Zebrafisk model af neuroblastom metastase

Summary

Dette papir introducerer metoden til at udvikle, karakterisere og spore i realtid tumormetastasen i zebrafiskmodellen af neuroblastom, specifikt i den transgene zebrafisklinje med overekspression af MYCN og LMO1, som udvikler metastase spontant.

Abstract

Zebrafisk har vist sig som en vigtig dyremodel til at studere menneskelige sygdomme, især kræft. Sammen med de robuste transgene og genomredigeringsteknologier, der anvendes i zebrafiskmodellering, gør den lette vedligeholdelse, produktiviteten med højt udbytte og kraftfuld levende billeddannelse zebrafisken til et værdifuldt modelsystem til at studere metastase og cellulære og molekylære baser, der ligger til grund for denne proces in vivo. Den første zebrafisk neuroblastom (NB) model af metastase blev udviklet ved at overudtrykke to onkogener, MYCN og LMO1, under kontrol af dopamin-beta-hydroxylase (dβh) promotoren. Co-overudtrykt MYCN og LMO1 førte til reduceret latenstid og øget penetrans af neuroblastomagenese samt accelereret fjern metastase af tumorceller. Denne nye model gentager pålideligt mange nøgletræk ved human metastatisk NB, herunder inddragelse af klinisk relevante og metastase-associerede genetiske ændringer; naturlig og spontan udvikling af metastase in vivo; og bevarede steder af metastaser. Derfor har zebrafiskmodellen unikke fordele ved at dissekere den komplekse proces med tumormetastase in vivo.

Introduction

Zebrafisk har været meget udbredt og anvendt på flere forskningsområder, især inden for kræft. Denne model giver mange fordele – såsom dens robuste reproduktion, omkostningseffektive vedligeholdelse og alsidige visualisering af tumorvækst og metastase – som alle gør zebrafisk til et kraftfuldt værktøj til at studere og undersøge de cellulære og molekylære baser af tumorgenese og metastase. Nye teknikker til kortlægning af genomkortlægning i stor skala, transgenese, gener overekspression eller knockout, celletransplantation og kemiske skærme har enormt øget zebrafiskemodellens ^kraft1. I løbet af de sidste par år er mange zebrafisklinjer blevet udviklet til at studere tumorgenese og metastase af en række humane kræftformer, herunder, men ikke begrænset til, leukæmi, melanom, rhabdomyosarkom og hepatocellulært carcinom2,3,4,5. Derudover blev den første zebrafiskmodel af neuroblastom (NB) genereret ved at overudtrykke MYCN, et onkogen, i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontrol af dopamin-beta-hydroxylase (dβh) promotoren. Med denne model blev det yderligere påvist, at aktiveret ALK kan synergisere med MYCN for at fremskynde tumordebut og øge tumorpenetrans in ^vivo6.

NB er afledt af sympatodyrerne i de neurale kamceller og er en meget metastatisk kræft hos ^børn7. Det er ansvarligt for 10 % af de pædiatriske kræftrelaterede ^dødsfald8. Bredt metastaseret ved diagnosen kan NB klinisk præsenteres som tumorer, der primært stammer fra kæden af de sympatiske ganglier og binyremedulla af PSNS9,10. MYCN-forstærkning er almindeligvis forbundet med dårlige resultater hos ^{NB-patienter11,12}. Desuden er LMO1 blevet identificeret som et kritisk NB-modtagelighedsgen i ^{højrisikotilfælde13,14}. Undersøgelser viste, at den transgene coexpression af MYCN og LMO1 i PSNS i zebrafiskmodellen ikke kun fremmer tidligere debut af NB, men også inducerer udbredt metastase til væv og organer, der ligner steder, der almindeligvis ses hos patienter med højrisiko ^NB13. For nylig er en anden metastatisk fænotype af NB også blevet observeret i en nyere zebrafiskmodel af NB, hvor både MYCN og Lin28B, der koder for et RNA-bindende protein, overudtrykkes under kontrol af dβh-promotoren16.

Den stabile transgene tilgang i zebrafisk bruges ofte til at undersøge, om overekspression af et gen af interesse kan bidrage til den normale udvikling og sygdomspatogenese14,15. Denne teknik er blevet anvendt med succes til at demonstrere betydningen af flere gener og veje til NB tumorgenese6,16,17,18,19,20. Dette papir vil introducere, hvordan den transgene fiskelinje, der overudtrykker både MYCN og LMO1 i PSNS, blev oprettet, og hvordan det blev påvist, at samarbejdet mellem disse to onkogener fremskynder starten på NB-tumorgenese og metastase13. For det første blev den transgene linje, der overudtrykker EGFP-MYCN under kontrol af dβh-promotoren (betegnet MYCN-linjen), udviklet ved at injicere dβh-EGFP-MYCN-konstruktionen i encellestadiet af vildtype(WT) AB-embryoner, som tidligere beskrevet6,17. En separat transgen linje, der overudtrykker LMO1 i PSNS (betegnet LMO1-linjen), blev udviklet ved at sammensmelte to DNA-konstruktioner, dβh-LMO1 og dβh-mCherry, i WT-embryoner på encellestadiet13. Det er tidligere blevet påvist, at sammenfaldende dobbelte DNA-konstruktioner kan sammensmeltes i fiskegenomet; derfor er LMO1 og mCherry coudtrykt i PSNS-cellerne hos de transgene dyr. Når de injicerede F0-embryoner nåede seksuel modenhed, blev de derefter krydset med WT-fisk til identifikation af positive fisk med transgen (er) integration. Kort fortalt blev F1-afkomene først screenet ved fluorescerende mikroskopi for mCherry-ekspression i PSNS-cellerne. Kimlineintegrationen af LMO1 i mCherry-positive fisk blev yderligere bekræftet af genomisk PCR og sekventering. Efter en vellykket identifikation af hver transgen linje blev afkom af heterozygote MYCN– og LMO1-transgene fisk blandet ind i hinanden for at generere en sammensat fiskelinje, der udtrykte både MYCN og LMO1 (betegnet MYCN; LMO1-linje). Tumorbærende MYCN; LMO1-fisk blev overvåget ved fluorescerende mikroskopi hver anden uge for tegn på metastatiske tumorer i de regioner, der er fjernt fra det primære sted, interrenal kirtelregion (IRG, zebrafisk ækvivalent med human binyre)¹³. At bekræfte metastasen af tumorer i MYCN; LMO1 fisk, histologiske og immunhistokemiske analyser blev anvendt.

Protocol

Alle forskningsmetoder ved hjælp af zebrafisk og dyrepleje / vedligeholdelse blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer på Mayo Clinic. 1. Forberedelse og mikroinjektion af transgene konstruktioner til udvikling af LMO1 transgen zebrafiskelinje med overekspression i PSNS For at udvikle LMO1-pDONR221-indgangsklonen skal den kodende region af human LMO1 fra cDNA opnået fra human cellelinje ved hjælp af PCR. Lav en 25 μL…

Representative Results

For at afgøre, om LMO1 synergiserer med MYCN for at påvirke NB-patogenese, blev transgene konstruktioner, der driver ekspression af enten LMO1 (dβh: LMO1 og dβh: mCherry) eller MYCN (dβh: EGFP-MYCN) i PSNS-cellerne under kontrol af dβh-promotoren injiceret i zebrafiskembryoner13. Som illustreret i figur 1A blev heterozygote MYCN- og LMO1-fisk indavlet efter udviklingen af s…

Discussion

Zebrafisk har været almindeligt anvendt i forskning i de sidste par årtier, især inden for kræftforskning, af åbenlyse grunde, såsom dens lette vedligeholdelse, robuste reproduktion og klare fordele ved in vivo-billeddannelse1,28. Zebrafiskemodellen kan let manipuleres embryonalt på grund af deres ydre befrugtning og udvikling, som supplerer godt til pattedyrs modelorganismer, såsom rotter og mus, til store genetiske ^{undersøgel…}

Materials

3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit	Vector	SK-4100
Acetic Acid	Fisher Scientific / Acros Organic	64-19-7
Agarose GP2	Midwest Scientific	009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Pel-Freez	P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vector	SP-2001
BOND Intense R Detection	Leica Biosystems	DS9263
BOND primary antibody diluent	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	AR9352
BOND-MAX IHC instrument	Leica Biosystems Newcastle, Ltd.	N/A	fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone	BACPAC resources center (BRFC)	N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera	Olympus	AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium)	Richard-Allan Scientific	8312-4
Eosin	Leica	3801601	ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol	Carolina	86-1263
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix	Invitrogen, CA	11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated)	Dako	E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	HHS-32-1L
HRP Avidin D	Vector	A-2004
Hydrochloric Acid	Aqua Solutions	4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3%	Fisher Scientific	H324-500
I-SceI enzyme	New England Biolabs, MA	R0694L
Kanamycin sulfate	Teknova, Inc.	K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	34133
Lithium Carbonate	Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC	554-13-2
Microtome for sectioning	Leica Biosystems	RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
p3E-polyA	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax	Surgipath Paraplast	39603002	Parrafin to parafin
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites)	Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany	N/A	a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector	Thermo Fisher Scientific	12536-017
pDONRP4-P1R donor vector	Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah	N/A	a generous gift
Phenol red, 0.5%	Sigma Aldrich	P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X	BioRad	1610780
Picrosirrius red stain kit	Polysciences	24901-250
pME-mCherry	Addgene	26028	(DBH construct)
Proteinase K, recombinant, PCR Grade	Roche	21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
RDO Rapid Decalcifier	Apex Enginerring	RDO04
Sodium Azide (NaN3)	Sigma Aldrich	26628-22-8
Stereo fluorescence microscope	Leica	MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging	Nikon	SMZ-1500
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs, MA	M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor	Sakura	N/A	Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S	Western Chemical Incorporated	20513
Xylene	Thermo Fisher Scientific	X3P1GAL