Summary
細胞の立体環境は、その行動、成熟および/または分化において重要な役割を果たすことができることが認められています。このプロトコルは、巨大核球に対する物理的な封じ込めおよび機械的制約の影響を研究するために設計された3次元細胞培養モデルを記述する。
Abstract
閉じ込めと機械的な制約の両方につながる3D環境は、細胞の挙動の重要な決定要因としてますます認識されています。3D培養は、 インビボ の状況によりよく近づくために開発されました。巨核球は骨髄(BM)における造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)と区別する。BMは、骨の中に閉じ込められた身体の最も柔らかい組織の一つです。骨は細胞スケールで十分に拡張できないが、巨核球は弱い剛性と高い閉じ込めを受ける。このプロトコルは、メチルセルロースからなる3D培地における免疫磁気選別と成熟した巨核球への分化によるマウス系分(Lin-)HSPCsの回復方法を提示する。メチルセルロースは巨核球に対して非反応性であり、その剛性は正常な骨髄のそれに調節されるか、または病理学的線維性骨髄を模倣するように増加することができる。さらなる細胞分析のために巨核球を回収するプロセスもプロトコルで詳述されている。プロ血小板の伸長は3Dミリュー内で防止されるが、メガ核球を液体培地で再懸濁し、プロ血小板を拡張する能力を定量化する方法を以下に説明する。3Dヒドロゲルで成長した巨核球は、液体ミリューで増殖したものに比べてプロ血小板を形成する能力が高い。この3D培養により、i)より高い成熟状態に達する巨核球に対する前駆細胞を区別することができ、ii) 生体内で 観察されるかもしれないが古典的な液体培養では気付かれないフェノタイプを再現し、iii)3D環境によって提供される機械的手がかりによって誘発される伝達経路を研究する。
Introduction
体内の細胞は複雑な3D微小環境を経験し、隣接する細胞および周囲のマトリックス1、2、3による組織からの剛性および閉じ込めを含む化学的およびメカノ物理的手掛かりとの相互作用を受ける。細胞行動の剛性と閉じ込めの重要性は、過去数十年でしか認識されていません。2006年、Englerら4の精力的な研究は、細胞分化のための機械的環境の重要性を強調した。その結果、細胞基質剛性のばらつきが、幹細胞の様々な分化系統に向かう方向を生じることを実証した。それ以来、機械的手掛かりが細胞の運命や行動に与える影響はますます認識され、研究されるようになった。それは生物の最も柔らかい組織の一つであるにもかかわらず、骨髄は骨の中に閉じ込められている3D構造組織を有する。骨髄の剛性は、技術的には正確に測定することは困難であるが、15と300 Pa5、6の間にあると推定される。間質の中で、細胞は互いにしっかりと閉じ込められている。さらに、それらのほとんどは血液循環に入るために、シヌサイド血管に向かって移動しています。これらの条件は、隣接する細胞に追加の機械的拘束を作成します, これらの力に適応する必要があります.機械的手掛かりは、巨核球分化とプロ血小板形成に対する結果が最近検討された重要なパラメータを表しています。巨核球は従来の液体培養においてインビトロで分化することができるが、それらは3D環境7からの機械的手掛かりがないこともあって、生体内で観察される成熟度に達しない。ヒドロゲルに埋め込まれた前駆物質の成長は液体ミリューに欠けている3Dの機械の手掛かりをもたらす。
ヒドロゲルは、造血前駆物質を定量化するアッセイを形成するコロニーで細胞を成長させるために、特に、血球学的分野で数十年にわたって広く使用されてきました。しかし、このようなヒドロゲルは、造血細胞の成熟および分化に対する3D機械的環境の生物学的影響を探求するためにほとんど使用されていない。ここ数年、私たちの研究室はメチルセルロースベースのヒドロゲル 8を用いた3D培養モデルを開発しました。この非反応性物理ゲルは、天然の巨核球環境の物理的制約を模倣するのに有用なツールです。これは、メトキシド基(-OCH3)によるヒドロキシル残基(-OH)の置換によりセルロースに由来する。メチル置換の程度とメチルセルロース濃度の両方が、一度ジェリ化したヒドロゲル剛性を決定します。この技術の開発段階において、30~60 Paの範囲のヤング率が、巨核球増殖に最適なゲル剛性 である9を実証した。
以下のプロトコルは、3Dメチルセルロースヒドロゲル中でマウス巨核細胞性前駆物質を成長させる方法を説明する。従来、標準的な液体培養物と比較して、このヒドロゲル培養は巨核球の多倍化の程度を増加させ、成熟および細胞内組織を改善し、そして、液体培地 9に再懸濁されたプロ血小板を拡張する巨核球の能力を増加させることが示されている。本稿では、マウス骨髄Lin-細胞の単離プロトコルと3D培養用メチルセルロースヒドロゲルへの埋め込み、プロ血小板を産生する能力の定量化、さらなる分析のための細胞回収について詳細に説明する。
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Protocol
すべての実験は、実験動物のケアと使用のための制度的ガイドラインに従って行われるべきです。ビデオに表示されるすべてのプロトコルは、欧州の法律とエタブリシゼー・デュ・サン(EFS)の審査委員会の勧告に厳密に従って行われました。このプロトコルの最初のバージョンは、もともと分子生物学の方法で2018年に公開されました 8.
注: 図 1 は、プロセス全体の概略図を示しています。このプロセスには、1)骨髄解剖、骨髄検索、および骨髄細胞の機械的単離、2)リネージネガティブ(Lin-)細胞の磁気選別、3)液体またはメチルセルロースヒドロゲルへの播種、および4)液体培地中のプロ血小板形成を検討するために3Dゲルで増殖した巨核球の再懸濁が含まれる。
1. 成虫マウスからの骨採取
注: このセクションでは、微生物汚染を最小限に抑えることが重要です。
- ペニシリン・レンサプトマイシン・グルタミン(PSG)抗生物質混合(ペニシリン10000 U/mL、ストレプトマイシン100000μg/mLおよびL-グルタミン29mg)の総量の1%を含むDulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)で骨採取用15mLチューブを調製します。
注:使用されたすべてのマウスが同じ遺伝子型を有する場合は、1 mLのDMEMを含む同じチューブ内のすべての骨をプールする - マウス数あたり1%のPSG。抗生物質は、骨採取の間に起こりうる細菌増殖を防ぐために重要である。 - 50 mLチューブに、骨消毒用のエタノール70%、手順中にリンス器具用のチューブを充填します。滅菌解剖器を使用してください。
- イオブルラン吸入(4%)を用いてマウスを麻酔し、マウスを安楽死させるために子宮頸部脱臼に迅速に進む。急速に70%エタノールに体を浸し、微生物汚染を防ぎます。
- 迅速に脛骨と大腿骨を解剖します。
- メスを使用して、脛骨の足首側端の骨端と大腿骨の股側端の骨端を切り取る。
- 骨を70%エタノールに1秒間浸し、1%PSGを含むDMEM培地に浸漬します。
2. 骨髄解離とLin細胞の分離
注: プロトコルのこの部分は、層流フードの下で実行されます。1つの培養物では、すべての井戸は同じ実験の一部であり、独立した生物学的複製とは考えられません。すべてのマウスの細胞を一緒にプールして、すべてのウェルの均質性を確保し、個人間の変動を排除しながら互いに比較することができます。独立した生物学的複製の場合、培養を繰り返さなければならない。
- ペトリ皿に骨を入れ、潜在的な汚染物質を除去するために無菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で2回上昇させる。
- DMEM - 50 mLチューブに1%PSGを準備します。
注:実験に使用したマウスあたり1%のDMEM - 1%PSGの2 mLを提供してください。 - DMEM - 1% PSGで21ゲージの針を装備した5 mLの注射器を充填します。
- 鉗子で骨を保持し、膝側端に針のベベルのみを導入する。
注:膝側の骨端は解剖からそのまま残り、針を挿入するために中央に小さな空洞を残す必要があります。残りの骨端は、紅潮時に針に付着した骨を維持する。骨のベベル以上のものを押し付けて骨髄を損傷する可能性があるため、注意してください。 - 注射器プランジャーを素早く押し込み、骨髄を50 mLチューブに流します。
注:スプラッシュを回避し、骨髄のフラッシュと解放を容易にするために、チューブ壁の骨の自由な端を配置し、DMEM - 1%PSGに浸漬。実際には、500 μLと1 mLの間の体積は、一般的に骨から骨髄を排出するのに十分です。骨髄が完全に追放されると、骨は白くなっています。骨髄が残りの赤い色で判断したように、糖尿病から完全に排出されていない場合には、新鮮な媒体でフラッシュを繰り返す事が可能である。 - 手順 2.4 を繰り返します。および 2.5.すべての骨のために、DMEMで5 mLのシリンジを補充する - 必要に応じて1%PSG。
- 21ゲージ針と同じ5 mLシリンジを使用して、紅潮した骨髄を含む培地の総体積を10mLの丸底のチューブに移します。
注:丸底の10 mLチューブに切り替える必要はありませんが、次の解離手順に進むのが簡単です。汚染の危険性が疑われる場合は、注射器および/または針を変更することを躊躇しないでください。 - 培地細胞と骨髄細胞を21ゲージ針を通して2回、23ゲージを通して3回、25ゲージの針を通して1回連続して発汗して細胞解離に進みます。
注意:気泡は細胞にとって有害である可能性があるため、気泡を避けてください。 - サスペンションを15 mLチューブに移します。
- 細胞数を測定し、死んだ細胞を除外するトリパンブルーの存在下で手動カウントのための自動化されたセルカウンターまたは細胞チャンバーを使用して生存率を確認する。
- 遠心分離器 15 mL チューブを 300 x gで 7 分間1 mLの移管ピペットを使用して、慎重にピペットアウトし、上清を捨てます。
- マウス造血細胞分離キットを用いて、陰性免疫磁気選別により幹細胞および前駆細胞を分離します。
注:この細胞分類の目的は、すべての選択抗体(CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7-4)に対して陰性である細胞を取り出し、メガカルビティクス以外の分化系統に既に関与している細胞を排除することです。 - キットの指示に従い、作製したてのM培地(牛血清(FBS)の最終容積の2%を持つPBS)を1×108細胞/mLの濃度に再懸濁し、5mLのポリスチレンチューブをラウンドボトムで懸濁液を最大体積2mLに分配する。
- ポリスチレンチューブに加える:50 μL/mLの濃度の正常ラット血清とビオチン化抗体ミックス(CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7-4)の濃度でmL当たり50μLの濃度で、穏やかにフリックしてホモゲン化します。
注:これらの抗体は、巨核球状経路以外の分化経路に既に関与している細胞に結合します。 - 氷上のチューブを15分間インキュベートします。
- ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズを75 μL/mLの濃度で加え、チューブを軽くフリックして均質化します。
- 再び氷の上で10分間インキュベートします。
- 必要に応じて、M培地付きチューブあたり2.5 mLの最終体積に調整します。
- キャップを付けずに磁石の中にチューブを置く直前にチューブを軽くフリックして、サスペンションを均質化し、3分間待ちます。
注:すでに分化経路に関与し、磁気ビーズでコーティングされた細胞は、磁石の内側のチューブの壁に保持されます。 - 反転マグネットとチューブは、新しいラウンドボトム5 mLポリスチレンチューブにチューブの内容を転送します。
注:転送のために磁石からチューブを取り出さないで下さいます。それは、チューブを入れ、磁石を反転させることによって行われます。安定した動きを使用し、チューブを振らないでください。 - 望ましくない磁気標識セルを含む最初のチューブを捨て、キャップなしで新しいチューブを磁石に3分間入れます。
- ステップ2.20の通り、分離されたLin-細胞を新しい15 mLのチューブに移します。
注:いくつかの5 mLポリスチレンチューブが前のステップに使用されている場合は、同じ15 mLチューブ内のすべてのセルをプールします。細胞選別後に回収された細胞は造血幹細胞と前駆細胞である。巨核代 10の主要な生理学的調節因子であるトロンボポエチン(TPO)の存在は、細胞分化を巨核球系に向けて向かうだろう。 - Lin-セルの数と実行可能性をステップ 2.10 のように測定します。
- 1 x 106 生存細胞xウェルナンバーを持つために遠心分離機に細胞懸濁液の必要量を計算し、ウェルナンバーは条件ごとに播種する井戸の数である。
- 適切な量の細胞懸濁液と遠心分離機を300 x g で条件ごとに1本準備し、7分間準備します。
- 液体培養液の場合は、上清を捨て、完全な培養培地(DMEM、PSG 1%の最終体積、FBS 10%の最終体積、ヒルディン100 U/mL、TPO 50 ng/mL)で細胞ペレットを再懸濁し、2×106個の生存細胞/mL(500μL当たり10×6細胞に相当)の最終濃度を達成する。5%CO2以下で37°Cで細胞をインキュベートする。(= カルチャの 0 日目)
注: メチルセルロースの培養例として次の段落を参照してください。 1ウェル用の完全な培養培地を調製するには、DMEMの435 μL、10%最終時に100%FBSの50μL、1%ファイナルの100%PSGの5μL、100 U/mL最終時の100 U/mLの5μL、5μLの5μLを50ng/mL/mL Lで使用します。4ウェルまたは24ウェル培養プレートは、通常、その直径が井戸あたり必要な500 μLに適しているので使用されます。
3. メチルセルロースヒドロゲル中の細胞埋め込み
注:以下のプロトコルは、ヒドロゲル細胞培養の単一のウェルを得る方法を記述し、必要なウェルの数に適応することに注意してください。
- 室温で3%メチルセルロースストック溶液の1 mLアリコートを解凍します。シリンジコーティング用のメチルセルロースの別々の余分なアリコートを準備します。
注:3%の濃度で、メチルセルロースは室温(20〜25°C)で液体のままです。 - 1mLルアーロックシリンジにメチルセルロースを装備した18ゲージの針をコーティングし、余分なアリコートから1mLのメチルセルロースを引き出します。メチルセルロースを完全に排出する。
注:このコーティングステップはステップ3.3で集められたメチルセルロースの容積が正確であることを保障する。 - 同じ注射器と針を用いて、新しいメチルセルロースアリコートを使用して、メチルセルロースの適切な体積を描画する(図2A)。
注:ウェルあたり500 μLの最終体積で2%メチルセルロースの最終濃度を達成するには、3%メチルセルロースの333 μLが必要です。 - 慎重に針を取り除きます.滅菌された鉗子を使用して、シリンジの端にLuerロックコネクタをねじ込みます(図2B-C)。
- 2つのシリンジを接続するために、2番目のコーティングされていない1 mLルアーロックシリンジをLuerロックコネクタに取り付けます(図2D)。
注:この2番目の注射器をコーティングする必要はありません。 - 2つのシリンジ(図2E)の間にメチルセルロースの体積を均等に分配し、ステップ3.11まで脇に置きます。
- 濃縮DMEM培地を調製し、最終的なメチルセルロース容量(ステップ3.11)に各化合物に対する液体培養液の1つと同じ濃度(最終容積のPSG1%、最終体積のFBS10%、ヒルディン100 U/mL、TPO50ng/mL)を得る。
- 167 μLの濃縮培養培地を1個の×106細胞の最終ウェルごとに調製します。この培地の体積は、2%のメチルセルロース濃度を最終的に得るように計算される。ウェルの総容積は500 μL(メチルセルロースの濃縮培地中の細胞懸濁液の167 μL+ 333 μL)であり、すべての成分は液体ウェル内の濃度と同じ濃度になります。
- 例として、1つのウェルに完全な培養培地を調製するには、DMEMの102 μL、10%最終時に100%FBSの50μL、1%ファイナルの場合は100%のPSGの5μL、100 U/mL最終時の5μL、5μLの5μL 5μLを使用します。細胞の再懸濁に使用される167 μLの体積を与え、メチルセルロースの333 μLを添加すると最終容積は500 μLになります。
- 遠心分離ステップ2.26を完了した後、上清を捨て、濃縮培養培地中の細胞ペレットを167μLあたり1×106細胞の比率で再懸濁する。
- スポイジを取り戻し、コネクタから 1 つを取り外します。
- ピペット167μLの細胞懸濁液。
- セルの懸濁液をシリンジコネクタ(図2F)に直接追加し、気泡を導入しないようにします。
注:セルサスペンションを追加しながら、ゆっくりと同時にシリンジプランジャーを引き出し、セルサスペンション用のスペースを解放します。 - ねじの懸濁液をなくさずに、2つのシリンジ(図2G)を慎重に再接続します。
注:再接続する前に、コネクタを半分空のままにするためにプランジャーを引き、サスペンションがあふれ出さずに2番目のシリンジが接続するのに十分なスペースを持たせてください。 - メチルセルロース培地を、2つのシリンジ間の10回のプランジャーの動きで細胞懸濁液でゆっくりと均質化する(図2H)。
- 合計ボリュームを 1 つのシリンジに引き込み、2 つのシリンジを取り外して、コネクタを空のシリンジに残します。
- 4ウェルプレートのウェルに注射器の内容を空にする(図2I)。
- 37°Cの5%CO2(=0日目の培養)で細胞をインキュベートします。
注:1組のシリンジを用いて2つのメチルセルロースウェルを準備することができます。メチルセルロースの体積を2倍にし、細胞懸濁液の体積を2x106細胞とした。ステップ 3.13 を完了した後。2つのシリンジの間でボリュームを均等に分配し、それぞれに500 μLを持つ。それらを取り外し、カルチャのコネクタがないものを空にします。スポイトを再接続して、コネクタを保持していたものから他の側にボリュームを転送します。500 μL のシリンジを取り外し、コネクタを取り付けてはいけないもので、細胞を第 2 の培養井戸に播種します。3%メチルセルロースは、濃縮細胞がDMEMで懸濁されている間、アイズコーブの修飾ダルベッコ培地(IMDM)のストック溶液として購入されます。比較テストは、この混合培地が実験の結果に影響を与えないようにするために最初に行われてきました, 特に100%DMEMの液体培養と比較して.
プロ血小板分析のための細胞再懸濁液
注:プロメトレットを形成する能力の分析は、液体とメチルセルロースの成長巨核球との同等の条件下で行われなくてはなってしまいます。メチルセルロースヒドロゲルによって発揮される物理的制約は、プロ血小板拡張を阻害する。したがって、メチルセルロース成長細胞は、培養3日目に新鮮な液体培地中に再懸濁され、プロ血小板を伸ばすことができます。メチルセルロースヒドロゲルは、液体培地添加時に容易に希釈される物理的なヒドロゲルです。重要なことに、再懸濁および遠心分離からのアーチファクトを避けるために、対照液培地状態の細胞はメチルセルロース成長細胞と同じ方法で同時に処理されなければならない。実験の概略表現を参照してください(図1)。
- DMEMの10 mLを準備する - 1%PSGは、各井戸が再中断するために15 mLチューブで37 °Cで予熱します。
- 慎重にDMEMの10 mLの各ウェルから細胞を再懸濁 - 1%PSG。
注:メチルセルロースを完全に希釈するために、いくつかの上下の動きを穏やかに行います。液体井戸のために井戸の底に堆積したすべての細胞を収集することを確認してください。 - チューブを5分で300×gで遠心分離する。
- 一方、完全な培養培地(DMEM、最終容積のPSG1%、最終容積のFBS10%、ヒルディン100 U/mL、TPO 50 ng/mL)を準備します。
注:このステップでは、各ウェルを半分に希釈するために回収され、したがって、ウェルごとに完全な培養培地の1 mLを調製する。 - 上清を捨て、各チューブの培地1mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 4または24ウェルプレートでウェルあたり500 μLの細胞懸濁液を再シードし、37°Cで5%CO2以下でインキュベートします。
注:1つの初期井戸から、重複するプロメトレットの視覚化のための2つのウェルを得る。これらの重複は同じサンプルから発生するため、独立した複製とは見なすことができないことに注意してください。 - 再播種後24時間、培養4日目に、明視野顕微鏡と20×目的を用いてウェルあたり10枚の画像をランダムに取得する。
注: セルはウェルの中心にグループ化される傾向があり、プロマテレットの視覚化と定量が困難になる可能性があるため、フィールド上にセルが多すぎないようにしてください。フィールドごとに少なくとも5メガ核球を捕獲することを確認してください。 - 各画像に原血小板を伸ばす巨核球と巨核球の総数を数え、プロ血小板を伸ばす巨核球の割合を計算する。
注: 定量は自動化されていません。セルカウントを手動で実行します。カウントは、それらをカウントとしてマークするために、セルをクリックするためにImageJのセルカウンタプラグインを使用することによって容易にすることができます。ウェルあたり10個のフィールドを取得し、重複する井戸は、条件ごとに約150〜300メガ核球を表します。
5. 将来の分析のための細胞固定と検索
注意:このプロトコルは、保護具を着用して、ヒュームフードの下で処理しなければならない固定剤を使用しています。
注: 目的は、完全に固定されるまで、セルに適用されるゲルの拘束をそのまま維持することです。したがって、使用する固定剤に関係なく、ゲルを乱すことなく、メチルセルロースの上にウェルに添加する必要があります。同じプロトコルが液体培養に適用されます。
- ゲルを破壊することなくメチルセルロースの上に、シードボリューム(このプロトコルでは500 μL)に等しい固定液の体積を追加します。使用される固定剤に応じて適切な時間を待ちます(少なくとも10分)。
注:ゲル全体の固定拡散は、ゲルの色の急激な変化(ピンクから黄色のオレンジ色の色合い)によって明らかにされるように非常に迅速でなければなりません。パラホルムアルデヒド(DPBSでは8%、ウェルあたり500 μL)は通常免疫標識に使用され、グルタルドヘヒド(カコジレート緩衝液では5%、ウェルあたり500μL)は電子顕微鏡分析に使用されます。 - P1000ピペットを使用して、メチルセルロースを均質に希釈するように、固定剤とゲルを用いていくつかのアップダウンピペットを穏やかに行います。
- 同じピペットとチップを使用して、ウェルから10 mLのDPBSを含む15 mLチューブにすべての体積を移し、均質化します。
- 混合物を300×gで7分間遠心分離する。
注:メチルセルロースをすべて除去するために、2回目の洗浄工程が必要になる場合があります。 - 上清を捨て、目的の分析に従って適切な媒体の巨核球ペレットを再懸濁する(免疫標識、フローサイトメトリー9、電子顕微鏡.)(電子顕微鏡については、このJoVE号の「透過型電子顕微鏡を用いた巨核生物の主要なステップをその場で 探る」の論文法も参照してください。
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Representative Results
このプロトコルを使用して取得したデータは、もともと20169でブラッドに公開されました。
プロトコルによれば、細胞を液体またはメチルセルロースヒドロゲル培地に播種した。液体培地中の細胞は、硬いプラスチック表面に接触し、いつか他の細胞と接触して、ウェルの底部に沈積物を持っています。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、ゲル中で均一に分布し、隣接する細胞から単離される(図3A)。メチルセルロースゲルは、2%の最終濃度で、液体培養物(図3B)に比べて平均巨核球径を非常にわずかに増加させ、より高い報告されたプロイド9に従う。対照的に、メチルセルロース濃度を0.5%上昇すると、小さな平均直径で示されるように巨核球分化が損なわれる(図3B)。
液体培養で分化した巨核球と骨髄内 で生体内で 分化した巨核球との間には、巨核球の超構造に顕著な違いが見られる。成熟した巨核球の特徴は、複雑な細胞質膜ネットワークであるDMS(膜層)であり、将来の血小板膜のリザーバーとして機能します。成熟した巨核球では、DMSは細胞質の大部分を占める絡み合った膜シートを形成するように組織する。透過電子顕微鏡(TEM)により、細胞質領域を密接にアパポーズして表線化しているように見えます(図3C 上部パネル)(TEM手順については、論文法「透過電子顕微鏡を用いた巨核生物の主要なステップの現場探査」 を参照)。液体培養では、DMS膜は、細胞質領域を区切ることなく、小さな丸い、楕円形、または細長い小胞の外観をほとんど有する(図3C 中間パネル)。対照的に、2%メチルセルロース培養は、大部分の巨核球におけるDMSの組織を促進し、膜を密接にアパポーズし、細胞質領域を区切り、 その際 に似た(図3C 下部パネル)。この結果は、2%メチルセルロースヒドロゲル培養により、環境培地の機械的制約によるより良い巨核球分化が可能であることを示している。
3日目に液体培地に細胞を移管した後、巨核球は4時間 9後にプロ血小板を拡張し始める。 図4 は、液体ミリュー中の再懸濁後にプロ血小板を24時間延長した巨核球の割合の定量化を示す。明視野顕微鏡と20×の目的を用いて、ウェルごとに10枚の画像をランダムに取得した(図4A)。定量化は、フィジー(ImageJ)のセルカウンタプラグインを使用して、盲目的かつ手動で行われました(図4B)。これらは一次細胞培養であるため、実験間のばらつきがありますが、プロトコルは堅牢なままであり、良好な再現性を提供します。液体前培養条件では、プロ血小板の割合は10%から20%の間である必要がありますが、この割合はヒドロゲル前培養のために倍増します。
図 1.プロセス全体の概略表現。 骨は解剖され、骨髄は洗い流され、細胞は機械的に解離される。目的のステムおよび前駆細胞(Lin-細胞)は、免疫磁気陰性選別手順によって単離され、液体またはヒドロゲル培地(Day 0)のいずれかに播種される。培養3日目(合計4日間の持続時間を表す)では、両方の条件が別々の新鮮な液体培養ミリュー中に再懸濁される。この第2培養工程は、培養の3日目から4日目まで行われる。プロ血小板を拡張するMKの割合は、培養4日目で測定されます。視覚的なわかりやすくするために、ウェルごとに 1 つのセルがスキーマ化されます。青い円は、その核を紫色で示す単一の細胞を描いている。最後のステップでは、両方のMKがプロメクテで表されます。プロ血小板を形成するMKの割合は、液体またはメチルセルロース前培養によって異なる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.メチルセルロースヒドロゲルに細胞埋め込み。 シリンジの壁をあらかじめコーティングした後、 (A) メチルセルロースの適切な量を描画します。(B, C) 針を外し、コネクタをシリンジにねじ込みます。(D) コネクタの途中でメチルセルロースを押し、2番目の注射器を取り付けます。(E) 2つの注射器の間にメチルセルロースを均等に分配し、それらを切断する。(F) コネクタを支えるシリンジにセルサスペンションを追加します。(G) 2 つの注射器を再接続します。(H) 1 つのシリンジから他のシリンジに数回、全体のボリュームを押すことによって均質化します。(私は)培養皿に全容を排出することによって細胞を播種する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.培養条件による巨核球特性(A)液体中の培養3日目の巨核球(左パネル)または2%メチルセルロースヒドロゲル培地(右パネル)の代表的な画像。スケールバー= 50 μm(B)液体培地で成長した巨核球の直径の平均、または2%または2.5%メチルセルロースヒドロゲル。結果は3つの独立した培養物における平均±SDとして表され、合計で少なくとも100個の巨核球が調べられる。*,P<0.05, ***P < 0.0001, ボンフェローニの多重比較検定を用いて分散の一方向分析 (ANOVA) を使用.(アギラールら2016年のグラフ)(C)マウス巨核球の模式図(左)および代表的な電子顕微鏡画像(中央)右パネルは、白い正方形(スケールバー= 中間の電子顕微鏡画像の場合は5μm、クローズアップビューの場合は2 μm)からビューを閉じます。上部パネルは、その場巨核球、中間は液体培養中に体外で成長した巨核球を表し、下部パネルは3Dメチルセルロースヒドロゲルで増殖した巨核球である。これらのデータはもともと血液ジャーナルに掲載されました, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.プロメトレット定量の代表結果。 (A) 培養4日目の巨核球の代表的な画像。細胞を3日間インキュベートし、液体中(左)または2%メチルセルロースヒドロゲル培地(右)に続いて、液体培地中で1日の再懸濁液を行った。黒い矢印は、原血小板を伸ばす巨核球を示す。(スケールバー= 50 μm)。(B)プロメトレー形成の代表的な定量データ。プロ血小板形成は、4日目に定量化された、前に0日目から3日目まで前培養したメガカルキサイトを液体中または2%メチルセルロースヒドロゲル培地で前培養した。結果は、プロ血小板を拡張する巨核球の%(平均±SD)として表され、3つの独立した実験から、条件ごとに調べられた巨核球の総数>750(t-test、p = 0.0023)である。プロ血小板を伸ばす巨核球の平均割合は、液体状態では16%、メチルセルロースヒドロゲル前培養では39%である。この結果は、液体条件と比較してプロ血小板形成を増加させるヒドロゲル前培養の以前に実証され、公表された効果に対応する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
過去10年間で、メカノバイオロジーは生物学の多くの分野でますます関心を集めています。細胞を取り巻く機械的環境が行動に役割を果たしていることが一般的に認められ、巨核球が細胞外の機械的手がかりをどのように感知し、反応するかを研究することの重要性を強調しています。特に大型哺乳類の骨骨の中に位置する造血用赤い骨髄を考慮すると、糖尿病からより容易にアクセス可能な骨髄がジポサイト(黄色骨髄)12で構成されているのが特に、その場で骨髄組織の剛性を正確に測定することは困難である。糖尿病が本質的に赤い骨髄を含むマウスから単離された骨髄の場合、もう一つの問題は、骨から抽出されると、組織が凝集したままでなさいということです。しかし、シンと共同研究者は、原子間力顕微鏡を用いてマウスジアフィシス骨髄剛性を測定することができ、最も柔らかい組織の中に骨髄を配置するE骨髄=0.3±0.1kPaの値を発見した。
ここで説明する手順の目的は、液体培地中の巨核球の挙動をヒドロゲル中の大核球の挙動と比較することです。液体ミリューでは、細胞はすべて井戸の底部で沈殿し、硬いプラスチック表面に接触し、いつか他の細胞と接触する。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、ゲル中で均一に分布し、他の細胞から完全に単離される(図3A)。したがって、彼らは本質的に、ジャクスタリン通信を除く、閉じ込めによって提供される機械的手がかりに提出される。パラクリン刺激は完全に排除することはできません。それにもかかわらず、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、骨髄の状況に反して互いに遠く離れているため、分泌物質が隣接する細胞に到達した場合、それらは非常に希釈される可能性があると考えることができます。
この方法は簡単に設定でき、特定のスキルは必要ありません。メチルセルロースは、ポリマー鎖が非共有の架橋を形成する物理的なゲルである。低温で液体であること、温度を上げると、それは、(ゲルの機械的特性の特性の詳細については、Aguilarら.20169 からの記事を参照してください)、それは、ゼリフィをする。このゲル状態は、水溶液中の希釈後に容易に反転することができ、ゲルで固定されているか、生細胞として、細胞の容易な回収を可能にする。
ここで重要な要因は、ヒドロゲルの剛性です。適切なメチルセルロースの体積は、ヒドロゲル濃度のわずかな変化でさえ、ミリューの剛性に重要な影響を与え、したがって巨核球成熟に重要な影響を与えることができるので、非常に正確に分配されるべきである。例えば、メチルセルロース濃度を2%から2.5%に増加させることが以前に示されたので、ゲル剛性(ヤング率)は10倍に増加した。考えられる落とし穴の1つは、細胞を播種した後、各実験でよくメチルセルロースの正確なレオロジー特性を検証する簡単な品質管理ができないことです。それにもかかわらず、正しいゲル濃度を安心させる必須の基準は、液体培地とほぼ同様の大きなサイズによって反映されるように、ヒドロゲル内の巨核球の適切な成熟である。平均直径の減少は、2.5%メチルセルロースで剛性を増加させる場合と同様の欠陥分化を反映する可能性があります(図3B)。
この方法のもう一つの制限は、遠心分離前にゲルを最初に希釈する必要があるため、ヒドロゲルからの細胞回収は古典培養よりも時間がかかる点である。メチルセルロースを完全に除去する必要がある場合、例えば、さらなるウェスタンブロットまたはRNAの分離手順のために細胞リセートを得るために、追加の洗浄ステップが必要になる可能性があり、その間にタンパク質またはRNAで修飾が起こり得る(タンパク質脱リン酸化、RNA分解..
この手順で考慮すべき重要な点は、各条件で等しくなっているセル数です。これは、液体培養では、細胞がウェルの底に沈み込む傾向があり、そのうちのいくつかは、ヒドロゲル中の懸濁液中の細胞には当てはまらないプラスチック表面に付着する傾向があるので、それほど些細なことではありません。1つの落とし穴は、液体状態における細胞の不完全な集合であり、3日目に液体培地中で懸濁した後の「液体」と「ヒドロゲル」状態の間で異なる細胞含有量をもたらす。このような違いは、最終的なデータの不一致につながる可能性があります。チェックポイントとして、セルを再シードする前に、この段階でセルの数え切れを行うことができます。特に巨核球などの大細胞に適しているので、ナジョート血球計を使用して手動で行うことが好ましい。
任意の一次細胞培養に関しては、汚染の可能性がある。小さな汚染は液体培地よりも検出が難しいように見えるので、汚染はメチルセルロース前培養前の状態で異常に低いプロマテレットの割合に最も可能性の高い説明です。したがって、プロトクレト定量化まで気付かれずに、誤解を招く結果を招く可能性があります。良好な実験室の実践は、注射器およびコネクタの多数の、精密な操作を必要とするメチルセルロース細胞カプセル化の間に特に厳密に観察されなければならない。メガカルヨサイトの生存率は、3日目に再播種する前に、手動でカウントするためにナジョーテ細胞チャンバーを使用してトリパンブルーでチェックする必要があります。
全体として、ここで提供されるプロトコルは、メチルセルロースヒドロゲルを用いた古典的な液体培養と3D培養との比較のためのインビトロモデルを説明する。なお、この培養プロトコルはマウスの初代Lin-細胞について説明されており、ヒト細胞にまだ適応されていない。この3Dモデルは、巨大核球の挙動と成熟に対する機械的環境の影響を調べるのに役立つツールです。また、(ゲル上でも)培養物に化合物を添加して、巨核球の挙動/成熟およびプロ血小板形成に対する薬物の影響を研究することも可能である。最後に、細胞が骨髄に遭遇する可能性のある機械的制約を再現することにより、この培養系は、Myh9ノックアウト巨核球9、13、14に対して以前に示された古典的な液体培養において観察できなかった異常な表現型の調査を可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、最初に実験室でこの技術を開発したファビアン・ペルトゥイとアリシア・アギラール、ならびにメチルセルロースヒドロゲルの粘弾性特性を特徴づけたドミニク・コリン(チャールズ・サドロン研究所 - ストラスブール)に感謝したいと考えています。この作品は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)とARN助成金(ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)によって支えられました。ジュリー・ボッシャーは、フォンダシオンの受賞者で、レシェルシュ・メディカル(FRM助成金番号FDT202012010422)を注ぎます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
