Nanodioxidscanning fluormetri för screening i fragmentbaserad blyupptäckt

Summary

Övervakning av förändringar i smälttemperaturen hos ett målprotein (dvs.termisk skiftanalys, TSA) är en effektiv metod för screening av fragmentbibliotek av några hundra föreningar. Vi presenterar ett TSA-protokoll som implementerar robotassisterad nanodistansskanningsfluormetri (nano-DSF) för övervakning av inneboende tryptofanfluorescens och ljus ryggspridning för fragmentscreening.

Abstract

TSA-analyser undersöker hur smälttemperaturen (T_m)för ett målprotein förändras som svar på förändringar i dess miljö (t.ex.buffertsammansättning). Nyttan av TSA, och särskilt nanodioxid scanning fluormetri (nano-DSF), har fastställts under åren, både för att hitta villkor som hjälper till att stabilisera ett visst protein och för att titta på ligand bindande genom att övervaka förändringar i den uppenbara T_m. Detta dokument presenterar en effektiv screening av Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragmentbibliotek (768 föreningar) med hjälp av nano-DSF, övervakning T_{m för} att identifiera potentiell fragmentbindning. Förutsättningarna för proteinkvalitet och koncentration för att utföra nano-DSF-experiment beskrivs kortfattat följt av ett steg-för-steg-protokoll som använder en nanoliters robotdispenser som vanligtvis används i strukturbiologiska laboratorier för att förbereda de nödvändiga proverna i 96-brunnsplattor. Protokollet beskriver hur reagensblandningarna överförs till de kapillärer som behövs för nano-DSF-mätningar. Dessutom ger detta dokument protokoll för att mäta termisk denaturering (övervakning av inneboende tryptofan fluorescens) och aggregering (övervakning av ljus ryggspridning) och efterföljande steg för dataöverföring och analys. Slutligen diskuteras screeningexperiment med tre olika proteinmål för att illustrera användningen av denna procedur i samband med blyupptäcktskampanjer. Den övergripande principen för den beskrivna metoden kan enkelt överföras till andra fragmentbibliotek eller anpassas till andra instrument.

Introduction

Läkemedelsupptäcktsprogram börjar ofta med att undersöka kemiska föreningar för deras förmåga att interagera med och / eller ändra funktionen hos läkemedelsmål, oftast proteiner. De så kallade "hits" som finns i sådana skärmar lägger grunden för upptäckten av nya leads och utvecklingskandidater, och för de flesta av de nya läkemedel som licensieras idag. Tillgången till metoder med hög genomströmning är därför oumbärlig för att screena ett enormt antal tillgängliga mål med ett stort antal olika föreningar för att snabbt identifiera deras snäva bindning eller deras förmåga att modulera en specifik funktion av målet. När träffar har identifierats skjuts de mest lovande hit-target-kombinationerna in i en omfattande läkemedelsutvecklingspipeline med hjälp av andra, ofta dyra och tidskrävande tekniker, för att förstå "strukturaktivitetsrelationer" (SAR).

Strukturella biologimetoder, såsom de som erbjuds av de EU-finansierade tillträdesprogrammen "Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) och dess nuvarande efterträdare iNEXT-Discovery, används ofta för att studera interaktionerna mellan många föreningar i extrem detalj samtidigt som affiniteten och farmakologiska egenskaperna hos de första träffarna förbättras av vanligtvis flera omgångar syntetisk^{kemi 1}. Blyföreningar som kommer från dessa "från hit till lead"-kampanjer blir utvecklingskandidater och går in i prekliniska studier. Den välutvecklade molekylära screeningmetoden kan grovt kategoriseras i två metoder, nämligen den ligand-baserade blyupptäckten (LBLD) och fragmentbaserad blyupptäckt (FBLD). I LBLD-kampanjer screenas proteinreceptorer med antingen några tusen handplockade ligander (baserat på strukturen hos naturliga ligander eller målets struktur), eller med många tiotusentals föreningar i drogliknande ligandbibliotek som täcker en stor del av kemiskt utrymme.

