एक लक्ष्य प्रोटीन(यानी,थर्मल शिफ्ट परख, टीएसए) के पिघलने के तापमान में परिवर्तन की निगरानी कुछ सौ यौगिकों के टुकड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक कुशल तरीका है । हम एक TSA प्रोटोकॉल प्रस्तुत रोबोटिक्स-सहायता प्राप्त नैनो-अंतर स्कैनिंग फ्लोरिमेट्री (नैनो-डीएसएफ) को लागू करने के लिए आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस और लाइट बैक-बिखरने की निगरानी के लिए टुकड़ा स्क्रीनिंग के लिए ।
थर्मल शिफ्ट परख (TSAs) की जांच कैसे एक लक्ष्य प्रोटीन के पिघलने तापमान (टीएम)अपने पर्यावरण में परिवर्तन के जवाब में बदलता है(उदाहरण केलिए, बफर संरचना) । टीएसए की उपयोगिता, और विशेष रूप से नैनो-डिफरेंशियल स्कैनिंग फ्लोरीमीटर (नैनो-डीएसएफ) की स्थापना वर्षों में की गई है, दोनों ऐसी स्थितियों को खोजने के लिए जो एक विशिष्ट प्रोटीन को स्थिर करने में मदद करती हैं और स्पष्ट टीएममें परिवर्तनों की निगरानी करके लिगांड बाध्यकारी को देखने के लिए । यह पेपर नैनो-डीएसएफ के उपयोग से डायमंड-एसजीसी-आईनेक्स्ट पोरियड (डीएसआई-पोरेटेड) खंड पुस्तकालय (768 यौगिकों) की एक कुशल स्क्रीनिंग प्रस्तुत करता है, संभावित टुकड़ा बाध्यकारी की पहचान करने के लिए टीएम की निगरानी करता है। नैनो-डीएसएफ प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए प्रोटीन की गुणवत्ता और एकाग्रता के बारे में आवश्यकताओं को संक्षेप में एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल द्वारा रेखांकित किया जाता है जो आमतौर पर 96-अच्छी प्लेटों में आवश्यक नमूनों को तैयार करने के लिए संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले नैनो-लीटर रोबोटिक डिस्पेंसर का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे अभिकर् चर मिश्रण नैनो-डीएसएफ मापन के लिए आवश्यक केशिकाओं को हस्तांतरित किए जाते हैं। इसके अलावा, यह पेपर थर्मल डेनैचेशन (आंतरिक ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस की निगरानी) और एकत्रीकरण (प्रकाश बैक-बिखरने की निगरानी) और डेटा हस्तांतरण और विश्लेषण के लिए बाद के चरणों को मापने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है। अंत में, लीड डिस्कवरी अभियानों के संदर्भ में इस प्रक्रिया के उपयोग को समझाने के लिए तीन विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों के साथ स्क्रीनिंग प्रयोगों पर चर्चा की जाती है । वर्णित विधि के समग्र सिद्धांत को आसानी से अन्य खंड पुस्तकालयों में स्थानांतरित किया जा सकता है या अन्य उपकरणों के अनुकूल किया जा सकता है।
दवा खोज कार्यक्रम अक्सर उनके साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए रासायनिक यौगिकों स्क्रीनिंग द्वारा शुरू और/ तथाकथित “हिट” है कि इस तरह की स्क्रीन में पाए जाते हैं, उपन्यास सुराग और विकास उंमीदवारों की खोज के लिए आधार रखना, और नई दवाओं है कि इन दिनों लाइसेंस प्राप्त किया जा रहा है की सबसे के लिए । इसलिए उच्च-थ्रूपुट विधियों की उपलब्धता विभिन्न यौगिकों की एक बड़ी संख्या के साथ उपलब्ध लक्ष्यों की एक विशाल संख्या को स्क्रीन करने के लिए अपरिहार्य है ताकि उनके तंग बाध्यकारी या लक्ष्य के एक विशिष्ट कार्य को मिलाना करने की उनकी क्षमता को जल्दी से पहचाना जा सके । हिट की पहचान के बाद, सबसे होनहार हिट-टारगेट संयोजनों को “संरचना-गतिविधि संबंधों” (एसएआर) को समझने के लिए अन्य, अक्सर महंगी और समय लेने वाली प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके एक व्यापक दवा विकास पाइपलाइन में धकेल दिया जाता है।
संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोण, जैसे यूरोपीय संघ द्वारा प्रदान किए जाने वाले एक्सेस प्रोग्राम “एनएमआर, ईएम, और ट्रांसएक्सएक्सटी के लिए एक्स-रे” (iNEXT) और इसके वर्तमान उत्तराधिकारी iNEXT-डिस्कवरी, अक्सर सिंथेटिक रसायन विज्ञान 1 के कई दौरों द्वारा शुरू की गई हिट के आत्मीयता और औषधीय गुणों में सुधार करतेहुएचरम विस्तार से कई यौगिकों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। लीड यौगिक जो इन “हिट से लीड तक” अभियानों से उभरते हैं, विकास उम्मीदवार बन जाते हैं और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रवेश करते हैं। अच्छी तरह से विकसित आणविक स्क्रीनिंग पद्धति को मोटे तौर पर दो दृष्टिकोणों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात् लिगांड-आधारित लीड डिस्कवरी (एलबीएलडी) और टुकड़ा-आधारित लीड डिस्कवरी (एफबीएलडी)। एलबीएलडी अभियानों में, प्रोटीन रिसेप्टर्स की जांच या तो कुछ हजार हाथ से चुनी गई लिगांड (प्राकृतिक लिगांड की संरचना या लक्ष्य की संरचना के आधार पर) के साथ की जाती है, या दवा की तरह लिगांड पुस्तकालयों में हजारों यौगिकों के साथ जो रासायनिक अंतरिक्ष के एक बड़े हिस्से को कवर करते हैं।
आमतौर पर, यौगिकों को एक गतिविधि परख में उनकी निरोधात्मक गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है, आमतौर पर एक एंजाइमेटिक फ़ंक्शन की निगरानी करता है। FBLD अभियानों में2,3,4,5,हालांकि, कुछ सैकड़ों यौगिक जो आमतौर पर दवाओं (100-200 डाल्टन) की तुलना में छोटे होते हैं, एक गतिविधि परख के उपयोग के बिना सीधे लक्ष्य को बांधने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किए जाते हैं। यह बाध्यकारी लक्ष्य गतिविधि में हस्तक्षेप कर सकता है और कई जैव भौतिक तरीकों से मापा जा सकता है जो सीधे लक्ष्य से बांधने के लिए टुकड़ों की क्षमता पर रिपोर्ट करते हैं, या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी6 और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी7जैसे संरचनात्मक तरीकों से, और हाल ही में, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी। जब टुकड़े प्रोटीन पर एक दूसरे के करीब हैं कि विभिन्न स्थानों पर बांध, अलग, आमतौर पर कम आत्मीयता बाध्यकारी टुकड़े तर्कसंगत रूप से रासायनिक रूप से जोड़ा जा सकता है सुराग का एक छोटा सा सेट है कि अधिक विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है बनाने के लिए । यह अक्सर उच्च आत्मीयता, अधिक शक्तिशाली यौगिकों में परिणाम है, और इस पद्धति नैदानिक क्षमता के साथ महत्वपूर्ण अणुओं उपज शुरू कर दिया है । रासायनिक समूहों का कुशलतापूर्वक शोषण करने वाली “आदर्श” खंड पुस्तकालय का चुनाव कई वर्षों से अनुसंधान का सक्रिय क्षेत्र रहा है8,9,10.
जबकि प्रारंभिक जोर पूर्ण रासायनिक अंतरिक्ष को कवर करने पर था, बाद में ध्यान टुकड़ा हिट के डाउनस्ट्रीम रासायनिक संयोजन को सक्षम करने के लिए नेतृत्व यौगिकों का उत्पादन करने पर ध्यान केंद्रित किया गया । इस तरह के शोध के कारण तथाकथित “तैयार” पुस्तकालय हैं । इनमें कम से कम एक कार्यात्मक समूह वाले टुकड़े होते हैं जो एसएआर का अध्ययन करने में कुशल प्रगति के लिए तेजी से, सस्ते अनुवर्ती सिंथेटिक रसायन शास्त्र की अनुमति देते हैं। iNEXT द्वारा उत्प्रेरित गतिविधियों में से एक डायमंड लाइट सोर्स और स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम में शोधकर्ताओं द्वारा विकसित तैयार पुस्तकालय को अद्यतन करना था। इस संयुक्त प्रयास के परिणामस्वरूप डीएसआई-तैयार पुस्तकालय11हुआ, जिसे iNEXT12के भीतर भी मान्य किया गया है। बाद में, इस पुस्तकालय को एनमाइन लिमिटेड के REAL डाटाबेस में यौगिकों की उपलब्धता के साथ गठबंधन किया गया था, जो एक रासायनिक अनुसंधान संगठन है और स्क्रीनिंग के लिए ब्लॉक और यौगिक पुस्तकालयों के निर्माण के बड़े संग्रह के निर्माता हैं। DSi-Poised अब खरीद के लिए किसी के लिए उपलब्ध है, लेकिन यह भी समर्थित टुकड़ा स्क्रीनिंग परियोजनाओं के लिए कई iNEXT-डिस्कवरी साथी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध है ।
उच्च अंत एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर संरचनात्मक जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों दोनों के अपने फायदे और FBLD के लिए नुकसान है । दोनों को अलग-थलग लक्ष्य नमूनों की आवश्यकता होती है और एफबीएलडी के लिए आवश्यक उच्च-संकल्प परमाणु विवरण प्राप्त करते हैं। हालांकि, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल आवश्यक हैं, और टुकड़े अच्छी तरह से आदेश दिए गए प्रोटीन क्षेत्रों में गुहाओं से बांधते हैं जो त्रि-आयामी क्रिस्टल जाली के निर्माण में शामिल नहीं हैं। समाधान एनएमआर अक्सर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से अलग-अलग हिट देता है, क्योंकि यह क्रिस्टल पर्यावरण से अप्रभावित होता है और आंशिक रूप से आदेशित प्रोटीन क्षेत्रों में भी बाध्यकारी का पता लगाने में अच्छा होता है। हालांकि, जबकि ligand आधारित एनएमआर प्रयोग अपेक्षाकृत तेज हैं, उन्हें अभी भी पर्याप्त समय और सामग्री की आवश्यकता होती है और नियमित रूप से केवल अपेक्षाकृत छोटे प्रोटीन लक्ष्यों या डोमेन के लिए किया जा सकता है। क्रिस्टलीय या एनएमआर प्रयोगों के यौगिकों को प्राथमिकता देने के उद्देश्य से जैव भौतिक दृष्टिकोणों का प्रयोग13,14,15किया गया है .
जैसा कि हाल के इंस्ट्रूमेंटेशन और कम्प्यूटेशनल प्रोटोकॉल संरचनाओं का निर्धारण करके और ~ 1,000 टुकड़ों का बहुत कुशलता से विश्लेषण करके एफबीएलडी के लिए कुशल क्रिस्टलीय स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं, एक्स-रे आधारित अनुसंधान में यह प्राथमिकता कम आवश्यक हो गई है। एनएमआर के लिए हालांकि, पुस्तकालय स्क्रीनिंग को प्राथमिकता देने और उच्चतम अंत उपकरणों पर साधन समय बचाने के लिए सस्ता और तेज प्रयोगों का उपयोग करना वांछनीय रहता है। साथ ही, अनिवार्य रूप से विभिन्न प्रौद्योगिकियों के संयोजन का उपयोग करके बाध्यकारी घटनाओं, या यहां तक कि अतिरिक्त हिट की स्वतंत्र पुष्टि प्रदान की जा सकती है जिन्हें केवल क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर विधि को नियोजित करके नहीं उठाया जाता है। क्रिस्टलीय और एनएमआर तकनीकों दोनों को बहुत महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है और अक्सर केवल स्थानीय, अत्यधिक कुशल विशेषज्ञों की मदद से समर्पित बाहरी सुविधाओं में किया जा सकता है। इसके अलावा, परिणामों का उचित विश्लेषण भी उच्च विशेषज्ञता की मांग करता है। जबकि iNEXT और iNEXT-डिस्कवरी जैसे कार्यक्रम ऐसी सुविधाओं16तक पहुंच का लोकतंत्रीकरण कर रहे हैं, यह माना गया है कि अन्य तरीकों से सस्ते, तेज और उच्च थ्रूपुट एफबीएलडी स्क्रीनिंग प्रयोगशालाओं की एक बहुत व्यापक श्रृंखला में दवा स्क्रीनिंग कार्यक्रमों को प्रोत्साहित कर सकते हैं। इस तरह के परिणामों को औषधीय दवा की दुकानों के साथ सहयोग बनाने के लिए एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और सबसे होनहार यौगिकों के लिए सबसे महंगी स्क्रीनिंग प्रयोगों को प्राथमिकता अगर एनएमआर और क्रिस्टलोग्राफी सुविधाओं यौगिकों की संख्या है कि जांच की जा सकती है पर प्रतिबंध लागू ।
टीएसए एक त्वरित, कुशल और अपेक्षाकृत सस्ते और सुलभ जैव भौतिक विधि17 बनाता है जिसका उपयोग एफबीएलडी स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है। इसका उपयोग कई सेटिंग्स में किया गया है, क्रिस्टलीकरण परीक्षणों के लिए स्थिर प्रोटीन की स्थिति खोजने के लिए सहायता करने से18,उन यौगिकों को खोजने के लिए जो कोशिकाओं में विशिष्ट लक्ष्यों से बांधते हैं19। TSAs भी ligands बाध्यकारी लक्ष्य प्रोटीन के लिए वियोजन स्थिरांक को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, के रूप में ligand बाध्यकारी अक्सर थर्मल स्थिरता में परिवर्तन की ओर जाता है । सभी TSAs में, एक प्रोटीन (इसकी स्थिरता) के विकृति तापमान में परिवर्तन एक धीमी गति से तापमान में वृद्धि के एक समारोह के रूप में मापा जाता है । हीटिंग पर प्रोटीन डेनैचेशन का पालन करने का एक कुशल तरीका डीएसएफ या थर्मोफ्लूर द्वारा है, जो तापमान वृद्धि के कारण आने वाले प्रोटीन के उजागर हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के साथ बातचीत पर हाइड्रोफोबिक डाई (आमतौर पर सिप्रो ऑरेंज) की फ्लोरेसेंस शमन की मात्रा है।
नैनो-डीएसएफ आमतौर पर बाहरी रंगों की अनुपस्थिति में प्रोटीन की थर्मल स्थिरता के माप को संदर्भित करता है। इस संभावना की पेशकश करने वाले पहले उपकरणों में से एक OPTIM1000 था जो प्रकाश तीव्रता के व्यापक स्पेक्ट्रम के साथ-साथ एक नमूने के प्रकाश बिखरने को मापता है। इस मशीन ने प्रोटीन खुलासा (आमतौर पर ट्रिप्टोफान फ्लोरेसेंस के बाद) और प्रोटीन एकत्रीकरण (जैसा कि गठित नैनोकणों के परिणामस्वरूप ~ 400 एनएम पर प्रकाश बिखरने की वृद्धि होती है) के एक साथ माप की अनुमति दी जाती है। बाद में, प्रोमेथियस ने फ्लोरेसेंस सिग्नल के एकत्रीकरण और संवेदनशील पहचान को मापने के लिए बैक-रिफ्लेक्शन का उपयोग शुरू किया, जिससे कम प्रोटीन सांद्रता की स्क्रीनिंग को अच्छी संवेदनशीलता20के साथ अनुमति मिली। निम्नलिखित अनुभाग बताता है कि विभिन्न प्रोटीन लक्ष्यों के लिए हिट का पता लगाने के लिए एक खंड स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए प्रोमेथियस का उपयोग कैसे किया गया था। अपेक्षित प्रोटीन गुणवत्ता और मात्रा के बारे में एक संक्षिप्त परिचय के बाद खंड स्क्रीनिंग प्रयोगों को तैयार करने, प्रदर्शन करने और विश्लेषण करने के लिए कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है। तीन प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग परिणाम iNEXT-डिस्कवरी सहयोग के भाग के रूप में प्राप्त उदाहरण डेटा के रूप में दिखाया गया है ।
यह प्रोटोकॉल कुछ आम रोबोटिक्स और माप उपकरणों का उपयोग करके खंड पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए एक मध्यम से उच्च थ्रूपुट विधि का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित उन लोगों की तरह स्क्रीन नियमित रूप से एम्स्टर्डम में NKI प्रोटीन सुविधा द्वारा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए एक iNEXT-डिस्कवरी सेवा के रूप में, अक्सर भी प्रस्ताव आवेदन और सहकर्मी की समीक्षा के बाद उपयोगकर्ताओं के लिए मुफ्त के लिए । ऐसे में डीएसआई-ओरिंशियल लाइब्रेरी की सुविधा दी जा सकती है, लेकिन हर अलग-अलग यूजर एप्लीकेशन और सर्विस एग्रीमेंट के संदर्भ में अन्य लाइब्रेरी के इस्तेमाल पर भी चर्चा की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में उपकरणों का चुनाव कई प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक समाधान का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन एक सोने के मानक के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। लेबल मुक्त तरीकों के टुकड़े स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य प्रोटीन की थर्मल स्थिरता को मापने के लिए सिफारिश कर रहे हैं, बजाय तरीकों है कि एक रिवर्स प्रतिलेखन पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया थर्मोसाइकिलर में खुलासा का पता लगाने के लिए पर्यावरण की दृष्टि से संवेदनशील लेबल का उपयोग करें ।
लेबल-मुक्त तरीके, जैसे कि प्रोमेथियस उपकरण का उपयोग करके यहां प्रस्तुत किया गया है, कुछ फायदे हैं: वे प्रोटीन की कम मात्रा का उपयोग करते हैं, अक्सर परिमाण के कुछ आदेश कम; वे एक साथ नमूने के बिखरने को मापने और इस तरह एकत्रीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और अन्य दृष्टिकोणों में खुलासा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लेबल प्रत्येक टुकड़े के साथ अलग-अलग बातचीत कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माप कलाकृतियों में शामिल हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को मच्छर रोबोट के संदर्भ में वर्णित किया गया है, जो नमूने की एक बहुत छोटी मात्रा (0.3 माइक्रोएल) की पिपिंग की अनुमति देता है जिसे मैन्युअल रूप से नहीं किया जा सकता है। मच्छर एक लोकप्रिय रोबोट है, जो संरचनात्मक जीव विज्ञान और दवा खोज परियोजनाओं पर काम करने वाली कई प्रयोगशालाओं में मौजूद है; हालांकि, प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से कम मात्रा वाले पिपटिंग के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग कर सकता है।
खंड पुस्तकालयों में डीएमएसओ में भंग यौगिक होते हैं। प्रारंभिक चुनौतियों में से एक इष्टतम DMSO एकाग्रता जिस पर प्रोटीन स्थिर रहता है खोजने के लिए है, और यौगिकों घुलनशील रहते हैं । इसमें स्क्रीनिंग के लिए इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विभिन्न डीएमएसओ सांद्रता पर माप करना शामिल है। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन से कमजोर पड़ने के कारण 0.2% की डीएमएसओ सांद्रता होती है; इन स्थितियों में अधिकांश प्रोटीन काफी स्थिर होते हैं। 768-यौगिक पुस्तकालय के लिए स्क्रीनिंग करने के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा कुल में ~ 2-3 मिलीग्राम है, क्योंकि माप आमतौर पर कम प्रोटीन सांद्रता (0.2 मिलीग्राम एमएल-1)पर किए जाते हैं। इस तरह के अपेक्षाकृत कम प्रोटीन सांद्रता के साथ काम करना न केवल प्रोटीन उत्पादन लागत को कम करता है, बल्कि प्रोटीन वर्षा की संभावना को भी कम करता है। कम प्रोटीन एकाग्रता टुकड़े बाध्यकारी का पता लगाने को प्रभावित नहीं करती है, क्योंकि प्रयोग में टुकड़ों की एकाग्रता ~ 2 mM है, जिससे कमजोर बाइंडर्स की पहचान भी की जा सकती है।
चूंकि इन प्रयोगों में पिघलने वाले संक्रमण का पता फ्लोरेसेंस तीव्रता पर आधारित है, इसलिए एक महत्वपूर्ण पहलू लेजर की उत्तेजन शक्ति का निर्धारण करना है जिस पर माप को पूरा करना है। प्रोटीन के साथ यौगिकों की बातचीत (i) का आंतरिक फ्लोरेसेंस पर कोई प्रभाव नहीं पड़ सकता है, (ii) जिसके परिणामस्वरूप शमन होता है, या (iii) इसकी आंतरिक फ्लोरेसेंस में वृद्धि होती है। इसके अलावा, कम प्रोटीन सांद्रता के साथ काम करने का मतलब है कि देशी प्रोटीन के लिए फ्लोरेसेंस गिनती कम होगी। इसलिए उत्तेजन शक्ति को इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए कि अधिकांश नमूनों को मापा जा सके । हर रन का बिखरने वाला प्रोफ़ाइल एकत्रीकरण प्रभावों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है जो किसी भी टुकड़े के अलावा से ट्रिगर हो सकता है। इसके अलावा कंपाउंड घुलनशीलता पर तापमान का असर बिखरने वाले प्रोफाइल पर भी देखा जा सकता है।
अप्रत्याशित रूप से, कई यौगिकों के लिए यह देखा गया कि बढ़ते तापमान(चित्र 6)के साथ बिखरने में वास्तव में कमी आई। इसलिए यह दोनों पिघलने संक्रमण वक्र और साथ बिखरने प्रोफ़ाइल को देखने के लिए प्रत्येक प्रयोग की विश्वसनीयता के बारे में तय करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन टुकड़ों के लिए है कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा अधिक मांग माप के लिए उंमीदवारों माना जाता है, या यहां तक कि अनुवर्ती रसायन विज्ञान के लिए हिट के रूप में माना जाता है । टुकड़ा स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए विधि की एक विशिष्ट सीमा यह है कि DSi-Poised पुस्तकालय में कई टुकड़ों महत्वपूर्ण आंतरिक फ्लोरेसेंस है, कभी कभार भी डिटेक्टर की संतृप्ति सीमा से परे है, और इसलिए इन ठीक से कम उत्तेजना शक्ति पर भी बाध्यकारी लक्ष्य के लिए जांच नहीं की जा सकती है । इस विधि के लिए ध्यान देने वाली एक और बात यह है कि इसका उपयोग केवल ट्रिप्टोफान अवशेषों वाले प्रोटीन के साथ किया जा सकता है।
चित्र 6:यौगिक घुलनशीलता पर तापमान का प्रभाव। पिघलने संक्रमण वक्र और दो अलग यौगिकों के साथ Hec1 के बिखरने प्रोफ़ाइल। (क)बिखरने वाली प्रोफाइल से पता चलता है कि इस सैंपल के लिए घुलनशीलता तापमान से प्रभावित नहीं होती है । (ख)बिखरने वाली प्रोफाइल से पता चलता है कि बढ़ते तापमान के साथ इस सैंपल की घुलनशीलता बढ़ जाती है। इस मामले में पिघलने संक्रमण वक्र इसलिए विश्वसनीय नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
एक खुला सवाल यह है कि टीएममें एक महत्वपूर्ण परिवर्तन के रूप में क्या माना जाना चाहिए, गणितीय परिप्रेक्ष्य से नहीं, लेकिन व्यावहारिक दृष्टिकोण से: टीएम में क्या परिवर्तन एक प्रोटीन के लिए एक ligand के बाध्यकारी के संकेत के रूप में विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है? इन उदाहरणों में, 1 डिग्री सेल्सियस से कम की पाली एचईसी 1 के लिए 74% टुकड़ों के लिए, एमपी 1 के लिए 66% और एनएसपी 5 के लिए 53% देखी जाती है। 1 डिग्री सेल्सियस को ‘महत्वपूर्ण परिवर्तन’ के रूप में देखते हुए शायद ही हिट प्रदान करेगा जो अनुवर्ती रसायन शास्त्र द्वारा आगे बढ़ाने के योग्य हैं। अवलोकन रेखांकन(चित्रा 5)में, 1, 2, 5, या टीएम शिफ्ट के 5 डिग्री से अधिक के डिब्बे, या तो सकारात्मक या नकारात्मक, माना जाता था । यह एक अच्छा सिंहावलोकन देने के लिए और सूचित निर्णय लेने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक विशिष्ट मामले के अनुसार संशोधन की आवश्यकता है, अगले कदम का निर्धारण । विशेष रूप से, कुछ प्रोटीन के लिए, विचार किए गए टुकड़ों के आधार पर लक्ष्य के स्थिरीकरण और डी-स्थिरीकरण दोनों देखे गए। दोनों घटनाओं दिलचस्प हैं, के रूप में दोनों टुकड़ा बाध्यकारी का परिणाम हो सकता है, और दोनों एक अच्छा अनुवर्ती अणु के लिए प्रोटीन व्यवहार में हेरफेर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
एक अंतिम प्रश्न रहता है, अर्थात्, “क्या एक उपयोगी हिट को परिभाषित करता है?” । वास्तव में, उत्तर विशिष्ट स्थिति पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, Hec1 के लिए, सभी टुकड़े जो प्रोटीन को 2 डिग्री से अधिक स्थिर करते हैं या इसे 5 से अधिक अस्थिर करते हैं, हमारे रसायन विज्ञान सहयोगियों को सूचित किए गए थे, जिन्होंने इन हिट के आधार पर नए अणुओं को डिजाइन किया था । Nsp5 के लिए, हालांकि, एनएमआर प्रयोगों के साथ नैनोडीएसएफ-व्युत्पन्न हिट की पुष्टि करने के लिए हमारे एनएमआर सहयोगियों को सबसे अधिक डी-स्थिर हिट सूचित किए गए थे। दूसरे शब्दों में, इस प्रोटोकॉल से प्राप्त स्क्रीनिंग परिणामों का विश्लेषण सावधानी के साथ और संदर्भ-निर्भर तरीके से किया जाना चाहिए, जो विशिष्ट प्रश्न और आसपास की कार्यप्रणाली के आधार पर सूचित निर्णय लेते हैं । किसी भी मामले में, यहां वर्णित विधि एक्स-रे और एनएमआर-आधारित स्क्रीनिंग जैसे मौजूदा तरीकों के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है, जिसका उद्देश्य रसायन विज्ञान अभियानों के लिए नए विचारों की पुष्टि, प्राथमिकता या देना हो सकता है ।
पूरक तालिका S1: प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की सूची। संक्षिप्त: HEPES = 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) -1-piperazineethanesulfonic एसिड; डीटीटी = डिइयोथरेटोल; MOBS = 4-(N-morpholino) ब्यूटेनसुल्फोनिक एसिड। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक तालिका S2: नैनोडिस्पनर रोबोट के साथ उपयोग के लिए एमआरसी 2-वेल प्लेट के लिए गुण। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक तालिका S3: नैनोडिस्पनर रोबोट के साथ उपयोग के लिए 96-अच्छी तरह से वी-बॉटम प्लेट के गुण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक तालिका S4: बफर, प्रोटीन एकाग्रता, औरप्रोटीन के टीएम प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की । संक्षिप्त: डीटीटी = डिइयोथरेटोल; Hec1 = अत्यधिक कैंसर 1 प्रोटीन में व्यक्त; Mps1 = एकाधिकार धुरी kinase 1; Nsp5 = सार्स-CoV-2 3C की तरह प्रोटीज । कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक फ़ाइल 1: अवलोकन पैरामीटर–उदाहरण डेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 2: टीएम और 406 टुकड़े-उदाहरण डेटा के लिएटी एम मान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
The authors have nothing to disclose.
“यह काम NKI प्रोटीन सुविधा, एक निर्देश-एरिक केंद्र के लिए उपयोग से लाभा हुआ । यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित 871037 परियोजना संख्या iNEXT, परियोजना संख्या 653706, और iNEXT-डिस्कवरी द्वारा वित्तीय सहायता प्रदान की गई है।
ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates |