Overvågning af ændringer i smeltetemperaturen af et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode til screening af fragmentbiblioteker af et par hundrede forbindelser. Vi præsenterer en TSA-protokol, der implementerer robotassisteret nanodifferenti differentialscanning af fluormetri (nano-DSF) til overvågning af iboende tryptofanlyscens og let rygspredning til fragmentscreening.
Termiske skiftanalyser (TSA’er) undersøger, hvordan smeltetemperaturen (Tm)for et målprotein ændrer sig som reaktion på ændringer i dets miljø (f.eks.buffersammensætning). Nytten af TSA, og specifikt af nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), er blevet etableret i årenes løb, både for at finde betingelser, der hjælper med at stabilisere et bestemt protein og for at se på ligand bindende ved at overvåge ændringer i den tilsyneladende Tm. Dette papir præsenterer en effektiv screening af Diamond-SGC-iNEXT Klar (DSi-Klar) fragment bibliotek (768 forbindelser) ved hjælp af nano-DSF, overvågning Tm til at identificere potentielle fragment bindende. Forudsætningerne for proteinkvalitet og -koncentration for at udføre nano-DSF-eksperimenter er kort skitseret efterfulgt af en trinvis protokol, der bruger en nano-liters robotdispenser, der almindeligvis anvendes i strukturelle biologilaboratorier til fremstilling af de nødvendige prøver i 96-brøndsplader. Protokollen beskriver, hvordan reagensblandingerne overføres til de kapillærer, der er nødvendige for nano-DSF-målinger. Derudover indeholder dette dokument protokoller til måling af termisk denaturering (overvågning af iboende tryptofanlyscens) og sammenlægning (overvågning af lys back-scattering) og de efterfølgende trin til dataoverførsel og analyse. Endelig diskuteres screeningsforsøg med tre forskellige proteinmål for at illustrere brugen af denne procedure i forbindelse med kampagner for opdagelse af bly. Det overordnede princip i den beskrevne metode kan let overføres til andre fragmentbiblioteker eller tilpasses andre instrumenter.
Drug discovery programmer ofte starte med screening kemiske forbindelser for deres evne til at interagere med og / eller ændre funktionen af narkotika mål, oftest proteiner. De såkaldte “hits”, der findes i sådanne skærme, danner grundlag for opdagelsen af nye kundeemner og udviklingskandidater og for de fleste af de nye lægemidler, der bliver licenseret i disse dage. Tilgængeligheden af metoder med høj kapacitet er derfor uundværlig for at screene et enormt antal tilgængelige mål med et stort antal forskellige forbindelser for hurtigt at identificere deres stramme binding eller deres evne til at modulere en bestemt funktion af målet. Efter hits er identificeret, de mest lovende hit-target kombinationer skubbes ind i en omfattende lægemiddeludvikling pipeline ved hjælp af andre, ofte dyre og tidskrævende teknologier, for at forstå “struktur-aktivitet relationer” (SAR).
Strukturelle biologi tilgange, såsom dem, der tilbydes af EU-finansierede adgangsprogrammer “Infrastruktur for NMR, EM, og røntgenstråler til translationel forskning” (iNEXT) og dens nuværende efterfølger iNEXT-Discovery, bruges ofte til at studere samspillet mellem mange forbindelser i ekstreme detaljer og samtidig forbedre affinitet og farmakologiske egenskaber af de første hits ved typisk flere runder af syntetisk kemi1. Blyforbindelser, der kommer ud af disse “fra hit to lead”-kampagner, bliver udviklingskandidater og indgår prækliniske undersøgelser. Den veludviklede molekylærscreeningsmetode kan groft kategoriseres i to tilgange, nemlig den ligandbaserede lead discovery (LBLD) og fragmentbaseret lead discovery (FBLD). I LBLD kampagner, protein receptorer screenes med enten et par tusinde håndplukkede ligands (baseret på strukturen af naturlige ligands eller strukturen af målet), eller med mange titusinder af forbindelser i stof-lignende ligand biblioteker, der dækker en stor del af kemiske rum.
Normalt, forbindelserne er testet for deres hæmmende aktivitet i en aktivitet assay, typisk overvågning af en enzymatisk funktion. I FBLD kampagner2,3,4,5, dog, nogle hundredvis af forbindelser, der er typisk mindre end narkotika (100-200 Dalton) er testet for deres evne til at binde målet direkte, uden brug af en aktivitet assay. Denne binding kan forstyrre målaktiviteten og kan måles ved mange biofysiske metoder, der rapporterer direkte om fragmenters evne til at binde sig til målet eller ved strukturelle metoder som røntgenkrystallografi6 og nuklear magnetiskresonansspektroskopi 7og for nylig også kryoelektronmikroskopi. Når fragmenter binder på forskellige steder, der er tæt på hinanden på proteinet, kan de forskellige, normalt lav-affinitet bindende fragmenter rationelt kombineres kemisk for at skabe et lille sæt kundeemner, der kan studeres mere detaljeret. Dette resulterer ofte i højere affinitet, mere potente forbindelser, og denne metode er begyndt at give vigtige molekyler med klinisk potentiale. Valget af et “ideelt” fragmentbibliotek, der udnytter kemiske grupper effektivt, har været et aktivt forskningsområde i mange år8,9,10.
Mens der i første omgang blev lagt vægt på at dække fuldt kemisk rum, var der efterfølgende fokus på at gøre det muligt for den kemiske kombination af fragmenthits i nedstrøms at producere blyforbindelser. En sådan forskning har ført til de såkaldte “klar” biblioteker. Disse indeholder fragmenter med mindst én funktionel gruppe, der muliggør hurtig, billig opfølgende syntetisk kemi for effektiv fremskridt med at studere SAR. En af de aktiviteter, der blev katalyseret af iNEXT, var at opdatere det klarbibliotek, der blev udviklet af forskere i Diamond Light Source og Structural Genomics Consortium. Denne kombinerede indsats resulterede i DSi-Poised library11, som også er blevet valideret inden for iNEXT12. Senere blev dette bibliotek tilpasset tilgængeligheden af forbindelser i real database af Enamine Ltd., en kemisk forskningsorganisation og producent af store samlinger af byggesten og sammensatte biblioteker til screening. DSi-Poised er nu tilgængelig for alle til køb, men også tilgængelig i mange iNEXT-Discovery partnerlaboratorier til støttede fragmentscreeningsprojekter.
High-end X-ray krystallografi og NMR strukturelle biologi teknologier både har deres fordele og ulemper for FBLD. Begge kræver isolerede målprøver og giver de atomdetaljer med høj opløsning, der kræves til FBLD. Krystaller er imidlertid nødvendige for røntgenkrystallografi, og fragmenterne binder sig til hulrum i de velordnede proteinregioner, der ikke er involveret i opbygningen af det tredimensionelle krystalgitter. Løsning NMR giver ofte forskellige hits fra røntgenkrystallografi, da den ikke påvirkes af krystalmiljøet og er god til at opdage binding også i delvist bestilte proteinregioner. Men mens ligand-baserede NMR eksperimenter er relativt hurtige, de stadig kræver en betydelig mængde tid og materiale og kan rutinemæssigt kun gøres for relativt små protein mål eller domæner. Med henblik på at prioritere forbindelser til krystallografiske eller NMR-eksperimenter er der anvendt biofysiske tilgange13,14,15.
Da de seneste instrumenterings- og beregningsprotokoller tillader effektiv krystallografisk screening for FBLD ved at bestemme strukturer og analysere ~ 1.000 fragmenter meget effektivt, er denne prioritering blevet mindre afgørende i røntgenbaseret forskning. For NMR er det dog stadig ønskeligt at bruge billigere og hurtigere eksperimenter til at prioritere biblioteksscreening og spare instrumenttid på højeste udstyr. Samtidig kan brug af en kombination af væsentlige forskellige teknologier give uafhængig bekræftelse af bindende begivenheder eller endda yderligere hits, der ikke afhentes ved kun at anvende krystallografien eller NMR-metoden. Crystallographic og NMR teknikker begge kræver meget dyrt udstyr og kan ofte kun gøres i dedikerede eksterne faciliteter med hjælp fra lokale, højt kvalificerede eksperter. Derudover kræver en korrekt analyse af resultaterne også høj ekspertise. Mens programmer som iNEXT og iNEXT-Discovery er demokratisere adgangen til sådanne faciliteter16, er det blevet erkendt, at billige, hurtige, og high-throughput FBLD screening af andre metoder kan tilskynde drug-screening programmer i en langt bredere vifte af laboratorier. Sådanne resultater kan derefter bruges som en indikation til at opbygge samarbejder med medicinske kemikere, og at prioritere de dyreste screening eksperimenter til de mest lovende forbindelser, hvis NMR og krystallografi faciliteter pålægge restriktioner på antallet af forbindelser, der kan screenes.
TSA danner en hurtig, effektiv og relativt billig og tilgængelig biofysisk metode17, der kan bruges til FBLD-screening. Det er blevet brugt i flere indstillinger, fra medvirken til at finde stabile protein betingelser for krystallisering forsøg18, at finde forbindelser, der binder sig til specifikke mål i cellerne19. TSA’er er også blevet brugt til at måle dissociationskonstanter for ligands bindende målproteiner, da ligandbinding ofte fører til ændringer i termisk stabilitet. I alle TSA’er måles ændringen i denatureringstemperaturen for et protein (dets stabilitet) som en funktion af en langsom temperaturstigning. En effektiv måde at følge proteindenaturering ved opvarmning er ved DSF eller Thermofluor, som kvantificerer fluorescens quenching af et hydrofobisk farvestof (typisk Sypro Orange) ved interaktion med udsatte hydrofobiske proteinområder, der udfolder sig på grund af temperaturstigning.
Nano-DSF refererer typisk til måling af proteinets termiske stabilitet i mangel af eksterne farvestoffer. Et af de første instrumenter, der gav denne mulighed, var OPTIM1000, der måler et bredt spektrum af lysintensitet samt lysspredning af en prøve. Denne maskine gjorde det muligt samtidig at måle proteinudfoldning (typisk efter tryptofan fluorescens) og protein aggregering (som dannede nanopartikler resultere i en stigning i lysspredning ved ~ 400 nm). Senere introducerede Prometheus brugen af back-reflection til måling af aggregering og følsom påvisning af fluorescenssignalet, hvilket gjorde det muligt at screene lavproteinkoncentrationer med god følsomhed20. I det følgende afsnit beskrives, hvordan Prometheus blev brugt til at demonstrere en fragmentscreeningsprotokol til påvisning af hits for forskellige proteinmål. En kort introduktion om den forventede proteinkvalitet og kvantitet efterfølges af en trinvis protokol til forberedelse, udførelse og analyse af fragmentscreeningseksperimenterne. Screeningsresultater for tre proteiner er blevet vist som eksempeldata opnået som en del af iNEXT-Discovery-samarbejder.
Denne protokol beskriver en mellem-til-høj gennemløbsmetode til screening af fragmentbiblioteker ved hjælp af nogle almindelige robotteknologi- og måleinstrumenter. Skærme som dem, der er beskrevet i denne protokol, kan rutinemæssigt udføres af NKI Protein Facility i Amsterdam, for eksempel som en iNEXT-Discovery-tjeneste, ofte endda gratis for brugere efter forslagsansøgning og peer review. I sådanne tilfælde kan det DSi-Poised-bibliotek leveres af faciliteten, men brugen af andre biblioteker kan også diskuteres i forbindelse med hver enkelt brugeransøgning og serviceaftale. Valget af instrumenter i denne protokol repræsenterer praktiske løsninger for mange laboratorier, men bør ikke betragtes som en guldstandard. Etiketfrie metoder anbefales til måling af målproteinets termiske stabilitet til fragmentscreening i stedet for metoder, der anvender miljøfølsomme etiketter til at registrere sig i en termocykel af omvendt transskriptionskædereaktion.
Etiketfrie metoder, som den, der præsenteres her ved hjælp af Prometheus-instrumentet, har nogle fordele: de bruger lave mængder protein, ofte et par størrelsesordener mindre; de kan anvendes til samtidig at måle spredningen af prøven og dermed sammenlægningen og de etiketter, der bruges til at registrere udfoldning i andre tilgange, kan interagere forskelligt med hvert fragment, hvilket resulterer i måleartefakter. Denne protokol er blevet beskrevet i forbindelse med Mosquito-robotten, som gør det muligt at pipettere en meget lille mængde prøve (0,3 μL), som ikke kan udføres manuelt. Mosquito er en populær robot, der er til stede i mange laboratorier, der arbejder på strukturelle biologi- og lægemiddelopdagelsesprojekter; Protokollen kan dog klart bruge alternative tilgange til pipettering med lav volumen.
Fragmentbiblioteker indeholder forbindelser, der er opløst i DMSO. En af de første udfordringer er at finde den optimale DMSO-koncentration, hvor proteinet forbliver stabilt, og forbindelserne forbliver opløselige. Dette indebærer udførelse af målingerne ved forskellige DMSO-koncentrationer for at bestemme de optimale betingelser for screening. Proteinet til fragment fortynding, der anvendes her resulterer i DMSO koncentrationer på 0,2%; de fleste proteiner er ret stabile under disse forhold. Den mængde protein, der kræves til at udføre screeningen for 768-sammensatte bibliotek er ~ 2-3 mg i alt, da målingerne typisk udføres ved lave proteinkoncentrationer (0,2 mg mL-1). At arbejde med sådanne relativt lave proteinkoncentrationer reducerer ikke kun proteinproduktionsomkostningerne, men reducerer også chancerne for proteinudfældning. Den lave proteinkoncentration påvirker ikke påvisning af fragmentbinding, da koncentrationen af fragmenterne i eksperimentet er ~ 2 mM, hvilket gør det muligt også at identificere svage bindemidler.
Da den smeltende overgang detektion i disse eksperimenter er baseret på fluorescens intensitet, et kritisk aspekt er at bestemme excitation magt laseren til at udføre målingerne. Samspillet mellem forbindelserne og proteinet kan (i) ikke have nogen effekt på dets iboende fluorescens, ii) resultere i slukning eller (iii) øge dets iboende fluorescens. Derudover betyder arbejdet med lave proteinkoncentrationer, at fluorescenstallet for det oprindelige protein ville være lavt. Excitationseffekten skal derfor justeres på en sådan måde, at de fleste prøver kan måles. Spredningsprofilen for hvert løb indeholder vigtige oplysninger om de aggregeringseffekter, der kan udløses af tilføjelsen af et fragment. Derudover kan temperaturens effekt på sammensat opløselighed også ses på spredningsprofilen.
Uventet blev det for mange forbindelser observeret, at spredningen faktisk faldt med stigende temperatur (Figur 6). Det er derfor vigtigt at se på både den smeltende overgangskurve og den ledsagende spredningsprofil for at afgøre pålideligheden af hvert eksperiment, især for de fragmenter, der betragtes som kandidater til mere krævende målinger ved røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi eller endda betragtes som hits for opfølgende kemi. En specifik begrænsning af metoden til fragmentscreeningsformål er, at mange fragmenter i det DSi-poised bibliotek har betydelig iboende fluorescens, nogle gange endda ud over detektorens mætningsgrænse, og derfor kan disse ikke screenes korrekt for målbinding selv ved lav excitationskraft. Et andet punkt at bemærke for denne metode er, at det kun kan bruges med proteiner, der indeholder tryptofanrester.
Figur 6: Temperatureffekt på sammensat opløselighed. Smeltende overgangskurve og spredningsprofil af Hec1 med to forskellige forbindelser. (A) Spredningsprofilen viser at opløseligheden for denne prøve ikke påvirkes af temperaturen. (B) Spredningsprofilen viser, at opløseligheden af denne prøve øges med stigende temperatur. Den smeltende overgangskurve er derfor ikke pålidelig. Klik her for at se en større version af dette tal.
Et åbent spørgsmål er, hvad der bør betragtes som en væsentlig ændring i Tm, ikke ud fra et matematisk perspektiv, men fra et praktisk synspunkt: hvilken ændring i Tm er vigtig at overveje som tegn på binding af en ligand til et protein? I disse eksempler ses skift på mindre end 1 °C for 74 % af fragmenterne til binding af Hec1, 66 % for Mps1 og 53 % for Nsp5. I betragtning af, at 1 °C betragtes som “betydelig ændring”, vil det næppe give hits, der er værd at forfølge ved opfølgende kemi. I oversigtsgraferne (Figur 5) blev der taget hensyn til placeringer på 1, 2, 5 eller mere end 5 graders Tm skift, enten positive eller negative. Dette kræver ændringer i henhold til hver enkelt sag for at give et godt overblik og for at muliggøre informeret beslutningstagning, der bestemmer det næste skridt. Især for nogle proteiner blev både stabilisering og destabilisering af målet observeret afhængigt af de betragtede fragmenter. Begge begivenheder er interessante, da begge dele kan være resultatet af fragmentbinding, og begge kan føre til et godt opfølgningsmolekyle til at manipulere proteinadfærd.
Et sidste spørgsmål er stadig, nemlig ” hvad definerer et nyttigt hit?”. Faktisk afhænger svaret af den specifikke situation. For eksempel, for Hec1, alle fragmenter, der stabiliserer proteinet med mere end 2 grader eller destabilisere det med mere end 5 blev meddelt til vores kemi samarbejdspartnere, der designede nye molekyler baseret på disse hits. For Nsp5 blev de mest de-stabiliserende hits dog meddelt vores NMR-samarbejdspartnere for at bekræfte de nanoDSF-afledte hits med NMR-eksperimenter. Med andre ord bør de screeningsresultater, der er opnået fra denne protokol, analyseres med forsigtighed og på en kontekstafhængig måde og træffe informerede beslutninger baseret på det specifikke spørgsmål og den omgivende metode. Under alle omstændigheder er den metode, der er beskrevet her, en komplementær tilgang til eksisterende metoder som røntgen- og NMR-baseret screening, som kan sigte mod at bekræfte, prioritere eller give nye ideer til kemikampagner.
Supplerende tabel S1: Liste over buffere, der anvendes til screening af proteiner. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butanesulfonsyre. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel S2: Egenskaber til MRC 2-brønds plade til brug med nanodispenser robot. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel S3: Egenskaber til 96-brønd V-bundplade til brug med nanodispenser robot. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel S4: Bufferen, proteinkoncentrationen og Tm af de proteiner, der er diskuteret i repræsentative resultater. Forkortelser: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Stærkt udtrykt i kræft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Oversigt parametre–eksempeldata.
Supplerende fil 2: Tm og ΔTm værdier for 406 fragmenter-eksempel data. Klik her for at downloade denne fil.
The authors have nothing to disclose.
“Dette arbejde nød godt af adgang til NKI Protein Facility, et Instruct-ERIC center. Der er ydet finansiel støtte fra iNEXT, projektnummer 653706 og iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program”.
ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates |