Overvåking av endringer i smeltetemperaturen til et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode for screening av fragmentbiblioteker av noen få hundre forbindelser. Vi presenterer en TSA-protokoll som implementerer robotisert nano-differensialskanning Fluorimetry (nano-DSF) for overvåking av iboende tryptofan fluorescens og lys back-scattering for fragmentscreening.
Termiske skiftanalyser (TSAer) undersøker hvordan smeltetemperaturen (Tm) til et målprotein endres som følge av endringer i miljøet (f.eks.buffersammensetning). Nytten av TSA, og spesielt av nano-Differensialskanning Fluorimetry (nano-DSF), har blitt etablert gjennom årene, både for å finne forhold som bidrar til å stabilisere et bestemt protein og for å se på ligandbinding ved å overvåke endringer i den tilsynelatende Tm. Dette dokumentet presenterer en effektiv screening av Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragmentbibliotek (768 forbindelser) ved bruk av nano-DSF, overvåking Tm for å identifisere potensiell fragmentbinding. Forutsetningene for proteinkvalitet og konsentrasjon for å utføre nano-DSF-eksperimenter er kort skissert etterfulgt av en trinnvis protokoll som bruker en nano-liters robotdispenser som vanligvis brukes i strukturelle biologilaboratorier for å forberede de nødvendige prøvene i 96-brønnsplater. Protokollen beskriver hvordan reagensblandingene overføres til kapillærene som trengs for nano-DSF-målinger. I tillegg gir dette dokumentet protokoller for å måle termisk denaturering (overvåking av innebygd tryptofan fluorescens) og aggregering (overvåking av lys back-scattering) og de påfølgende trinnene for dataoverføring og analyse. Til slutt diskuteres screeningeksperimenter med tre forskjellige proteinmål for å illustrere bruken av denne prosedyren i sammenheng med blyoppdagelseskampanjer. Det overordnede prinsippet for metoden som er beskrevet, kan enkelt overføres til andre fragmentbiblioteker eller tilpasses andre instrumenter.
Narkotikaoppdagelsesprogrammer starter ofte med å screene kjemiske forbindelser for deres evne til å samhandle med og / eller endre funksjonen til narkotikamål, oftest proteiner. De såkalte “hits” som finnes i slike skjermer, legger grunnlaget for oppdagelsen av nye potensielle kunder og utviklingskandidater, og for de fleste av de nye stoffene som blir lisensiert i disse dager. Tilgjengeligheten av høygjennomstrømningsmetoder er derfor uunnværlig for å screene et enormt antall tilgjengelige mål med et stort antall forskjellige forbindelser for raskt å identifisere deres tette binding eller deres evne til å modulere en bestemt funksjon av målet. Etter at treff er identifisert, skyves de mest lovende hitmålkombinasjonene inn i en omfattende rørledning for narkotikautvikling ved hjelp av andre, ofte dyre og tidkrevende teknologier, for å forstå “strukturaktivitetsrelasjoner” (SAR).
Strukturelle biologi tilnærminger, for eksempel de som tilbys av EU-finansierte tilgangsprogrammer “Infrastruktur for NMR, EM og røntgenstråler for translasjonell forskning” (iNEXT) og dens nåværende etterfølger iNEXT-Discovery, brukes ofte til å studere interaksjonene mellom mange forbindelser i ekstrem detalj samtidig som de affinitets- og farmakologiske egenskapene til de første treffene forbedres av vanligvis flere runder med syntetisk kjemi1. Blyforbindelser som kommer ut av disse “fra hit til lead” -kampanjer blir utviklingskandidater og går inn i prekliniske studier. Den velutviklede molekylære screeningmetoden kan grovt kategoriseres i to tilnærminger, nemlig det ligandbaserte blyfunnet (LBLD) og fragmentbasert blyfunn (FBLD). I LBLD-kampanjer blir proteinreseptorer screenet med enten noen få tusen håndplukkede ligander (basert på strukturen av naturlige ligander eller strukturen til målet), eller med mange titusenvis av forbindelser i narkotikalignende ligandbiblioteker som dekker en stor del av kjemisk rom.
Vanligvis testes forbindelsene for deres hemmende aktivitet i en aktivitetsanalyse, som vanligvis overvåker en enzymatisk funksjon. I FBLD-kampanjer2,3,4,5, er imidlertid noen hundre forbindelser som vanligvis er mindre enn narkotika (100-200 Dalton) testet for deres evne til å binde målet direkte, uten bruk av en aktivitetsanalyse. Denne bindingen kan forstyrre målaktiviteten og kan måles ved hjelp av mange biofysiske metoder som rapporterer direkte om fragmenters evne til å binde seg til målet, eller ved strukturelle metoder som røntgenkrystallografi6 og kjernemagnetisk resonansspektroskopi7, og mer nylig også kryo-elektronmikroskopi. Når fragmenter binder seg på forskjellige steder som er nær hverandre på proteinet, kan de forskjellige, vanligvis lavaffinitetsbindende fragmentene kombineres rasjonelt kjemisk for å skape et lite sett med ledninger som kan studeres mer detaljert. Dette resulterer ofte i høyere affinitet, mer potente forbindelser, og denne metoden har begynt å gi viktige molekyler med klinisk potensial. Valget av et “ideelt” fragmentbibliotek som utnytter kjemiske grupper effektivt, har vært et aktivt forskningsområde i mange år8,9,10.
Mens den første vektleggingen var på å dekke fullt kjemisk rom, var etterfølgende oppmerksomhet fokusert på å muliggjøre nedstrøms kjemisk kombinasjon av fragmenttreff for å produsere blyforbindelser. Slik forskning har ført til de såkalte “poised” bibliotekene. Disse inneholder fragmenter med minst én funksjonsgruppe som tillater rask, billig oppfølging av syntetisk kjemi for effektiv fremgang i studier av SAR. En av aktivitetene katalysert av iNEXT var å oppdatere biblioteket utviklet av forskere i Diamond Light Source og Structural Genomics Consortium. Denne kombinerte innsatsen resulterte i DSi-Poised-biblioteket11, som også er validert i iNEXT12. Senere ble dette biblioteket justert med tilgjengeligheten av forbindelser i REAL Database of Enamine Ltd., en kjemisk forskningsorganisasjon og produsent av store samlinger av byggeklosser og sammensatte biblioteker for screening. DSi-Poised er nå tilgjengelig for alle for kjøp, men også tilgjengelig i mange iNEXT-Discovery-partnerlaboratorier for støttede fragmentscreeningsprosjekter.
Den avanserte røntgenkrystallografien og NMR-strukturelle biologiteknologien har begge sine fordeler og ulemper for FBLD. Begge krever isolerte målprøver og gir de høyoppløselige atomdetaljene som kreves for FBLD. Krystaller er imidlertid nødvendige for røntgenkrystallografi, og fragmentene binder seg til hulrom i de velordnede proteinområdene som ikke er involvert i å bygge det tredimensjonale krystallgitteret. Løsning NMR gir ofte forskjellige treff fra røntgenkrystallografi, da den ikke påvirkes av krystallmiljøet og er god til å oppdage binding også i delvis bestilte proteinregioner. Men selv om ligandbaserte NMR-eksperimenter er relativt raske, krever de fortsatt en betydelig mengde tid og materiale og kan rutinemessig bare gjøres for relativt små proteinmål eller domener. Med det formål å prioritere forbindelser for krystallografiske eller NMR-eksperimenter, har biofysiske tilnærminger blitt brukt13,14,15.
Ettersom nyere instrumenterings- og beregningsprotokoller tillater effektiv krystallografisk screening for FBLD ved å bestemme strukturer og analysere ~ 1000 fragmenter veldig effektivt, har denne prioriteringen blitt mindre viktig i røntgenbasert forskning. For NMR er det imidlertid fortsatt ønskelig å bruke billigere og raskere eksperimenter for å prioritere bibliotekscreening og spare instrumenttid på avansert utstyr. Samtidig kan bruk av en kombinasjon av i hovedsak forskjellige teknologier gi uavhengig bekreftelse av bindende hendelser, eller til og med flere treff som ikke plukkes opp ved å bruke bare krystallografien eller NMR-metoden. Krystallografiske og NMR-teknikker krever begge svært dyrt utstyr og kan ofte bare gjøres i dedikerte eksterne anlegg med hjelp fra lokale, dyktige eksperter. I tillegg krever riktig analyse av resultatene også høy kompetanse. Mens programmer som iNEXT og iNEXT-Discovery demokratiserer tilgang til slike anlegg16, har det blitt anerkjent at billig, rask og høy gjennomstrømning FBLD screening ved andre metoder kan oppmuntre til narkotikascreeningsprogrammer i et mye bredere spekter av laboratorier. Slike resultater kan deretter brukes som en indikasjon på å bygge samarbeid med medisinske kjemikere, og for å prioritere de dyreste screeningforsøkene til de mest lovende forbindelsene hvis NMR og krystallografianlegg pålegger restriksjoner på antall forbindelser som kan screenes.
TSA danner en rask, effektiv og relativt billig og tilgjengelig biofysisk metode17 som kan brukes til FBLD-screening. Den har blitt brukt i flere innstillinger, fra å hjelpe til med å finne stabile proteinforhold for krystalliseringsforsøk18, til å finne forbindelser som binder seg til spesifikke mål i celle19. TSAer har også blitt brukt til å måle dissosiasjonskonstantene for ligander som binder målproteiner, da ligandbinding ofte fører til endringer i termisk stabilitet. I alle TSA-er måles endringen i denatureringstemperaturen til et protein (stabiliteten) som en funksjon av en langsom temperaturøkning. En effektiv måte å følge protein denaturering ved oppvarming er av DSF eller Thermofluor, som kvantifiserer fluorescens slukking av en hydrofob fargestoff (vanligvis Sypro Orange) ved interaksjon med eksponerte hydrofobe områder av protein som utfolder seg på grunn av temperaturøkning.
Nano-DSF refererer vanligvis til måling av termisk stabilitet av protein i fravær av eksterne fargestoffer. Et av de første instrumentene som tilbød denne muligheten var OPTIM1000 som måler et bredt spekter av lysintensitet samt lysspredning av en prøve. Denne maskinen tillot samtidig måling av protein utfoldelse (vanligvis etter tryptofan fluorescens) og protein aggregering (som dannet nanopartikler resulterer i en økning av lysspredning på ~ 400 nm). Senere introduserte Prometheus bruk av ryggrefleksjon for måling av aggregering og sensitiv deteksjon av fluorescenssignalet, slik at screening av lave proteinkonsentrasjoner med god følsomhet20. Følgende avsnitt beskriver hvordan Prometheus ble brukt til å demonstrere en fragmentscreeningsprotokoll for å oppdage treff for forskjellige proteinmål. En kort innføring i forventet proteinkvalitet og kvantitet etterfølges av en trinnvis protokoll for å forberede, utføre og analysere fragmentscreeningseksperimentene. Screeningresultater for tre proteiner har blitt vist som eksempeldata innhentet som en del av iNEXT-Discovery-samarbeid.
Denne protokollen beskriver en middels til høy gjennomstrømningsmetode for screening av fragmentbiblioteker ved hjelp av noen vanlige robotikk- og måleinstrumenter. Skjermer som de som er beskrevet i denne protokollen kan rutinemessig utføres av NKI Protein Facility i Amsterdam, for eksempel som en iNEXT-Discovery-tjeneste, ofte til og med gratis for brukere etter forslagsprogram og fagfellevurdering. I slike tilfeller kan DSi-Poised-biblioteket leveres av anlegget, men bruken av andre biblioteker kan også diskuteres i sammenheng med hver enkelt brukerapplikasjon og tjenesteavtale. Valg av instrumenter i denne protokollen representerer praktiske løsninger for mange laboratorier, men bør ikke betraktes som en gullstandard. Etikettfrie metoder anbefales for å måle den termiske stabiliteten til målproteinet for fragmentscreening, i stedet for metoder som bruker miljøfølsomme etiketter for å oppdage utfolde seg i en omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjonstermosykler.
Etikettfrie metoder, som den som presenteres her ved hjelp av Prometheus-instrumentet, har noen fordeler: de bruker lave mengder protein, ofte et par størrelsesordener mindre; de kan brukes til samtidig å måle spredning av prøven og dermed aggregasjon; og etikettene som brukes til å oppdage utfoldelse i andre tilnærminger, kan samhandle forskjellig med hvert fragment, noe som resulterer i måleartefakter. Denne protokollen er beskrevet i sammenheng med Myggroboten, som tillater pipettering av et svært lite volum prøve (0,3 μL) som ikke kan gjøres manuelt. Mosquito er en populær robot, til stede i mange laboratorier som arbeider med strukturell biologi og narkotikaoppdagelsesprosjekter; Protokollen kan imidlertid tydelig bruke alternative tilnærminger for pipettering med lavt volum.
Fragmentbiblioteker inneholder forbindelser oppløst i DMSO. En av de første utfordringene er å finne den optimale DMSO-konsentrasjonen der proteinet forblir stabilt, og forbindelsene forblir oppløselige. Dette innebærer å utføre målingene ved ulike DMSO-konsentrasjoner for å bestemme de optimale forholdene for screening. Proteinet til fragmentfortynning som brukes her resulterer i DMSO-konsentrasjoner på 0,2%; de fleste proteiner er ganske stabile under disse forholdene. Mengden protein som kreves for å utføre screeningen for det 768-sammensatte biblioteket er ~ 2-3 mg totalt, da målingene vanligvis utføres ved lave proteinkonsentrasjoner (0,2 mg ml-1). Å jobbe med slike relativt lave proteinkonsentrasjoner reduserer ikke bare proteinproduksjonskostnadene, men reduserer også sjansene for proteinnedbør. Den lave proteinkonsentrasjonen påvirker ikke påvisning av fragmentbinding, da konsentrasjonen av fragmentene i eksperimentet er ~ 2 mM, slik at også svake bindemidler kan identifiseres.
Ettersom smelteovergangsdeteksjonen i disse eksperimentene er basert på fluorescensintensitet, er et kritisk aspekt å bestemme eksitasjonskraften til laseren som laseren skal utføre målingene på. Samspillet mellom forbindelsene med proteinet kan (i) ikke ha noen effekt på dens indre fluorescens, (ii) resulterer i slukking, eller (iii) øke sin indre fluorescens. I tillegg til dette betyr arbeid med lave proteinkonsentrasjoner at fluorescenstallet for det opprinnelige proteinet vil være lavt. Eksitasjonskraften må derfor justeres slik at de fleste prøvene kan måles. Spredningsprofilen for hver kjøring gir viktig informasjon om aggregasjonseffektene som kan utløses ved at eventuelle fragmenter legges til. I tillegg kan effekten av temperatur på sammensatt løselighet også ses på spredningsprofilen.
Uventet ble det for mange forbindelser observert at spredningen faktisk ble redusert med økende temperatur (Figur 6). Det er derfor viktig å se på både smeltende overgangskurve og tilhørende spredningsprofil for å bestemme påliteligheten til hvert eksperiment, spesielt for de fragmentene som regnes som kandidater for mer krevende målinger av røntgenkrystallografi eller NMR-spektroskopi, eller til og med betraktet som treff for oppfølgingskjemi. En spesifikk begrensning av metoden for fragmentscreening er at mange fragmenter i DSi-Poised-biblioteket har betydelig iboende fluorescens, noen ganger til og med utenfor detektorens metningsgrense, og derfor kan disse ikke screenes riktig for målbinding selv ved lav eksitasjonskraft. Et annet poeng å merke seg for denne metoden er at den bare kan brukes med proteiner som inneholder tryptofan rester.
Figur 6: Effekt av temperatur på sammensatt løselighet. Smeltende overgangskurve og spredningsprofil av Hec1 med to forskjellige forbindelser. (A) Spredningsprofilen viser at for denne prøven påvirkes ikke løseligheten av temperatur. (B) Spredningsprofilen viser at løseligheten til denne prøven øker med økende temperatur. Smelteovergangskurven i dette tilfellet er derfor ikke pålitelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et åpent spørsmål er hva som bør betraktes som en betydelig endring i Tm, ikke fra et matematisk perspektiv, men fra det praktiske synspunktet: Hvilken endring i Tm er viktig å vurdere som en indikasjon på binding av en ligand til et protein? I disse eksemplene ses skift på mindre enn 1 °C for 74 % av fragmentene for binding av Hec1, 66 % for Mps1 og 53 % for Nsp5. Med tanke på 1 °C som «betydelig endring» vil det neppe gi treff som er verdige å forfølge ved oppfølgingskjemi. I oversiktsgrafene (figur 5) ble det vurdert hyller på 1, 2, 5 eller mer enn 5 grader Tm skift, enten positive eller negative. Dette krever endring i henhold til hvert enkelt tilfelle for å gi en god oversikt og for å tillate informert beslutningstaking, og bestemme neste trinn. Spesielt for noen proteiner ble både stabilisering og destabilisering av målet observert avhengig av fragmentene som vurderes. Begge hendelsene er interessante, da begge kan være et resultat av fragmentbinding, og begge kan føre til et godt oppfølgingsmolekyl for å manipulere proteinadferd.
Et siste spørsmål gjenstår, nemlig “hva definerer et nyttig treff?”. Faktisk avhenger svaret av den spesifikke situasjonen. For eksempel, for Hec1, ble alle fragmenter som stabiliserer proteinet med mer enn 2 grader eller destabiliserer det med mer enn 5 kommunisert til våre kjemipartnere, som designet nye molekyler basert på disse treffene. For Nsp5 ble imidlertid de mest destabiliserende treffene kommunisert til våre NMR-samarbeidspartnere for å bekrefte de nanoDSF-avledede treffene med NMR-eksperimenter. Med andre ord bør screeningresultatene fra denne protokollen analyseres med forsiktighet og på en kontekstavhengig måte, og ta informerte beslutninger basert på det spesifikke spørsmålet og den omkringliggende metodikken. I alle fall er metoden beskrevet her en komplementær tilnærming til eksisterende metoder som røntgen- og NMR-basert screening, som kan ta sikte på å bekrefte, prioritere eller gi nye ideer til kjemikampanjer.
Supplerende tabell S1: Liste over buffere som brukes til screening av proteiner. Forkortelser: HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butansulfonsyre. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell S2: Egenskaper for MRC 2-brønnsplate for bruk med nanodispenserrobot. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende bord S3: Egenskaper for 96-brønns V-bunnplate for bruk med nanodispenserrobot. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell S4: Bufferen, proteinkonsentrasjonen og Tm av proteinene som er diskutert i representative resultater. Forkortelser: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Svært uttrykt i kreft 1 protein; Mps1 = monopolar spindel kinase 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-lignende protease. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Oversiktsparametere–eksempeldata. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Verdiene Tm og ΔTm for data med 406 fragmenter. Klikk her for å laste ned denne filen.
The authors have nothing to disclose.
“Dette arbeidet hadde nytte av tilgang til NKI Protein Facility, et Instruct-ERIC-senter. Økonomisk støtte er gitt av iNEXT, prosjektnummer 653706, og iNEXT-Discovery, prosjektnummer 871037, finansiert av Horisont 2020-programmet til EU-kommisjonen”.
ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates |