelceller arterielle endotelceller cellekulturprotokoll rettet differensiering
Rettet differensiering av hemogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter