Övervakning av förändringar i smälttemperaturen hos ett målprotein (dvs.termisk skiftanalys, TSA) är en effektiv metod för screening av fragmentbibliotek av några hundra föreningar. Vi presenterar ett TSA-protokoll som implementerar robotassisterad nanodistansskanningsfluormetri (nano-DSF) för övervakning av inneboende tryptofanfluorescens och ljus ryggspridning för fragmentscreening.
TSA-analyser undersöker hur smälttemperaturen (Tm)för ett målprotein förändras som svar på förändringar i dess miljö (t.ex.buffertsammansättning). Nyttan av TSA, och särskilt nanodioxid scanning fluormetri (nano-DSF), har fastställts under åren, både för att hitta villkor som hjälper till att stabilisera ett visst protein och för att titta på ligand bindande genom att övervaka förändringar i den uppenbara Tm. Detta dokument presenterar en effektiv screening av Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragmentbibliotek (768 föreningar) med hjälp av nano-DSF, övervakning Tm för att identifiera potentiell fragmentbindning. Förutsättningarna för proteinkvalitet och koncentration för att utföra nano-DSF-experiment beskrivs kortfattat följt av ett steg-för-steg-protokoll som använder en nanoliters robotdispenser som vanligtvis används i strukturbiologiska laboratorier för att förbereda de nödvändiga proverna i 96-brunnsplattor. Protokollet beskriver hur reagensblandningarna överförs till de kapillärer som behövs för nano-DSF-mätningar. Dessutom ger detta dokument protokoll för att mäta termisk denaturering (övervakning av inneboende tryptofan fluorescens) och aggregering (övervakning av ljus ryggspridning) och efterföljande steg för dataöverföring och analys. Slutligen diskuteras screeningexperiment med tre olika proteinmål för att illustrera användningen av denna procedur i samband med blyupptäcktskampanjer. Den övergripande principen för den beskrivna metoden kan enkelt överföras till andra fragmentbibliotek eller anpassas till andra instrument.
Läkemedelsupptäcktsprogram börjar ofta med att undersöka kemiska föreningar för deras förmåga att interagera med och / eller ändra funktionen hos läkemedelsmål, oftast proteiner. De så kallade “hits” som finns i sådana skärmar lägger grunden för upptäckten av nya leads och utvecklingskandidater, och för de flesta av de nya läkemedel som licensieras idag. Tillgången till metoder med hög genomströmning är därför oumbärlig för att screena ett enormt antal tillgängliga mål med ett stort antal olika föreningar för att snabbt identifiera deras snäva bindning eller deras förmåga att modulera en specifik funktion av målet. När träffar har identifierats skjuts de mest lovande hit-target-kombinationerna in i en omfattande läkemedelsutvecklingspipeline med hjälp av andra, ofta dyra och tidskrävande tekniker, för att förstå “strukturaktivitetsrelationer” (SAR).
Strukturella biologimetoder, såsom de som erbjuds av de EU-finansierade tillträdesprogrammen “Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research” (iNEXT) och dess nuvarande efterträdare iNEXT-Discovery, används ofta för att studera interaktionerna mellan många föreningar i extrem detalj samtidigt som affiniteten och farmakologiska egenskaperna hos de första träffarna förbättras av vanligtvis flera omgångar syntetiskkemi 1. Blyföreningar som kommer från dessa “från hit till lead”-kampanjer blir utvecklingskandidater och går in i prekliniska studier. Den välutvecklade molekylära screeningmetoden kan grovt kategoriseras i två metoder, nämligen den ligand-baserade blyupptäckten (LBLD) och fragmentbaserad blyupptäckt (FBLD). I LBLD-kampanjer screenas proteinreceptorer med antingen några tusen handplockade ligander (baserat på strukturen hos naturliga ligander eller målets struktur), eller med många tiotusentals föreningar i drogliknande ligandbibliotek som täcker en stor del av kemiskt utrymme.
Vanligtvis testas föreningarna för sin hämmande aktivitet i en aktivitetsanalys, vanligtvis övervaka en enzymatisk funktion. I FBLD-kampanjer2,3,4,5, dock testas några hundratals föreningar som vanligtvis är mindre än droger (100-200 Dalton) för deras förmåga att binda målet direkt, utan användning av en aktivitetsanalys. Denna bindning kan störa målaktiviteten och kan mätas med många biofysiska metoder som rapporterar direkt om fragmentens förmåga att binda till målet, eller med strukturella metoder som röntgenkristallografi6 och kärnmagnetisk resonansspektroskopi7, och mer nyligen också kryoelektronmikroskopi. När fragment binder på olika platser som ligger nära varandra på proteinet kan de olika, vanligtvis låg affinitetsbindningsfragmenten kombineras rationellt kemiskt för att skapa en liten uppsättning leads som kan studeras mer detaljerat. Detta resulterar ofta i högre affinitet, mer potenta föreningar, och denna metodik har börjat ge viktiga molekyler med klinisk potential. Valet av ett “idealiskt” fragmentbibliotek som utnyttjar kemiska grupper effektivt har varit ett aktivt forskningsområde i många år8,9,10.
Medan den ursprungliga betoningen låg på att täcka fullt kemiskt utrymme, var efterföljande uppmärksamhet inriktad på att möjliggöra den nedströms kemiska kombinationen av fragmentträffar för att producera blyföreningar. Sådan forskning har lett till de så kallade “poised” biblioteken. Dessa innehåller fragment med minst en funktionell grupp som möjliggör snabb, billig uppföljande syntetisk kemi för effektiva framsteg i studier av sar. En av de aktiviteter som katalyserades av iNEXT var att uppdatera det färdiga biblioteket som utvecklats av forskare i Diamond Light Source och Structural Genomics Consortium. Denna kombinerade insats resulterade i DSi-Poised-biblioteket11, som också har validerats inom iNEXT12. Senare var detta bibliotek anpassat till tillgången på föreningar i REAL Database of Enamine Ltd., en kemisk forskningsorganisation och producent av stora samlingar av byggstenar och sammansatta bibliotek för screening. DSi-Poised är nu tillgängligt för alla att köpa, men finns även i många iNEXT-Discovery-partnerlaboratorier för fragmentscreeningsprojekt som stöds.
Den avancerade röntgenkristallografin och NMR-strukturbiologitekniken har båda sina fördelar och nackdelar för FBLD. Båda kräver isolerade målprover och ger de högupplösta atomdetaljer som krävs för FBLD. Kristaller är dock nödvändiga för röntgenkristallografi, och fragmenten binder till håligheter i de välbeställda proteinregionerna som inte är involverade i byggandet av det tredimensionella kristallgitteret. Lösning NMR ger ofta olika träffar från röntgenkristallografi, eftersom den inte påverkas av kristallmiljön och är bra på att upptäcka bindning även i delvis beställda proteinregioner. Men även om ligand-baserade NMR-experiment är relativt snabba, kräver de fortfarande en betydande mängd tid och material och kan rutinmässigt endast göras för relativt små proteinmål eller domäner. För att prioritera föreningar för kristallografiska eller NMR-experiment har biofysiska metoder använts13,14,15.
Eftersom de senaste instrumenterings- och beräkningsprotokollen möjliggör effektiv kristallografisk screening för FBLD genom att bestämma strukturer och analysera ~ 1 000 fragment mycket effektivt, har denna prioritering blivit mindre väsentlig i röntgenbaserad forskning. För NMR är det dock fortfarande önskvärt att använda billigare och snabbare experiment för att prioritera biblioteksscreening och spara instrumenttid på den avancerade utrustningen. Samtidigt kan användning av en kombination av i huvudsak olika tekniker ge oberoende bekräftelse av bindande händelser, eller till och med ytterligare träffar som inte plockas upp genom att endast använda kristallografin eller NMR-metoden. Kristallografiska och NMR-tekniker kräver båda mycket dyr utrustning och kan ofta endast göras i dedikerade externa anläggningar med hjälp av lokala, mycket skickliga experter. Dessutom kräver en korrekt resultatanalys också hög kompetens. Medan program som iNEXT och iNEXT-Discovery demokratiserar tillgången till sådanaanläggningar 16, har det erkänts att billig, snabb och hög genomströmning FBLD screening med andra metoder kan uppmuntra drogscreeningsprogram i ett mycket bredare utbud av laboratorier. Sådana resultat kan sedan användas som en indikation för att bygga samarbeten med medicinska kemister och för att prioritera de dyraste screeningexperimenten till de mest lovande föreningarna om NMR- och kristallografianläggningar inför begränsningar för antalet föreningar som kan screenas.
TSA bildar en snabb, effektiv och relativt billig och tillgänglig biofysisk metod17 som kan användas för FBLD-screening. Det har använts i flera inställningar, från att hjälpa till att hitta stabila proteinförhållanden för kristalliseringsförsök18, till att hitta föreningar som binder till specifika mål icellerna 19. TSA har också använts för att mäta dissociationskonstanterna för ligands bindande målproteiner, eftersom ligandbindning ofta leder till förändringar i termisk stabilitet. I alla TSAs mäts förändringen i denatureringstemperaturen hos ett protein (dess stabilitet) som en funktion av en långsam temperaturökning. Ett effektivt sätt att följa proteindenaturering vid uppvärmning är av DSF eller Thermofluor, som kvantifierar fluorescenssläckande av ett hydrofobiskt färgämne (vanligtvis Sypro Orange) vid interaktion med exponerade hydrofobiska proteinregioner som utvecklas på grund av temperaturökning.
Nano-DSF hänvisar vanligtvis till mätning av proteinens termiska stabilitet i avsaknad av yttre färgämnen. Ett av de första instrumenten som erbjöd denna möjlighet var OPTIM1000 som mäter ett brett spektrum av ljusintensitet och ljusspridning av ett prov. Denna maskin tillät samtidig mätning av protein som utvecklas (vanligtvis efter tryptofanfluorescens) och proteinaggregering (som bildade nanopartiklar resulterar i en ökning av ljusspridning vid ~ 400 nm). Senare introducerade Prometheus användningen av backreflektion för att mäta aggregering och känslig detektion av fluorescenssignalen, vilket möjliggör screening av låga proteinkoncentrationer med godkänslighet 20. I följande avsnitt beskrivs hur Prometheus användes för att demonstrera ett fragmentscreeningsprotokoll för att upptäcka träffar för olika proteinmål. En kort introduktion om förväntad proteinkvalitet och mängd följs av ett steg-för-steg-protokoll för att förbereda, utföra och analysera fragmentscreeningsexperimenten. Screeningresultat för tre proteiner har visats som exempel data som erhållits som en del av iNEXT-Discovery samarbeten.
Detta protokoll beskriver en medelhög till hög data flödes metod för screening fragment bibliotek med hjälp av några vanliga robotik och mät instrument. Skärmar som de som beskrivs i detta protokoll kan rutinmässigt utföras av NKI Protein Facility i Amsterdam, till exempel som en iNEXT-Discovery-tjänst, ofta även gratis för användare efter förslagsapplikation och peer review. I sådana fall kan DSi-Poised-biblioteket tillhandahållas av anläggningen, men användningen av andra bibliotek kan också diskuteras inom ramen för varje annat användarapplikations- och serviceavtal. Valet av instrument i detta protokoll utgör praktiska lösningar för många laboratorier, men bör inte betraktas som en guldstandard. Etikettfria metoder rekommenderas för att mäta målproteinets termiska stabilitet för fragmentscreening, snarare än metoder som använder miljökänsliga etiketter för att upptäcka utfällning i en termocyklist med omvänd transkription av polymeraskedjans reaktionstermomcyklist.
Etikettfria metoder, som den som presenteras här med Prometheus-instrumentet, har vissa fördelar: de använder låga mängder protein, ofta ett par storleksordningar mindre; De kan användas för att samtidigt mäta spridningen av provet och därmed aggregering. och etiketterna som används för att upptäcka utfällning i andra metoder kan interagera olika med varje fragment, vilket resulterar i mätartefakter. Detta protokoll har beskrivits i samband med Mosquito robot, vilket gör det möjligt att pipetting av en mycket liten volym prov (0,3 μL) som inte kan göras manuellt. Myggan är en populär robot, närvarande i många laboratorier som arbetar med strukturbiologi och läkemedelsupptäcktsprojekt; Protokollet kan dock tydligt använda alternativa metoder för pipetting med låg volym.
Fragmentbibliotek innehåller föreningar upplösta i DMSO. En av de första utmaningarna är att hitta den optimala DMSO-koncentrationen där proteinet förblir stabilt, och föreningarna förblir lösliga. Det handlar om att utföra mätningarna vid olika DMSO-koncentrationer för att bestämma de optimala förutsättningarna för screening. Proteinet till fragment utspädning som används här resulterar i DMSO koncentrationer på 0,2%; de flesta proteiner är ganska stabila under dessa förhållanden. Den mängd protein som krävs för att utföra screeningen för biblioteket med 768 föreningar är totalt ~2-3 mg, eftersom mätningarna vanligtvis utförs vid låga proteinkoncentrationer (0,2 mg mL-1). Att arbeta med så relativt låga proteinkoncentrationer minskar inte bara proteinproduktionskostnaderna, utan minskar också risken för proteinutfällning. Den låga proteinkoncentrationen påverkar inte detektion av fragmentbindning, eftersom koncentrationen av fragmenten i experimentet är ~ 2 mM, vilket gör det möjligt att identifiera även svaga bindemedel.
Eftersom den smältande övergångsdetekteringen i dessa experiment är baserad på fluorescensintensitet, är en kritisk aspekt att bestämma excitationskraften hos lasern för att utföra mätningarna. Interaktionen mellan föreningarna och proteinet kan (i) inte ha någon effekt på dess inneboende fluorescens, ii) resultera i släckning, eller iii) öka dess inneboende fluorescens. Utöver detta innebär arbete med låga proteinkoncentrationer att fluorescensantalet för det inhemska proteinet skulle vara lågt. Excitationseffekten måste därför justeras på ett sådant sätt att de flesta proverna kan mätas. Spridningsprofilen för varje körning ger viktig information om aggregeringseffekterna som kan utlösas av tillägg av fragment. Dessutom kan effekten av temperaturen på sammansatt löslighet också ses på spridningsprofilen.
Oväntat, för många föreningar observerades att spridningen faktiskt minskade med ökande temperatur (Figur 6). Det är därför viktigt att titta på både smältningskurvan och den medföljande spridningsprofilen för att bestämma tillförlitligheten hos varje experiment, särskilt för de fragment som anses vara kandidater för mer krävande mätningar genom röntgenkristallografi eller NMR-spektroskopi, eller till och med betraktas som träffar för uppföljningskemi. En specifik begränsning av metoden för fragmentscreeningsändamål är att många fragment i DSi-Poised-biblioteket har betydande inneboende fluorescens, ibland till och med över detektorns mättnadsgräns, och därför kan dessa inte avskärmas ordentligt för målbindning även vid låg excitationseffekt. En annan punkt att notera för denna metod är att den endast kan användas med proteiner som innehåller tryptofanrester.
Figur 6:Temperatureffekt på föreningslöslighet. Smältningskurva och spridningsprofil för Hec1 med två olika föreningar. A)Spridningsprofilen visar att lösligheten inte påverkas av temperaturen för detta prov. B)Spridningsprofilen visar att lösligheten hos detta prov ökar med ökande temperatur. Smältningskurvan i detta fall är därför inte tillförlitlig. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
En öppen fråga är vad som bör betraktas som en betydande förändring i Tm, inte ur ett matematiskt perspektiv, men ur praktisk synvinkel: vilken förändring i Tm är viktig att betrakta som ett tecken på bindning av en ligand till ett protein? I dessa exempel ses skift på mindre än 1 °C för 74% av fragmenten för bindning Av Hec1, 66% för Mps1 och 53% för Nsp5. Att betrakta 1 °C som “betydande förändring” skulle knappast ge träffar som är värda att fullfölja genom uppföljande kemi. I översiktsdiagrammen (figur 5) beaktades lagerplatser på 1, 2, 5 eller mer än 5 grader tm skift, antingen positiva eller negativa. Detta kräver ändringar enligt varje enskilt fall för att ge en bra översikt och för att möjliggöra välgrundat beslutsfattande, bestämma nästa steg. För vissa proteiner observerades både stabilisering och avstabilisering av målet beroende på de fragment som övervägdes. Båda händelserna är intressanta, eftersom båda kan vara resultatet av fragmentbindning, och båda kan leda till en bra uppföljningsmolekyl för att manipulera proteinbeteende.
En sista fråga kvarstår, nämligen “vad definierar en användbar hit?”. Svaret beror i själva verket på den specifika situationen. Till exempel, för Hec1, alla fragment som stabiliserar proteinet med mer än 2 grader eller destabiliserar det med mer än 5 kommunicerades till våra kemi kollaboratörer, som designade nya molekyler baserat på dessa träffar. För Nsp5 kommunicerades dock de mest decentraliserande träffarna till våra NMR-medarbetare för att bekräfta de nanoDSF-härledda träffarna med NMR-experiment. Med andra ord bör de screeningresultat som erhålls från detta protokoll analyseras med försiktighet och på ett sammanhangsberoende sätt och fatta välgrundade beslut baserade på den specifika frågan och den omgivande metoden. I vilket fall som helst är den metod som beskrivs här ett kompletterande tillvägagångssätt för befintliga metoder som röntgen och NMR-baserad screening, som kan syfta till att bekräfta, prioritera eller ge nya idéer för kemikampanjer.
Kompletterande tabell S1: Förteckning över buffertar som används för screening av proteiner. Förkortningar: HEPES = 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morpholino)butanesulfonsyra. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell S2: Egenskaper för MRC 2-brunnsplatta för användning med nanodispenserrobot. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell S3: Egenskaper för 96-brunns V-bottenplatta för användning med nanodispenserrobot. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande tabell S4: Bufferten, proteinkoncentrationen och T mav de proteiner som diskuteras i representativa resultat. Förkortningar: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Starkt uttryckt i cancer 1 protein; Mps1 = monopolspindelkinas 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C-liknande proteas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande fil 1: Översiktsparametrar–exempeldata. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Tm och ΔTm värden för 406 fragment-exempel data. Klicka här för att ladda ner den här filen.
The authors have nothing to disclose.
“Detta arbete gynnades av tillgången till NKI Protein Facility, ett Instruct-ERIC-center. Ekonomiskt stöd har tillhandahållits av iNEXT, projektnummer 653706 och iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program”.
ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates |