Summary
Reconhece-se agora que o ambiente tridimensional das células pode desempenhar um papel importante em seu comportamento, maturação e/ou diferenciação. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular tridimensional projetado para estudar o impacto da contenção física e restrições mecânicas em megacaiócitos.
Abstract
O ambiente 3D que leva tanto ao confinamento quanto às restrições mecânicas é cada vez mais reconhecido como um importante determinante do comportamento celular. Assim, a cultura 3D foi desenvolvida para melhor abordar a situação in vivo. Os megacariócitos diferenciam-se das células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) na medula óssea (ML). O BM é um dos tecidos mais moles do corpo, confinado dentro do osso. O osso sendo pouco extensível na escala celular, megacariócitos são concomitantemente submetidos a uma rigidez fraca e alto confinamento. Este protocolo apresenta um método para a recuperação de HSPCs de linhagem de camundongos negativos (Lin-) por triagem imunomagnética e sua diferenciação em megacaiócitos maduros em um meio 3D composto de metilcelulose. A metilcelulose não é reativa em relação aos megacaiócitos e sua rigidez pode ser ajustada à da medula óssea normal ou aumentada para imitar uma medula fibrosa patológica. O processo de recuperação dos megacaitos para novas análises celulares também está detalhado no protocolo. Embora a extensão de proplato é impedida dentro do meio 3D, ela é descrita abaixo como resuspend os megacaitos em meio líquido e quantificar sua capacidade de estender proplatelets. Os megacariócitos cultivados em hidrogel 3D têm maior capacidade de formar proplatelets em comparação com aqueles cultivados em um meio líquido. Esta cultura 3D permite i) diferenciar progenitores em direção a megacaitos que atingem um estado de maturação mais elevado, ii) para recapitular fenótipos que podem ser observados in vivo, mas passam despercebidos nas culturas líquidas clássicas, e iii) para estudar vias de transdução induzidas pelas pistas mecânicas fornecidas por um ambiente 3D.
Introduction
As células do corpo experimentam um complexo microambiente 3D e são submetidas à interação entre pistas químicas e mecanofísicas, incluindo rigidez do tecido e confinamento devido às células vizinhas e matriz circundante 1,2,3. A importância da rigidez e confinamento para o comportamento celular só foi reconhecida nas últimas décadas. Em 2006, o trabalho seminal da Engler et al. 4 destacou a importância do ambiente mecânico para a diferenciação celular. Os autores demonstraram que a variação da rigidez do substrato celular resultou na orientação das células-tronco para várias linhagens de diferenciação. Desde então, o impacto das pistas mecânicas sobre o destino e o comportamento celular tornou-se cada vez mais reconhecido eestudado. Apesar de ser um dos tecidos mais moles do organismo, a medula óssea tem uma organização estrutural 3D que está confinada dentro do osso. A rigidez da medula, embora tecnicamente difícil de medir com precisão, é estimada entre 15 e 300 Pa 5,6. Dentro do estroma, as células estão bem confinadas umas às outras. Além disso, a maioria deles está migrando em direção aos vasos sinusoides para entrar na circulação sanguínea. Essas condições criam restrições mecânicas adicionais em células adjacentes, que têm que se adaptar a essas forças. As pistas mecânicas representam um parâmetro importante cujas consequências sobre a diferenciação de megacariote e a formação de proplatelets foram recentemente exploradas. Embora os megacaiócitos possam diferenciar in vitro na cultura líquida tradicional, eles não atingem o grau de maturação observado in vivo,em parte devido à ausência das pistas mecânicas do ambiente 3D 7. Progenitores em crescimento embutidos em hidrogel traz pistas mecânicas 3D que estão faltando em meio líquido.
Hidrogéis têm sido amplamente utilizados por várias décadas no campo hematológico, notadamente para cultivar células em colônias formando ensaios para quantificar progenitores hematopoiéticos. No entanto, esses hidrogéis raramente têm sido usados para explorar o impacto biológico do ambiente mecânico 3D na maturação e diferenciação das células hematopoiéticas. Nos últimos anos, nosso laboratório desenvolveu um modelo de cultura 3D usando um hidrogel à base de metilcelulose 8. Este gel físico não reativo é uma ferramenta útil para imitar as restrições físicas do ambiente de megacaiócito nativo. É derivado da celulose pela substituição de resíduos de hidroxílico (-OH) por grupos de metoóxido (-OCH3). Tanto o grau de substituição de metila quanto a concentração de metilcelulose determinam a rigidez do hidrogel uma vez que tenha gelatinado. Durante a fase de desenvolvimento desta técnica, foi demonstrado que o módulo de um Young na faixa de 30 a 60 Pa é a rigidez de gel ideal para o crescimento de megacariocíte 9.
O protocolo a seguir descreve um método para cultivar progenitores megacariocíticos de camundongos em um hidrogel de metilcelulose 3D. Foi demonstrado anteriormente que, em comparação com a cultura líquida padrão, essa cultura de hidrogel aumenta o grau de poliploidização de megacaitos, melhora a maturação e organização intracelular, e aumenta a capacidade de megacaiócitos para estender proplatelets uma vez resuspended em um meio líquido 9. Este manuscrito descreve em detalhes o protocolo para o isolamento das células lin- da medula óssea do rato e sua incorporação em um hidrogel de metilcelulose para cultura 3D, bem como a quantificação de sua capacidade de produzir proplatas e a recuperação das células para análises posteriores.
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Protocol
Todos os experimentos devem ser realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os protocolos exibidos no vídeo foram realizados em estrita conformidade com a lei europeia e as recomendações do Conselho de Revisão do Etablissement Français du Sang (EFS). Uma primeira versão deste protocolo foi originalmente publicada em 2018 em Métodos em Biologia Molecular 8.
NOTA: A Figura 1 apresenta uma visão esquemática de todo o processo. Este processo inclui 1) dissecção óssea, recuperação de medula e isolamento mecânico de células de medula, 2) classificação magnética de células negativas de linhagem (Lin-) células, 3) semeadura em hidrogel líquido ou metilcelulose, e 4) resuspensão de megacaitos cultivados em gel 3D para exame da formação de propetato em meio líquido.
1. Coleta óssea de ratos adultos
NOTA: Nesta seção, é importante minimizar a contaminação microbiana.
- Prepare um tubo de 15 mL para coleta óssea com o Médio Modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco contendo 1% do volume total de penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG) mistura de antibióticos (penicilina 10000 U/mL, estreptomicina 100000 μg/mL e L-glutamina 29,2 mg/mL).
NOTA: Se todos os camundongos utilizados tiverem o mesmo genótipo, acumule todos os ossos no mesmo tubo contendo 1 mL de DMEM - PSG 1% por número de camundongos. Antibióticos são importantes para evitar a possível proliferação de bactérias durante o tempo de amostragem óssea. - Encha um tubo de 50 mL com etanol 70% para desinfecção óssea e outro para lavagem de instrumentos durante o procedimento. Use instrumentos de dissecção esterilizados.
- Anestesiar os camundongos usando inalação de isoflurana (4%) e rapidamente proceder à luxação cervical para eutanásia dos camundongos. Imerque rapidamente o corpo em 70% de etanol para desinfetar e evitar contaminação microbiana.
- Disseca rapidamente as tíbias e os fêmures.
- Usando um bisturi, corte as epífitas da extremidade lateral do tornozelo para a tíbia e da extremidade do quadril para o fêmur.
- Mergulhe os ossos por um segundo em 70% de etanol antes de imergi-los no meio DMEM contendo 1% de PSG.
2. Dissociação de medula e isolamento de células Lin
NOTA: Esta parte do protocolo é realizada sob um capô de fluxo laminar. Para uma cultura, todos os poços fazem parte do mesmo experimento e não podem ser considerados como réplicas biológicas independentes. As células de todos os camundongos são agrupadas para garantir a homogeneidade de todos os poços e para serem capazes de compará-los uns com os outros, eliminando uma possível variabilidade inter-individual. Para réplicas biológicas independentes, a cultura deve ser repetida.
- Coloque os ossos em uma placa de Petri e levante-os duas vezes na solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco para remover potenciais contaminantes.
- Prepare dMEM - 1% PSG em um tubo de 50 mL.
NOTA: Forneça 2 mL de DMEM - 1% PSG por camundongos usados para o experimento. - Encha uma seringa de 5 mL equipada com uma agulha de calibre 21 com DMEM - 1% PSG.
- Segurando o osso com fórceps, introduza apenas o bisbilhotamento da agulha na extremidade lateral do joelho.
NOTA: A epífise lateral do joelho deve permanecer intacta a partir da dissecção, deixando uma pequena cavidade em seu centro através da qual inserir a agulha. A epífise restante manterá o osso preso à agulha durante a descarga. Tenha cuidado para não introduzir mais do que o chanfrado no osso, pois pode esmagar e danificar a medula. - Pressione rapidamente o êmbolo da seringa para lavar a medula em um tubo de 50 mL.
NOTA: Para evitar respingos e facilitar a descarga e liberação da medula coloque a extremidade livre do osso na parede do tubo, imersa em DMEM - 1% PSG. Na prática, um volume entre 500 μL e 1 mL é geralmente suficiente para expulsar a medula do osso. Quando a medula foi totalmente expelida, o osso ficou branco. Caso a medula não tenha sido totalmente expulsa da diáfise como julgada por alguma cor vermelha remanescente, é possível repetir a descarga com meio fresco. - Repita os passos 2.4. e 2,5. para todos os ossos, reabastecendo a seringa de 5 mL com DMEM - 1% PSG, se necessário.
- Use a mesma seringa de 5 mL com a agulha de 21 medidores para transferir o volume total de medula lavada em tubos de 10 mL com fundo redondo.
NOTA: Não é absolutamente necessário mudar para um tubo de 10 mL com fundo redondo, mas facilita a ção para as seguintes etapas de dissociação. Não hesite em trocar seringa e/ou agulha se houver suspeita de risco de contaminação. - Prossiga para a dissociação celular aspirando e expulsando as células médias e de medula sucessivamente duas vezes através de uma agulha de calibre 21, três vezes através de um calibre 23 e uma vez através de uma agulha de calibre 25.
NOTA: Evite bolhas de ar, pois pode ser prejudicial para as células. - Transfira a suspensão para tubos de 15 mL.
- Meça o número do celular e verifique a viabilidade usando um contador celular automatizado ou uma câmara celular para contagem manual na presença de azul trypan para excluir células mortas.
- Centrifugar os tubos de 15 mL por 7 min a 300 x g. Usando uma pipeta de transferência de 1 mL, cuidadosamente pipeta para fora e descartar o supernatante.
- Isolar células de haste e progenitor por classificação imunomagnética negativa usando um kit de isolamento de células hematopoiéticas do rato.
NOTA: O objetivo desta classificação celular é recuperar as células negativas para todos os anticorpos de seleção (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) e, portanto, eliminar as células que já estão engajadas em uma linhagem diferenciada diferente da megacariocítica. - Seguindo as instruções do kit, resuspenque a pelota celular em m médio recém-preparado (PBS com 2% do volume final de soro bovino fetal (FBS), EDTA 1 mM) a uma concentração de 1 × 108 células/mL e distribua a suspensão em tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL a um volume máximo de 2 mL.
- Adicione aos tubos de poliestireno: soro de rato normal a uma concentração de 50 μL/mL, bem como a mistura de anticorpos biotiningados (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) a uma concentração de 50 μL de mix por mL e homogeneizar suavemente os tubos.
NOTA: Esses anticorpos se ligarão a células já engajadas em uma via de diferenciação, exceto a via megacariocítica. - Incubar os tubos no gelo por 15 minutos.
- Adicione contas magnéticas revestidas de streptavidin a uma concentração de 75 μL/mL e homogeneize-se movendo suavemente os tubos.
- Incubar novamente no gelo por 10 minutos.
- Se necessário, ajuste a um volume final de 2,5 mL por tubo com meio M.
- Homogeneize a suspensão apertando suavemente o tubo pouco antes de colocá-los, sem as tampas, dentro de um ímã e esperar por três minutos.
NOTA: As células já engajadas em uma via de diferenciação e revestidas com contas magnéticas serão retidas na parede do tubo dentro do ímã. - Inverta ímã e tubo para transferir o conteúdo do tubo para um novo tubo de poliestireno de 5 mL com fundo redondo.
NOTA: Não tire o tubo do ímã para a transferência; é feito invertendo o ímã com o tubo ainda dentro. Use um movimento constante e não agite o tubo. - Descarte o tubo inicial contendo células de rótulo magnético indesejados e coloque o novo, sem sua tampa, no ímã por mais três minutos.
- Procedendo como na etapa 2.20, transfira as células Lin- isoladas para um novo tubo de 15 mL.
NOTA: Se vários tubos de poliestireno de 5 mL foram usados para as etapas anteriores, acumule todas as células no mesmo tubo de 15 mL. As células recuperadas após a triagem celular são células-tronco hematopoiéticas e progenitores. A presença de trombopoietina (TPO), o principal regulador fisiológico da megacariopoiese 10,direcionará a diferenciação celular para a linha celular megacariocítica. - Meça o número da célula Lin e a viabilidade como na etapa 2.10.
- Calcule o volume necessário de suspensão celular para centrífuga para ter 1 x 106 células viáveis x Número de Poço, Bem Número sendo o número de poços para sementes por condição.
- Prepare um tubo por condição com o volume apropriado de suspensão celular e centrífuga a 300 x g por 7 min.
- Para culturas líquidas, descarte o supernasce e resuspenque a pelota celular em meio de cultura completa (DMEM, PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) para alcançar a concentração final de 2 × 106 células viáveis/mL (igual a 1 × 106 células por 500 μL bem). Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO2. (= dia 0 de cultura)
NOTA: Veja o próximo parágrafo para culturas de metilcelulose Como exemplo, para preparar meio de cultura completa para um bem, use 435 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para final de 10%, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para final de 100 U/mL e 5 μL de 5 μg/mL TPO para 50 ng/mL final. Placas de cultura de 4 poços ou 24 poços são tipicamente usadas, pois seu diâmetro de poço é um bom ajuste para os 500 μL necessários por poço.
3. Incorporação celular em hidrogel de metilcelulose
NOTA: Observe que o protocolo a seguir descreve o método para obter um único poço de cultura de células hidrogel, adaptar-se ao número de poços necessários.
- Descongele 1 mL de solução de estoque de metilcelulose a temperatura ambiente. Prepare uma alíquota extra separada de metilcelulose para revestimento de seringa.
NOTA: Em uma concentração de 3%, a metilcelulose permanece líquida à temperatura ambiente (20-25 °C). - Cubra uma seringa de bloqueio Luer de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 18 com metilcelulose, desenhando 1 mL de metilcelulose da alíquota extra. Expulse totalmente o metilcelulose.
NOTA: Esta etapa de revestimento garante que o volume de metilcelulose coletado na etapa 3.3 seja exato. - Com a mesma seringa e agulha, mas utilizando uma nova alíquota de metilcelulose, desenhe o volume apropriado de metilcelulose(Figura 2A).
NOTA: Para alcançar uma concentração final de 2% de metilcelulose em um volume final de 500 μL por poço, é necessário 333 μL de 3% de metilcelulose. - Remova com cautela a agulha. Utilizando fórceps esterilizados, enrosque um conector de trava Luer na extremidade da seringa (Figura 2B-C).
- Conecte uma segunda seringa de bloqueio Luer de 1 mL ao conector de bloqueio Luer, a fim de conectar as duas seringas(Figura 2D).
NOTA: Não há necessidade de revestir esta segunda seringa. - Distribua igualmente o volume de metilcelulose entre as duas seringas(Figura 2E) e coloque-as de lado até o passo 3.11.
- Prepare o meio de cultura DMEM concentrado de modo a obter no volume final de metilcelulose (etapa 3.11) uma concentração idêntica à do meio de cultura líquida para cada composto (PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- Prepare 167 μL de cultura concentrada por poço final de 1 × 106 células. Esse volume médio é calculado de modo a obter uma concentração final de metilcelulose de 2%. O volume total no poço será de 500 μL (167 μL de suspensão celular em meio de cultura concentrada + 333 μL de metilcelulose) e todos os componentes terão uma concentração idêntica à dos poços líquidos.
- Como exemplo, para preparar meio de cultura completa para um poço, usar 102 μL de DMEM, 50 μL de 100% FBS para 10% final, 5 μL de 100% PSG para 1% final, 5 μL de 10 000 U/mL para final de 100 U/mL e 5 μL de 5 μg/mL TPO para 50 ng/mL final. Dá um volume de 167 μL usado para resuspensar as células e com a adição de 333 μL de metilcelulose o volume final será de 500 μL.
- Após completar a etapa de centrifugação 2.26, descarte o supernasce e resuspenque a pelota celular no meio de cultura concentrada a uma razão de 1 ×10 6 células por 167 μL.
- Retire as seringas e desconecte uma delas do conector.
- Pipeta 167 μL da suspensão da célula.
- Adicione a suspensão da célula diretamente no conector da seringa(Figura 2F),certificando-se de não introduzir bolhas de ar.
NOTA: Ao adicionar a suspensão da célula, desenhe lentamente o êmbolo da seringa simultaneamente para liberar algum espaço para a suspensão da célula. - Reconecte cuidadosamente as duas seringas(Figura 2G)sem perder nenhuma suspensão na rosca do parafuso.
NOTA: Antes da reconexão, desenhe o êmbolo para deixar o conector meio vazio e deixe espaço suficiente para a segunda seringa se conectar sem que a suspensão transborde. - Homogeneize lentamente o meio de metilcelulose com a suspensão celular com dez movimentos de êmbolo entre as duas seringas(Figura 2H).
- Desenhe o volume total em uma seringa e desconecte as duas seringas, deixando o conector no vazio.
- Esvazie o conteúdo da seringa em um poço de placa de 4 poços(Figura 2I).
- Incubar as células a 37 °C abaixo de 5% de CO2 (= dia 0 de cultura).
NOTA: É possível preparar dois poços de metilcelulose com um par de seringas. Aumente em dois o volume de metilcelulose e o volume de suspensão celular para ter 2 x106 células. Após completar a etapa 3.13. distribuir o volume igualmente entre as duas seringas para ter 500 μL em cada uma delas. Desconectá-los e esvaziar o que não é o conector em uma cultura bem. Reconecte as seringas para transferir o volume daquele que manteve o conector para o outro. Desconecte as seringas, aquela com 500 μL não deve ter o conector ligado, e semear as células em uma segunda cultura bem. A metilcelulose de 3% é comprada como uma solução de estoque no Medium (IMDM) modificado da Iscove, enquanto as células concentradas são suspensas no DMEM. Testes comparativos foram feitos inicialmente para garantir que esse meio misto não tenha impacto no resultado do experimento, especialmente em comparação com a cultura líquida em 100% DMEM.
4. Ressuspensão celular para análise de proplatelet
NOTA: A análise da capacidade de formação de proplatelets deve ser realizada em condições comparáveis entre megacariócitos cultivados líquidos e metilcelulose. As restrições físicas exercidas pelo hidrogel de metilcelulose inibem a extensão proplatelet. Portanto, as células cultivadas com metilcelulose são resuspengiadas em meio líquido fresco no terceiro dia de cultura para permitir que elas ampliem proplatelets. O hidrogel de metilcelulose é um hidrogel físico que é facilmente diluído em cima da adição líquida. É importante ressaltar que, para evitar artefatos de ressuspensão e centrifugação, as células no meio líquido de controle devem ser tratadas simultaneamente da mesma forma que as células cultivadas com metilcelulose. Consulte a representação esquemática do experimento(Figura 1).
- Prepare 10 mL de DMEM - 1% PSG pré-aquecido a 37 °C em um tubo de 15 mL para cada poço para resuspend.
- Resuspensar cautelosamente as células de cada poço nos 10 mL de DMEM - 1% PSG.
NOTA: Faça suavemente vários movimentos para cima e para baixo para diluir completamente o metilcelulose. Para os poços líquidos certifique-se de coletar todas as células depositadas na parte inferior do poço. - Centrifugar os tubos 5 min a 300 × g.
- Enquanto isso, preparem o meio cultura completo (DMEM, PSG 1% do volume final, FBS 10% do volume final, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
NOTA: Nesta etapa cada poço é recuperado para ser diluído pela metade, portanto, prepare 1 mL de cultura completa por poço. - Descarte o supernatante e resuspenque a pelota celular em 1 mL de meio de cultura para cada tubo.
- Reseed 500 μL de suspensão celular por poço em uma placa de 4 ou 24 poços e incubar a 37 °C sob 5% DE CO2.
NOTA: A partir de um poço inicial, obtenha 2 poços para visualização proplatelet em duplicata. Observe que, como essas duplicatas se originam da mesma amostra, elas não podem ser consideradas como réplicas independentes. - 24 horas após a ressedação, no 4º dia da cultura, adquira aleatoriamente 10 imagens por poço usando microscopia de campo brilhante e o objetivo × 20.
NOTA: As células tendem a se agrupar no centro do poço, certifique-se de não ter muitas células no campo, pois pode dificultar a visualização e quantificação proplatletas. Certifique-se de capturar pelo menos 5 megacaiócitos por campo. - Conte o número total de megacaiócitos e de megacaiócitos que estendem proplatelets em cada imagem e calcule a proporção de megacaiócitos que estendem proplatelets.
NOTA: A quantificação não é automatizada; executar a contagem de células manualmente. A contagem pode ser facilitada pelo uso do plugin de contador de células do ImageJ para clicar nas células, a fim de marcá-las conforme são contadas. 10 campos adquiridos por poços e poços em duplicata representam aproximadamente 150-300 megacaiócitos por condição.
5. Fixação celular e recuperação para análises futuras
ATENÇÃO: Este protocolo utiliza fixações que devem ser manuseadas sob um capô de fumaça, usando equipamentos de proteção.
NOTA: O objetivo é manter intactas as restrições de gel aplicadas nas células até que estejam totalmente fixas. Portanto, e independentemente do fixador utilizado, deve ser adicionado no poço em cima do metilcelulose, sem perturbar o gel. O mesmo protocolo é aplicado às culturas líquidas.
- Adicione um volume de solução fixação igual ao volume semeado (500 μL neste protocolo), em cima da metilcelulose sem interromper o gel. Aguarde o tempo adequado de acordo com o fixador utilizado (pelo menos 10 min).
NOTA: A difusão fixativa em todo o gel deve ser muito rápida, como revelado por uma rápida mudança na cor do gel (do rosa para um tom amarelo-laranja). Paraformaldeído (8% em DPBS, 500 μL por poço) é geralmente usado para imunolabeling, enquanto glutaraldheído (5% em tampão de cacodilato, 500 μL por poço) é usado para análise de microscopia eletrônica. - Usando uma pipeta P1000 suavemente faça várias pipetting para cima e para baixo com o fixador e o gel de modo a diluir homogêneamente o metilcelulose.
- Usando a mesma pipeta e ponta, transfira todo o volume do poço para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de DPBS e homogeneize.
- Centrifugar a mistura a 300 × g por 7 min.
NOTA: Um segundo passo de lavagem pode ser necessário para eliminar toda a metilcelulose - Descarte o supernascer e resuspenque a pelota de megacaito no meio apropriado de acordo com a análise desejada (imunolabelamento, citometria de fluxo9,microscopia eletrônica ...) (para microscopia eletrônica veja também o método de papel "In situ exploração dos principais passos da megacariopoiese usando microscopia eletrônica de transmissão" nesta edição jove).
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Representative Results
Os dados obtidos por este protocolo foram originalmente publicados no Blood em 20169.
De acordo com o protocolo, as células foram semeadas em meio de hidrogel líquido ou metilcelulose. As células em meio líquido têm todos sedimentados na parte inferior do poço, em contato com a superfície plástica rígida e em algum momento com outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea no gel e são isoladas das células vizinhas(Figura 3A). O gel de metilacelulose em uma concentração final de 2% aumenta ligeiramente o diâmetro médio do megacariócito em comparação com a cultura líquida (Figura 3B),de acordo com a ploidy9mais elevada relatada . Em contrapartida, o aumento da concentração de metilcelulose em 0,5% prejudica a diferenciação de megacariócitos, como mostra um diâmetro médio menor(Figura 3B).
Observa-se uma diferença notável na ultraestrutura de megacaiócitos entre megacariócitos diferenciados na cultura líquida e aqueles diferenciados in vivo dentro da medula óssea. Uma característica característica de megacaiócitos maduros é uma complexa rede de membrana intracytoplasmática, o DMS (Sistema de Membrana de Demarcação) que serve como um reservatório para a membrana das futuras plaquetas. Em megacaiócitos maduros, o DMS organiza-se para formar folhas de membrana entrelaçadas que ocupam a maior parte do citoplasma. Por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), eles parecem estar intimamente appostos e delineando territórios citoplasmáticos (painel superiorfigura 3C) (para o procedimento TEM, consulte o método de papel "In situ exploração dos principais passos da megacariopoiese usando microscopia eletrônica de transmissão" nesta mesma Edição JOVE). Na cultura líquida, as membranas DMS têm principalmente o aparecimento de pequenas vesículas redondas, ovais ou alongadas sem delimitação de territórios citoplasmados (painel médiofigura 3C). Em contrapartida, 2% da cultura de metilcelulose promove a organização do DMS na maioria dos megacaócitos, com membranas intimamente appostas e delimitando territórios citoplasmicos, assemelhando-se ao in situ (Figura 3C do painel inferior). Este resultado indica que a cultura de hidrogel de metilcelulose de 2% permite uma melhor diferenciação de megacariócito devido às restrições mecânicas do meio ambiental.
Após a transferência de células para o meio líquido no dia 3, os megacaiócitos começam a estender as proplatelets após 4h 9. A Figura 4 mostra a quantificação da proporção de megacaiócitos tendo proplatelets estendidos 24 h após a ressuspensão no meio líquido. Dez imagens foram adquiridas aleatoriamente por poço, utilizando microscopia de campo brilhante e o objetivo de 20×(Figura 4A). A quantificação foi realizada de forma cega e manual utilizando o plugin de contador de células em Fiji (ImageJ) (Figura 4B). Por se trata de culturas celulares primárias, há uma variabilidade entre experimentos, mas o protocolo permanece robusto e oferece uma boa reprodutibilidade. Na condição de pré-cultura líquida, a proporção proplatelet deve estar entre 10% e 20%, enquanto essa proporção é dobrada para a pré-cultura do hidrogel.
Figura 1. Representação esquemática de todo o processo. Ossos são dissecados, medula é lavada e células mecanicamente dissociadas. As células de interesse do caule e do progenitor (células lin) são isoladas por um procedimento de classificação negativa imunomagnética e semeadas em meio líquido ou hidrogel (dia 0). No 3º dia de cultura (que no total representa uma duração de 4 dias), ambas as condições são resuspendidas em meio de cultura líquida fresca separada. Esta segunda etapa de cultivo é realizada do 3º dia até o 4º dia da cultura. A proporção de MKs que estendem proplatelets é medida no 4º dia da cultura. Para clareza visual, uma célula é esquematizada por poço. O círculo azul está representando uma única célula com seu núcleo em roxo. Na etapa final, ambos os MKs são representados com proplatelet. A proporção de MKs formando proplatelets varia dependendo da pré-cultura líquida ou metilcelulose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Incorporação de células em hidrogel de metilcelulose. Após o pré-revestimento da parede das seringas,(A) desenhe o volume apropriado de metilcelulose; (B, C) desconecte a agulha e enrosque um conector sobre a seringa; (D) empurre o metilcelulose no meio do conector e conecte uma segunda seringa; (E) distribua igualmente o metilcelulose entre as duas seringas e desconecte-as; (F) adicionar a suspensão da célula à seringa que tem o conector; (G) reconectar as duas seringas; (H) homogeneizar empurrando todo o volume de uma seringa para outra algumas vezes; (I)semeou as células expulsando todo o volume em um prato de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Características do megacariócito de acordo com a condição cultural. (A) Imagens representativas de megacaiócitos no 3º dia de cultura em líquido (painel esquerdo) ou 2% de methylcelulose médio (painel direito). Barra de escala = 50 μm(B) Diâmetro médio de megacaiócitos cultivados em meio líquido, ou em 2% ou 2,5% de hidrogel de metilcelulose. Os resultados são expressos como a média ± SD em 3 culturas independentes, com um total de pelo menos 100 megacaiócitos examinados. *, P<0,05, ***P < 0,0001, utilizando análise de 1 via de variância (ANOVA) com o teste de comparação múltipla de Bonferroni. (gráfico adaptado de Aguilar et al. 2016) (C) Visão esquemática (esquerda) e imagens de microscopia eletrônica representativa (meio) de megacariócitos murinos; painéis direito, vistas de perto dos quadrados brancos (barra de escala = 5 μm para as imagens de microscopia eletrônica média e 2 μm para vistas de perto). Os painéis superiores estão in situ megacariócitos, o meio representa megacariócitos cultivados in vitro na cultura líquida e os painéis inferiores são megacaiócitos cultivados em hidrogel de metilcelulose 3D. Esses dados foram publicados originalmente no Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Resultados representativos da quantificação proplatelet. (A) imagens representativas de megacaiócitos no 4º dia da cultura. As células foram incubadas três dias em líquido(esquerda)ou 2% de mtilcelulose médio(à direita),seguido por um dia de resuspensão em meio líquido. As setas pretas indicam megacaiócitos que estendem as proplatelets. (Barra de escala = 50 μm). (B) Dados de quantificação representativa da formação de proplatos. Formação de proplatos quantificados no dia 4 para megacaiócitos previamente pré-cultivados do dia 0 ao dia 3 em meio de hidrogel líquido ou 2% de metilcelulose. Os resultados são expressos como o percentual de megacaiócitos que estendem proplatelets (média ± SD) e são de 3 experimentos independentes, com um número total de megacaiócitos examinados por condição >750 (t-test, p = 0,0023). A proporção média de megacaitos que estendem proplatelets é de 16% em condição líquida e 39% para a pré-cultura do hidrogel de metilcelulose. Este resultado corresponde ao efeito anteriormente demonstrado e publicado da pré-cultura do hidrogel que aumenta a formação de proplatelet em comparação com a condição líquida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Na década anterior, a mecanobiologia tem levantado cada vez mais interesse em muitas áreas da biologia. É comumente reconhecido que o ambiente mecânico ao redor das células desempenha um papel em seu comportamento, enfatizando a importância de estudar como os megacaiócitos sentem e respondem a sinais mecânicos extracelulares. É desafiador medir com precisão a rigidez do tecido da medula óssea no situ11, especialmente se considerarmos a medula vermelha hematopoiética, pois está localizada dentro de ossos trabeculares em grandes mamíferos, enquanto a medula mais facilmente acessível da difísica é composta essencialmente de adipócitos (medula amarela)12. No caso de uma medula isolada de camundongos, onde a difise contém medula essencialmente vermelha, outra questão é que, uma vez extraído do osso, o tecido não permanece coeso. No entanto, Shin e colaboradores conseguiram medir a rigidez da medula do camundongo usando microscopia de força atômica e encontraram um valor deMedula E = 0,3 ± 0,1 kPa, que coloca a medula entre os tecidos mais macios6.
O interesse do procedimento descrito aqui é comparar o comportamento de megacaiócito em meio líquido com o do hidrogel. No meio líquido, as células têm todos sedimentados na parte inferior do poço, em contato com a superfície plástica rígida e em algum momento com outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea no gel e são totalmente isoladas das outras células(Figura 3A). Assim, são submetidos essencialmente a pistas mecânicas fornecidas pelo confinamento, excluindo a comunicação justacria. A estimulação paracrina não pode ser totalmente excluída. No entanto, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose estão distantes umas das outras contrárias à situação da medula óssea e podemos, assim, assumir que se substâncias secretadas atingirem células vizinhas, elas podem ser muito diluídas.
O método é fácil de configurar e não requer habilidades específicas. Metilcelulose é um gel físico cujas cadeias de polímeros formam ligações cruzadas não covalentes. Sendo líquido a baixa temperatura, ele se mistura ao aumentar a temperatura (veja o artigo de Aguilar et al. 20169 para obter mais informações sobre a caracterização das propriedades mecânicas do gel). Este estado de gel pode ser facilmente revertido após a diluição em solução aquosa, o que permite uma recuperação fácil das células, sejam fixas em gel ou como células vivas.
Um fator crítico aqui é a rigidez do hidrogel. O volume de metilcelulose apropriado deve ser muito precisamente dispensado, pois mesmo uma pequena mudança na concentração de hidrogel pode ter um impacto importante na rigidez do meio e, portanto, na maturação do megacariote. Por exemplo, foi demonstrado anteriormente que o aumento da concentração de metilcelulose de 2 a 2,5% aumentou a rigidez do gel (módulo de Young) em 10 vezes. Uma possível armadilha é que não há controle de qualidade fácil para verificar propriedades reológicas precisas do metilcelulose em cada poço experimental, uma vez que tenha sido semeado com células. No entanto, um critério essencial que irá tranquilizar sobre uma concentração correta de gel é o amadurecimento adequado dos megacaiócitos dentro do hidrogel, como refletido pelo seu grande tamanho aproximadamente semelhante ao do meio líquido. Uma diminuição do diâmetro médio pode refletir uma diferenciação defeituosa semelhante à que ocorre ao aumentar a rigidez com 2,5% de metilcelulose(Figura 3B).
Outra limitação do método é que a recuperação celular do hidrogel leva mais tempo do que na cultura clássica, pois é necessário primeiro diluir o gel antes da centrifugação. Se a metilcelulose precisar ser totalmente removida, por exemplo, para obter liseto celular para mais procedimento de isolamento de manchas ocidentais ou RNA, pode ser necessária uma etapa adicional de lavagem, durante o qual podem ocorrer modificações de tempo em proteínas ou RNA (desfosforilação proteica, degradação do RNA...).
Um ponto crítico a ser considerado no procedimento é a contagem de células que deve ser igual em cada condição. Isso não é tão trivial, pois na cultura líquida, as células tendem a sedimentar na parte inferior do poço e algumas delas aderem na superfície plástica, o que não é o caso das células em suspensão em hidrogel. Uma armadilha é uma coleta incompleta das células na condição líquida, resultando em um teor celular diferente entre a condição "líquido" e "hidrogel" após suspensão em meio líquido no dia 3. Tal diferença pode levar a discrepâncias nos dados finais. Como ponto de verificação, uma numeração celular pode ser feita nesta fase antes de reseeding as células. É preferível fazê-lo manualmente usando um hemócito nageotte, pois é especialmente apropriado para células maiores, como megacaiócitos.
Quanto a qualquer cultura celular primária, há um possível risco de contaminação. A contaminação é a explicação mais provável para uma proporção de proplatelet extraordinariamente baixa na condição pré-cultura de metilcelulose, já que uma pequena contaminação parece mais difícil de detectar do que no meio líquido. Portanto, pode passar despercebido até a quantificação proplatelet, levando a resultados enganosos. Boas práticas laboratoriais devem ser rigorosamente observadas especialmente durante o encapsulamento de células de metilcelulose que requer manipulações numerosas e precisas de seringas e conectores. A viabilidade do megacaito também deve ser verificada com o azul Trypan usando uma câmara de células Nageotte para contagem manual antes de ressegar no dia 3.
No geral, o protocolo aqui fornecido descreve um modelo in vitro para comparação entre a cultura líquida clássica e uma cultura 3D usando hidrogel de metilcelulose. Note-se que este protocolo de cultura é descrito para o Lin primário do rato- células e ainda não foi adaptado às células humanas. Este modelo 3D é uma ferramenta útil para investigar o impacto do ambiente mecânico no comportamento de megacariocita e maturação9. Também é possível adicionar compostos na cultura (mesmo no gel) para estudar a influência de drogas no comportamento/maturação de megacariote e formação de proplatelet. Finalmente, ao reproduzir as restrições mecânicas que as células podem encontrar na medula óssea, este sistema de cultura permite a investigação de fenótipos anormais que não puderam ser observados nas culturas líquidas clássicas como mostrado anteriormente para os megacariócitos myh9 knockout 9,13,14.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Fabien Pertuy e Alicia Aguilar que inicialmente desenvolveram essa técnica no laboratório, bem como Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizaram as propriedades viscoelasticas do hidrogel de metilcelulose. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e por uma bolsa ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher é beneficiária da Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvenção da FRM FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
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- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