Vanligtvis testas föreningarna för sin hämmande aktivitet i en aktivitetsanalys, vanligtvis övervaka en enzymatisk funktion. I FBLD-kampanjer^2,3,4,5, dock testas några hundratals föreningar som vanligtvis är mindre än droger (100-200 Dalton) för deras förmåga att binda målet direkt, utan användning av en aktivitetsanalys. Denna bindning kan störa målaktiviteten och kan mätas med många biofysiska metoder som rapporterar direkt om fragmentens förmåga att binda till målet, eller med strukturella metoder som röntgenkristallografi⁶ och kärnmagnetisk resonansspektroskopi⁷, och mer nyligen också kryoelektronmikroskopi. När fragment binder på olika platser som ligger nära varandra på proteinet kan de olika, vanligtvis låg affinitetsbindningsfragmenten kombineras rationellt kemiskt för att skapa en liten uppsättning leads som kan studeras mer detaljerat. Detta resulterar ofta i högre affinitet, mer potenta föreningar, och denna metodik har börjat ge viktiga molekyler med klinisk potential. Valet av ett "idealiskt" fragmentbibliotek som utnyttjar kemiska grupper effektivt har varit ett aktivt forskningsområde i många år^8,9,10.

Medan den ursprungliga betoningen låg på att täcka fullt kemiskt utrymme, var efterföljande uppmärksamhet inriktad på att möjliggöra den nedströms kemiska kombinationen av fragmentträffar för att producera blyföreningar. Sådan forskning har lett till de så kallade "poised" biblioteken. Dessa innehåller fragment med minst en funktionell grupp som möjliggör snabb, billig uppföljande syntetisk kemi för effektiva framsteg i studier av sar. En av de aktiviteter som katalyserades av iNEXT var att uppdatera det färdiga biblioteket som utvecklats av forskare i Diamond Light Source och Structural Genomics Consortium. Denna kombinerade insats resulterade i DSi-Poised-biblioteket¹¹, som också har validerats inom iNEXT¹². Senare var detta bibliotek anpassat till tillgången på föreningar i REAL Database of Enamine Ltd., en kemisk forskningsorganisation och producent av stora samlingar av byggstenar och sammansatta bibliotek för screening. DSi-Poised är nu tillgängligt för alla att köpa, men finns även i många iNEXT-Discovery-partnerlaboratorier för fragmentscreeningsprojekt som stöds.

Den avancerade röntgenkristallografin och NMR-strukturbiologitekniken har båda sina fördelar och nackdelar för FBLD. Båda kräver isolerade målprover och ger de högupplösta atomdetaljer som krävs för FBLD. Kristaller är dock nödvändiga för röntgenkristallografi, och fragmenten binder till håligheter i de välbeställda proteinregionerna som inte är involverade i byggandet av det tredimensionella kristallgitteret. Lösning NMR ger ofta olika träffar från röntgenkristallografi, eftersom den inte påverkas av kristallmiljön och är bra på att upptäcka bindning även i delvis beställda proteinregioner. Men även om ligand-baserade NMR-experiment är relativt snabba, kräver de fortfarande en betydande mängd tid och material och kan rutinmässigt endast göras för relativt små proteinmål eller domäner. För att prioritera föreningar för kristallografiska eller NMR-experiment har biofysiska metoder använts^13,14,15.

Eftersom de senaste instrumenterings- och beräkningsprotokollen möjliggör effektiv kristallografisk screening för FBLD genom att bestämma strukturer och analysera ~ 1 000 fragment mycket effektivt, har denna prioritering blivit mindre väsentlig i röntgenbaserad forskning. För NMR är det dock fortfarande önskvärt att använda billigare och snabbare experiment för att prioritera biblioteksscreening och spara instrumenttid på den avancerade utrustningen. Samtidigt kan användning av en kombination av i huvudsak olika tekniker ge oberoende bekräftelse av bindande händelser, eller till och med ytterligare träffar som inte plockas upp genom att endast använda kristallografin eller NMR-metoden. Kristallografiska och NMR-tekniker kräver båda mycket dyr utrustning och kan ofta endast göras i dedikerade externa anläggningar med hjälp av lokala, mycket skickliga experter. Dessutom kräver en korrekt resultatanalys också hög kompetens. Medan program som iNEXT och iNEXT-Discovery demokratiserar tillgången till sådana^{anläggningar 16}, har det erkänts att billig, snabb och hög genomströmning FBLD screening med andra metoder kan uppmuntra drogscreeningsprogram i ett mycket bredare utbud av laboratorier. Sådana resultat kan sedan användas som en indikation för att bygga samarbeten med medicinska kemister och för att prioritera de dyraste screeningexperimenten till de mest lovande föreningarna om NMR- och kristallografianläggningar inför begränsningar för antalet föreningar som kan screenas.

TSA bildar en snabb, effektiv och relativt billig och tillgänglig biofysisk metod¹⁷ som kan användas för FBLD-screening. Det har använts i flera inställningar, från att hjälpa till att hitta stabila proteinförhållanden för kristalliseringsförsök¹⁸, till att hitta föreningar som binder till specifika mål i^{cellerna 19}. TSA har också använts för att mäta dissociationskonstanterna för ligands bindande målproteiner, eftersom ligandbindning ofta leder till förändringar i termisk stabilitet. I alla TSAs mäts förändringen i denatureringstemperaturen hos ett protein (dess stabilitet) som en funktion av en långsam temperaturökning. Ett effektivt sätt att följa proteindenaturering vid uppvärmning är av DSF eller Thermofluor, som kvantifierar fluorescenssläckande av ett hydrofobiskt färgämne (vanligtvis Sypro Orange) vid interaktion med exponerade hydrofobiska proteinregioner som utvecklas på grund av temperaturökning.

Nano-DSF hänvisar vanligtvis till mätning av proteinens termiska stabilitet i avsaknad av yttre färgämnen. Ett av de första instrumenten som erbjöd denna möjlighet var OPTIM1000 som mäter ett brett spektrum av ljusintensitet och ljusspridning av ett prov. Denna maskin tillät samtidig mätning av protein som utvecklas (vanligtvis efter tryptofanfluorescens) och proteinaggregering (som bildade nanopartiklar resulterar i en ökning av ljusspridning vid ~ 400 nm). Senare introducerade Prometheus användningen av backreflektion för att mäta aggregering och känslig detektion av fluorescenssignalen, vilket möjliggör screening av låga proteinkoncentrationer med god^{känslighet 20}. I följande avsnitt beskrivs hur Prometheus användes för att demonstrera ett fragmentscreeningsprotokoll för att upptäcka träffar för olika proteinmål. En kort introduktion om förväntad proteinkvalitet och mängd följs av ett steg-för-steg-protokoll för att förbereda, utföra och analysera fragmentscreeningsexperimenten. Screeningresultat för tre proteiner har visats som exempel data som erhållits som en del av iNEXT-Discovery samarbeten.

Protocol

OBS: De proteiner som används i nano-DSF-experiment bör vara rena (>95%) och homogena enligt vad som bedöms av natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Innan fragmentskärmen utförs bör proteinens stabilitet bestämmas under olika buffertförhållanden. En låg jonisk styrka, låg saltbuffert som stör proteinet minimalt bör användas för att inte påverka dess direkta interaktion med fragmenten. De buffertar som vanligtvis används i det här protokollet för att kontrollera stabiliteten visas i kompletterande tabell S1. Koncentrationen av proteinet som behöver användas för detta experiment som stamlösning är vanligtvis 0,2 mg mL^-1. För screening av hela DSi-Poised-biblioteket (768 föreningar) behövs totalt ~ 12 ml protein av den koncentrationen, totalt ~ 2,5 mg. DSi-Poised-biblioteket som användes i dessa experiment tillhandahölls i 96-brunnsformat (figur 1). Koncentrationen av fragmenten justerades till 100 mM i 20% v/v dimetylsulfoxid (DMSO). Det bör noteras att det blandningsprotokoll som beskrivs här resulterar i låga slutliga DMSO-koncentrationer på 0,4 % v/v. Även om detta är mycket osannolikt att påverka proteinens stabilitet, bör effekten av DMSO kontrolleras för varje nytt protein.

Figur 1:De typer av plattor som användsfördessa experiment. B)96-brunnsplatta. C)En närbild av 96-brunnsplattan som visar subwell 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

1. Beredning av tallrikar

1. Ta ut en fragmentplatta från frysen -20 °C/-80 °C och låt den tina i rumstemperatur, med skonsam skakning på en bänkskakapparat. Centrifugera plattan vid 500 × g i 30 s för att samla eventuella droppar som fastnar på sidan av brunnarna.
   OBS: Eftersom fragmentbiblioteket finns upplöst i DMSO-d₆ (smältpunkt 19 °C) är det viktigt att se till att varje förening är helt tinad och löslig.
2. Ta en MRC 2-brunns kristalliseringsplatta (Figur 1A) och pipett 14,7 μL av proteinlagerlösningen i varje delbrunn. För att göra detta på ett tidseffektivt sätt, förvara proteinet i en reagensbehållare(Materialförteckning)och använd en flerkanalspipett för dispensering(figur 2A,B).
   OBS: För DSi-Poised-biblioteket, beroende på formatet, innehåller inte alla brunnar på 96-brunnsplattan föreningar. Vanligtvis fylls raderna A, H och kolumnerna 1, 12 med DMSO. Således ska raderna A, H och kolumnerna 1, 12 inte fyllas med protein, eftersom dessa brunnar inte kommer att innehålla några fragment i slutet av nästa steg; Endast DMSO kommer att överföras dit av roboten. Observera att de tomma raderna och kolumnerna skiljer sig åt i vissa tallrikar.

Figur 2: Kontur av fragmentscreeningsförfarandet. (A) Användning av en flerkanalspipett och reagensbehållare för att dispensera proteinet. B)Dispensering av proteinet i 96-brunnsplattan. C)Fragmentdispensering av dispenserroboten. D)Lastning av proteinet i kapillärerna. e)Låda som visar kapillärhållaren. F)Närbild på kapillärhållaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Bild 3:Översikt över den utrustning somanvänds i dessaexperiment. Plåtpositioner anges. (B) Programgränssnitt för att definiera en ny platta. C)Gränssnitt för dispenseringsprogrammet. D)Dispenseringsprogrammet som används för att dela ut fragmenten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

2. Fragment nanodispensering av Myggroboten

1. Kontrollera vilken typ av platta som fragmenten levereras i (Materialförteckning ).
2. Kontrollera fragment- och proteinplattadefinitioner på myggan.
   1. Slå på nanodispensern (figur 3A). Se till att det inte finns några hinder runt de rörliga komponenterna.
   2. Öppna det grafiska användargränssnittet, klicka på fliken Inställningar och kontrollera under Däckskonfigurationom den typ av platta där föreningarna levereras och den där proteinet har överförts i avsnitt 1 redan finns i listan över tillgängliga plattor. Om inte, klickar du på Alternativ| Plåtar och skapa en ny plåtdefinition genom att fylla i rätt värden för egenskapstypen (figur 3B).
      OBS: Dessa värden för MRC 2-brunnsplattan och 96-brunnsplattan som används i detta experiment visas i kompletterande tabell S2 respektive tilläggstabellen S3.
3. Dispenseringsprogrammet
   1. Ange plåtpositionerna under Däckskonfiguration under fliken Inställningar.
      OBS: Myggan som används i detta experiment har två plåtpositioner på däcket. Position 1 definieras som källplattan, och position 2 är målplattan.
   2. Använd rullgardinsmenyn och välj Greiner U bottenplatta för position 1 och MRC 2-brunnsplatta för position 2 (Bild 2C). Spara protokollet.
4. Fragmentdispensering
   1. Placera fragmentplattan på position 1 och proteinplattan vid däckens läge 2 (figur 3A).
   2. Klicka på Arkiv på fliken Protokoll (Bild 3D) och välj det protokoll som sparats i avsnitt 2.3 för att dela ut fragmenten. Definiera volymen på de fragment som ska dispenseras. använd 0,3 μL. För en typisk platta, där kolumnerna 1 och 12 inte innehåller fragment, definierar du startplatsen till kolumn 2 och slutplatsen till kolumn 11. Om kolumnerna 2 eller 11 är tomma i vissa plåtar använder du kolumnerna 3 respektive 10 som start- respektive slutvärden.
      På grund av mygginställningen kan endast kolumner hoppas över, inte rader; för raderna kommer myggan att pipett DMSO. Kontrollera att alternativet Tipsbyte är markerat somAlltid , för att inte korskontaminera fragmentbiblioteket.
   3. Klicka på Kör för att starta programmet. Efter dispensering, som tar ~ 2 min, slutförs, ta bort proteinet och fragmentplattorna från roboten och försegla dem tillbaka med en självhäftande tätningsfilm. Centrifugera kort proteinplattan (500 × g, 30 s) för att samla eventuella droppar som fastnar på sidorna av brunnarna innan du fortsätter till nästa steg.

3. Mätning av nano-DSF

OBS: En detaljerad beskrivning av hur du utför TSA:er med Prometheus NT.48 har publicerats tidigare²⁰. Viktiga punkter inom ramen för fragmentscreening nämns här.

1. Plåtinspektion före mätningen
   1. Inspektera visuellt proteinplattans brunnar för nederbörd som kan ha inträffat på grund av tillsats av fragmenten. Om nederbörd observeras i många brunnar, minska koncentrationen av fragmenten och upprepa experimentet.
      OBS: Det rekommenderas att hålla proteinplattan vid rumstemperatur; fragmenten tenderar att bli olösliga vid lägre temperaturer.
2. Förbereda Prometheus
   1. Slå på Prometheus instrumentet. Tryck på Öppna låda på pekskärmen för att komma åt instrumentets kapillärbelastningsmodul. Ta bort magnetremsan från lastmodulen och rengör spegeln med etanol för att avlägsna eventuella dammpartiklar.
3. Överföring från proteinfragmentplattan till kapillärer
   OBS: Detta steg innebär överföring av det blandade proteinet/fragmentprovet från varje brunn i proteinplattan till kapillärerna för användning med Prometheus. För detta, även om standard kapillärtypen vanligtvis används, är det möjligt att använda kapillärerna med hög känslighet för mycket låga proteinkoncentrationer.
   1. Placera proteinplattan och kapillärerna bredvid instrumentet för att enkelt komma åt kapillärlastningsmodulen.
   2. Ta en kapillär, håll den i ena änden och rör lösningen i proteinplattan med den bortre änden av kapillären för att överföra provet genom kapillärverkan. Använd alltid handskar och se till att inte röra kapillären i mitten, eftersom föroreningar (t.ex.dammpartiklar) från handskarna skulle påverka mätningen.
   3. Placera kapillären i hållarens avsedda läge och se till att den är korrekt justerad och centrerad.
   4. Upprepa steg 3.3.2 och 3.3.3 och fyll därmed alla positioner i lastmodulen. Ladda alla kapillärer du behöver för mätning.
      OBS: För en enda körning kan högst 48 kapillärer laddas.
   5. Placera magnetremsan ovanpå kapillärerna för att hålla dem på plats i slutet och tryck på Stäng låda för att starta experimentet.
4. Utför nano-DSF-experimentet
   1. Fluorescensskanning
      1. Öppna Prometheus ansökan PR. ThermControloch skapa ett nytt projekt genom att klicka på Starta ny session med namnet ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Gör först en upptäcktsskanning för att upptäcka proverna.
         OBS: Fluorescensnivåerna bör helst vara över 3 000 räkningar för varje prov. Prover med fluorescens över instrumentets mättnadsgräns (20 000 räkningar) mäts inte.
      2. Ändra provexemplars fluorescenssignal genom att justera laserns excitationseffekt (figur 4).
   2. Termisk denaturering
      1. Klicka på fliken Smältskanning. För att utföra experimentet ställer du in starttemperaturen på 20 °C, sluttemperaturen till 95 °C och temperaturlutningen till 1 °C min^-1. Klicka på Startmätning.
   3. Kommentera experimentet
      1. När experimenten har startat klickar du på fliken Anteckning och resultat. Kommentera varje kapillär genom att ge den ett unikt plåt- och brunnsnummer.
         OBS: Kapillär 1B2 skulle till exempel motsvara plate 1 och brunn B2. På den här fliken kan extra kolumner läggas till för experimentet, t.ex.proteinnamn, buffert, proteinkoncentration. När experimentet är klart visas också resultaten på den här fliken. Detta är ett bra tillfälle att pausa i slutet av dagen; experimenten äger rum över natten, resultaten kan samlas in nästa dag.
   4. Datavisualisering och export
      1. När experimentet är klart klickar du på fliken Smältskanning för att visa smältnings- och spridningskurvorna för proverna. Om du vill exportera resultaten i ett kalkylblad klickar du på fliken Smältsökning, klickar på Exporteraoch väljer Exportera bearbetade data på den nedrullningsbara menyn.

Bild 4:Justering av excitationseffekten och fluorescenssignalen. (A) Vid 80 % excitationseffekt ligger fluorescenssignalen för de flesta proverna utanför mättnadsgränsen. (B) Fluorescenssignalen reduceras till mätbara nivåer genom att excitationseffekten minskas till 60 %. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

4. Iteration

1. Upprepa steg 1-3 för att utföra 16 körningar på hela Enamine-biblioteket med 768 föreningar (16 × 48 = 768).
2. Eftersom mätningen av varje platta tar ~1,5 h att slutföra, fyll i anteckningen (3.4.3) och förbered nästa proteinfragmentplatta genom att upprepa steg i avsnitten 1 och 2.
   OBS: Under en typisk arbetsdag kan 4-6 plattor mätas, beroende på erfarenhet. Visningen av hela DSi-biblioteket kan vara klar på totalt 3-4 dagar.

5. Dataanalys

1. Granska genererade data
   1. När varje körning är klar klickar du på fliken Anteckningar och resultat för att visa resultaten. För varje prov fokuserar du på två beräknade värden som är viktigast i den här översikten: 1) Spridningstemperaturen (Inset #1 för spridning), som anger temperaturen i början av ökade provspridningshändelser och är karakteristisk för aggregering; 2) T_m (Böjpunkt #1 för ratio)värde som extraheras från förhållandet mellan fluorescenshändelser vid 330 och 350 nm-värden som vanligtvis motsvarar de maximala förändringarna av tryptofan fluorescens vid förändringar i dess miljö.
   2. Var noga med att kontrollera spridnings- och smältkurvorna för varje kapillär på fliken Smältskanning för att se till att dessa värden är tillförlitliga.
2. Exportera och inspektera till ett kalkylblad
   1. Exportera data från alla olika körningar för inspektion till ett kalkylbladsprogram, enligt beskrivningen i 3.4.4, och för att skapa översiktstabeller och diagram. Klicka på de olika bladen i kalkylbladsfilen för att notera informationen i varje blad.
      1. Observera att varje rad motsvarar ett experiment i översiktsbladet. Längs en översikt över parametrar (t.ex.start- och sluttemperatur), observera de beräknade värdena för T_m och spridningsuppkomst (se 5.1 ovan för namn och förklaring och kompletterande filer 1 och 2 till exempel). När programvaran beräknar två eller flera T_m-värden (böjningspunkt #1 och #2 för ratio) för vissa exempel, titta på smältövergångskurvan för att avgöra vilket av T_m-värdena som är korrekt.
      2. I kvotbladet bör du notera att varje kolumn motsvarar ett prov och att varje rad till data läses upp vid varje temperatursteg. Observera fluorescensräkningsvärdena som motsvarar varje temperatursteg och använd dem för att rita smältkurvorna för specifika prover och plotta temperaturkolonnen mot fluorescensräkningskolonnen. Observera att uppgifterna i ratio (första derivatet), 330 nm, 330 nm (första derivatet), 350 nm, 350 nm (första derivatet) används för att beräkna förhållandet och dess första derivat (som har ett maximum vid maximal förändringshastighet) i liknande format.
      3. Observera liknande data för spridning i spridningsbladet. Generera spridningskurvan för varje prov genom att rita temperaturkolonnen mot spridningskolumnen. Leta efter bladet efter det spridande första derivatet.
3. Skapa och validera en global översikt för alla fragment
   1. När du har verifierat rätt T_m-värden för fragmenten kombinerar du kolumnerna Exempel-ID och böjningspunkt på 330/350 nm-förhållande (T_m)från alla körningar i en enda ny resultatfil och kopierar dessa kolumner från varje körning.
   2. Använd det genomsnittliga T_m-värdet för det ursprungliga proteinet (vanligtvis beräknat över tio körningar) och subtrahera det från T_m-värdena för varje prov för att få ΔT_m. Sortera resultaten över ΔT_{m i} fallande ordning för att identifiera de prover som resulterar i den största förskjutningen.
   3. Dela upp fragmenten i lagerplatser beroende på ΔT_m-skiftet och generera en frekvenstabell för hela biblioteket genom att rita ΔT_m för varje behållare mot antalet fragment (figur 5). För enkelhetens skull visar du axeln som representerar antalet fragment i loggskalan. Släng provet med ΔT_m ±1 och anpassa de andra facken till varje körning för att justera antalet avvikande värden empiriskt.

Representative Results

En helskärm av DSi-Poised biblioteket (768 fragment) utfördes på tre proteiner av medicinskt intresse, nämligen den yttre kinetochore starkt uttryckt i cancer 1 protein (Hec1, eller Ndc80), den regulatoriska tetraricopeptide upprepa (TPR) domänen för monopolar spindelkinas 1 (Mps1), och SARS-CoV-2 3C-liknande proteas, Nsp5, som klyver av C-terminus av replika polyprotein på 11 platser. De buffertförhållanden som valts för varje protein, liksom proteinkoncentrationen och T_m av proteinerna, visas i kompletterande tabell S4.

Figur 5:Frekvensfördelning av skiftet i smälttemperatur (ΔT_m)för de tre proteinerna Hec1, Mps1 och Nsp5, som presenteras i denna studie som representativa resultat. Förkortningar: Hec1 = Högt uttryckt i cancer 1 protein; Mps1 = monopolspindelkinas 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-liknande proteas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Resultaten av de tre screenings som använder det protokoll som beskrivs ovan, som visas som frekvensfördelningen av förändringen i T_m jämfört med antalet fragment, visas i figur 5. Dessa områden har genererats enligt beskrivningen i avsnitt 5.3 i protokollet, med en plottning av frekvensen av den observerade förändringen i T_m. Skiftets betydelse måste definieras på ett subjektivt sätt för varje en annan projekt, enligt beskrivningen i diskussionsavsnittet nedan. Negativa värden indikerar en minskning av smälttemperaturen i närvaro av ett fragment, ett positivt värde en ökning av T_m. Från sådana tomter är det lätt att observera att för Nsp5 har alla fragment en destabiliserande effekt, medan för Hec1 och Mps1 observeras både stabiliserande och destabiliserande träffar. Detta kan förväntas och kommer att diskuteras.

Discussion

Detta protokoll beskriver en medelhög till hög data flödes metod för screening fragment bibliotek med hjälp av några vanliga robotik och mät instrument. Skärmar som de som beskrivs i detta protokoll kan rutinmässigt utföras av NKI Protein Facility i Amsterdam, till exempel som en iNEXT-Discovery-tjänst, ofta även gratis för användare efter förslagsapplikation och peer review. I sådana fall kan DSi-Poised-biblioteket tillhandahållas av anläggningen, men användningen av andra bibliotek kan också diskuteras inom ramen för varje annat användarapplikations- och serviceavtal. Valet av instrument i detta protokoll utgör praktiska lösningar för många laboratorier, men bör inte betraktas som en guldstandard. Etikettfria metoder rekommenderas för att mäta målproteinets termiska stabilitet för fragmentscreening, snarare än metoder som använder miljökänsliga etiketter för att upptäcka utfällning i en termocyklist med omvänd transkription av polymeraskedjans reaktionstermomcyklist.

Etikettfria metoder, som den som presenteras här med Prometheus-instrumentet, har vissa fördelar: de använder låga mängder protein, ofta ett par storleksordningar mindre; De kan användas för att samtidigt mäta spridningen av provet och därmed aggregering. och etiketterna som används för att upptäcka utfällning i andra metoder kan interagera olika med varje fragment, vilket resulterar i mätartefakter. Detta protokoll har beskrivits i samband med Mosquito robot, vilket gör det möjligt att pipetting av en mycket liten volym prov (0,3 μL) som inte kan göras manuellt. Myggan är en populär robot, närvarande i många laboratorier som arbetar med strukturbiologi och läkemedelsupptäcktsprojekt; Protokollet kan dock tydligt använda alternativa metoder för pipetting med låg volym.

Fragmentbibliotek innehåller föreningar upplösta i DMSO. En av de första utmaningarna är att hitta den optimala DMSO-koncentrationen där proteinet förblir stabilt, och föreningarna förblir lösliga. Det handlar om att utföra mätningarna vid olika DMSO-koncentrationer för att bestämma de optimala förutsättningarna för screening. Proteinet till fragment utspädning som används här resulterar i DMSO koncentrationer på 0,2%; de flesta proteiner är ganska stabila under dessa förhållanden. Den mängd protein som krävs för att utföra screeningen för biblioteket med 768 föreningar är totalt ~2-3 mg, eftersom mätningarna vanligtvis utförs vid låga proteinkoncentrationer (0,2 mg mL^-1). Att arbeta med så relativt låga proteinkoncentrationer minskar inte bara proteinproduktionskostnaderna, utan minskar också risken för proteinutfällning. Den låga proteinkoncentrationen påverkar inte detektion av fragmentbindning, eftersom koncentrationen av fragmenten i experimentet är ~ 2 mM, vilket gör det möjligt att identifiera även svaga bindemedel.

Eftersom den smältande övergångsdetekteringen i dessa experiment är baserad på fluorescensintensitet, är en kritisk aspekt att bestämma excitationskraften hos lasern för att utföra mätningarna. Interaktionen mellan föreningarna och proteinet kan (i) inte ha någon effekt på dess inneboende fluorescens, ii) resultera i släckning, eller iii) öka dess inneboende fluorescens. Utöver detta innebär arbete med låga proteinkoncentrationer att fluorescensantalet för det inhemska proteinet skulle vara lågt. Excitationseffekten måste därför justeras på ett sådant sätt att de flesta proverna kan mätas. Spridningsprofilen för varje körning ger viktig information om aggregeringseffekterna som kan utlösas av tillägg av fragment. Dessutom kan effekten av temperaturen på sammansatt löslighet också ses på spridningsprofilen.

Oväntat, för många föreningar observerades att spridningen faktiskt minskade med ökande temperatur (Figur 6). Det är därför viktigt att titta på både smältningskurvan och den medföljande spridningsprofilen för att bestämma tillförlitligheten hos varje experiment, särskilt för de fragment som anses vara kandidater för mer krävande mätningar genom röntgenkristallografi eller NMR-spektroskopi, eller till och med betraktas som träffar för uppföljningskemi. En specifik begränsning av metoden för fragmentscreeningsändamål är att många fragment i DSi-Poised-biblioteket har betydande inneboende fluorescens, ibland till och med över detektorns mättnadsgräns, och därför kan dessa inte avskärmas ordentligt för målbindning även vid låg excitationseffekt. En annan punkt att notera för denna metod är att den endast kan användas med proteiner som innehåller tryptofanrester.

Figur 6:Temperatureffekt på föreningslöslighet. Smältningskurva och spridningsprofil för Hec1 med två olika föreningar. A)Spridningsprofilen visar att lösligheten inte påverkas av temperaturen för detta prov. B)Spridningsprofilen visar att lösligheten hos detta prov ökar med ökande temperatur. Smältningskurvan i detta fall är därför inte tillförlitlig. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

En öppen fråga är vad som bör betraktas som en betydande förändring i T_m, inte ur ett matematiskt perspektiv, men ur praktisk synvinkel: vilken förändring i T_{m är} viktig att betrakta som ett tecken på bindning av en ligand till ett protein? I dessa exempel ses skift på mindre än 1 °C för 74% av fragmenten för bindning Av Hec1, 66% för Mps1 och 53% för Nsp5. Att betrakta 1 °C som "betydande förändring" skulle knappast ge träffar som är värda att fullfölja genom uppföljande kemi. I översiktsdiagrammen (figur 5) beaktades lagerplatser på 1, 2, 5 eller mer än 5 grader t_m skift, antingen positiva eller negativa. Detta kräver ändringar enligt varje enskilt fall för att ge en bra översikt och för att möjliggöra välgrundat beslutsfattande, bestämma nästa steg. För vissa proteiner observerades både stabilisering och avstabilisering av målet beroende på de fragment som övervägdes. Båda händelserna är intressanta, eftersom båda kan vara resultatet av fragmentbindning, och båda kan leda till en bra uppföljningsmolekyl för att manipulera proteinbeteende.

En sista fråga kvarstår, nämligen "vad definierar en användbar hit?". Svaret beror i själva verket på den specifika situationen. Till exempel, för Hec1, alla fragment som stabiliserar proteinet med mer än 2 grader eller destabiliserar det med mer än 5 kommunicerades till våra kemi kollaboratörer, som designade nya molekyler baserat på dessa träffar. För Nsp5 kommunicerades dock de mest decentraliserande träffarna till våra NMR-medarbetare för att bekräfta de nanoDSF-härledda träffarna med NMR-experiment. Med andra ord bör de screeningresultat som erhålls från detta protokoll analyseras med försiktighet och på ett sammanhangsberoende sätt och fatta välgrundade beslut baserade på den specifika frågan och den omgivande metoden. I vilket fall som helst är den metod som beskrivs här ett kompletterande tillvägagångssätt för befintliga metoder som röntgen och NMR-baserad screening, som kan syfta till att bekräfta, prioritera eller ge nya idéer för kemikampanjer.

Kompletterande tabell S1: Förteckning över buffertar som används för screening av proteiner. Förkortningar: HEPES = 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butanesulfonsyra. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell S2: Egenskaper för MRC 2-brunnsplatta för användning med nanodispenserrobot. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell S3: Egenskaper för 96-brunns V-bottenplatta för användning med nanodispenserrobot. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell S4: Bufferten, proteinkoncentrationen och T m_av de proteiner som diskuteras i representativa resultat. Förkortningar: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Starkt uttryckt i cancer 1 protein; Mps1 = monopolspindelkinas 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-liknande proteas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande fil 1: Översiktsparametrar-exempeldata. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: T_{m och} ΔT_m värden för 406 fragment-exempel data. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions		adhesive sealing film for protein plate
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape	CORNING		adhesive sealing film for fragment plate
DSi poised library	Enamine		Fragment library containing 768 compounds used in this study
Elisa Reagent Reservior	ThermoFisher Scientific	15075	Reagent reservior used for pipetting the protein
Greiner round (U) bottom plates		Cat. No. 650201	Fragments supplied in these plates
Mosquito type X1	sptlabtech	Part nr- 3019-0003	Nanolitre dispenser
MRC 2-well crystallization plate		MRC96T-PS
Pierce ELISA Reagent Reservoirs	Pierce
Prometheus High Sensitivity capillaries	Catalog PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF	Nanotemper	Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)	nanoDSF and light back scattering
Prometheus Standard capillary type	Catalog PR-C002
TX-1000	Thermoscientific	Centrifuge for plates