הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY
Summary
מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.
Abstract
פעילות המוח, האותות האלקטרוכימיים המועברים בין נוירונים, נקבעת על ידי דפוסי הקישוריות של רשתות עצביות, ומהמורפולוגיה של תהליכים ותת-מבנים בתוך נוירונים אלה. ככזה, הרבה ממה שידוע על תפקוד המוח התעורר לצד התפתחויות בטכנולוגיות הדמיה המאפשרות תובנה נוספת על האופן שבו נוירונים מאורגנים ומחוברים במוח. שיפורים בניקוי רקמות אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרוסות מוח עבות, להקל על שחזור מורפולוגי ניתוחים של מבנים עצביים, כגון ארבורים דנדריטים וקוצים. במקביל, ההתקדמות בתוכנת עיבוד תמונה מספקת שיטות לניתוח מהיר של ערכות נתונים גדולות להדמיה. עבודה זו מציגה שיטה מהירה יחסית של עיבוד, הדמיה וניתוח פרוסות עבות של רקמה עצבית מסומנת ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמות CLARITY, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה. פרוטוקול זה יאפשר את המאמצים להבנת דפוסי הקישוריות והמורפולוגיות העצביות המאפיינות מוחות בריאים, ואת השינויים במאפיינים אלה המתעוררים במצבי מוח חולים.
Introduction
הבנת הארגון המרחבי, דפוסי הקישוריות והמורפולוגיה של מבנים ביולוגיים תלת-ממדיים מורכבים חיונית לתיווג הפונקציות של תאים ורקמות ספציפיים. זה נכון במיוחד במדעי המוח, שבהם הוקדש מאמץ עצום לבניית מפות נוירואנטומיות ברזולוציה גבוהה של מערכת העצבים המרכזית1,2. בחינה מדוקדקת של הנוירונים המרכיבים מפות אלה מניבה מורפורוגיות מגוונות, עם קשרים ומיקומים המשקפים את הפונקציה של קבוצות שונות אלה של נוירונים3,4. יתר על כן, חקירה של מבנים תת-תאיים, במיוחד קוצים דנדריטיים, יכולה ליידע את בגרות הסינפסות, ובכך לשקף תהליכים התפתחותיים ומדינות מחלה נוירולוגיות5,6,7. לכן, גישות המשפרות את רזולוציית ההדמיה ואת התפוקה חיוניות להבנה טובה יותר של תפקוד המוח בכל קנה מידה.
ההתקדמות האחרונה הרחיבה את ערכת הכלים המולקולרית והגנטית לסימון ומניפולציה של אוכלוסיות של נוירונים. הפיתוח של סמנים פלואורסצנטיים חדשים, בשילוב עם שיטות חדשות של החדרת סמנים אלה לתוך נוירונים, מאפשר תיוג דיפרנציאלי של אוכלוסיות של נוירונים אינטראקציה בתוך אותה חיה או דגימת מוח8,9,10,11. מכיוון שהאור מפוזר על ידי שומנים אטומים, ובהתחשב בתוכן השומנים הגבוה של רקמת המוח, אוכלוסיות עצביות הדמיה הוגבלה בעיקר לחלקים דקים או הסתמכה על טכניקות מיקרו-סקרופיות מתקדמות (למשל, קונפוקלית, מיקרוסקופיה רב-פוטונית וגיליון אור) למבנים עמוקים של תמונה. עם זאת, מאמצים אלה התחזקו מאוד על ידי התקדמות בטכניקות ניקוי רקמות. הדמיה נוקשה/חיסונים היברידיים/חיסונים היברידיים/חיסונים/ בהיברידיהתואמת רקמות (CLARITY) היא טכניקה אחת כזו, שבה רקמות מעניינות מושרות במונומרים הידרוג’ל (אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד) ולאחר מכן נשטפות עם דטרגנטים12. המונומרים ההידרוג’לים מתכלים ויוצרים פיגום הידרוג’ל תלת-ממדי יציב שקוף אופטית וחדיר לתוויות מקרומולקוליות. חומצות גרעין וחלבונים נשמרים בתוך המטריצה ההיברידית, ואילו השומנים מוסרים על ידי שטיפת חומרי הניקוי(איור 1). התוצאה היא רקמה יציבה כי הוא נוקשה מספיק כדי לשמור על הצורה המקורית ואת הכיוון של תאים ומולקולות שאינן שומנים בדם, בעוד שקוף אופטית מספיק כדי בקלות לדמיין מבנים עמוקים ברזולוציה גבוהה. תחזוקה זו של מבנה הרקמה והכיוון מאפשרת הדמיה של פרוסות עבות, ובכך משמרת חיבורים בין תא לתא ויחסים מרחביים. יתר על כן, מכיוון שהמיקום והזמינות של חלבונים וחומצות גרעין נשמרים במהלך תהליך הסליקה, רקמות מנוקות מסוגלות להחזיק סמנים מבוססי ביטוי, כמו גם תוויות אקסוגניות. לכן, CLARITY משאילה את עצמה כשיטה רבת עוצמה להדמיה כמויות גדולות של מבני מוח עמוקים ואת הקשרים בין מבנים אלה ברזולוציה גבוהה.
השימוש ב- CLARITY משפר מאוד את הגישות לאוכלוסיות נוירונים הדמיה. טכניקה זו מיומנת במיוחד ביצירת כמויות גדולות של נתוני הדמיה. CLARITY עובד היטב עם צורות מרובות של פלואורסצנטיות מבוססת חלבון. פרוטוקול זה משתמש בגישה מבוססת lentiviral כדי לתייג תאים בדלילות עם EGFP ו tdTomato; עם זאת, אללס כתב מהונדס המביע tdTomato או EGFP לסמן תאים לשחזור שימשו באופן שגרתי. חשוב לבחור פלואורופור שהוא גם יציב בתמונה וגם בהיר (למשל, EGFP או tdTomato). בנוסף, שימוש במקדם חזק כדי לבטא את הפלורופור מניב ניגודיות מעולה ואיכות תמונה. החסרונות של טכניקה זו מתעוררים כמו ניתוח נכון של כמות גדולה זו של נתונים יכול להיות גם עבודה- וגם זמן אינטנסיבי. מיקרוסקופים מיוחדים יכולים לעזור לשפר את התפוקה ולהפחית את עומס העבודה. עם זאת, בנייה, בעלות ו/או הפעלת מיקרוסקופים מתקדמים הם לעתים קרובות עלות-אוסרת עבור מעבדות רבות. עבודה זו מציגה תפוקה גבוהה, מהירה יחסית, שיטה פשוטה לדמיין כמויות גדולות של רקמה עצבית ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמת CLARITY של חלקים גדולים, בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה מתאר גישה זו בשלבים הבאים: 1) ניתוח והכנת הרקמה העצבית, 2) ניקוי הרקמה, 3) הרכבת הרקמה, 4) הדמיה של הפרוסות המוכנות, ו -5) עיבוד תמונות פרוסה מלאות באמצעות שחזור וניתוח תוכנת הדמיה מיקרוסקופית(איור 2). מאמצים אלה גורמים לתמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בהן כדי לנתח אוכלוסיות של נוירונים, דפוסי חיבור עצביים, מורפולוגיה דנדריטית תלת-ממדית, שפע עמוד שדרה דנדריטי ומורפולוגיה, ודפוסי ביטוי מולקולריים בתוך רקמת מוח שלמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפני הופעתן של טכניקות עכשוויות לניקוי רקמות, לימוד מורפולוגיה עצבית כלל חתך, הדמיה ושחזור עתירי זמן של חלקים דקים מאוד סמוכים. שימוש בניקוי רקמות אלקטרופורטיות בשילוב עם הדמיה קונפוצלית מספק תצוגה ללא הפרעה של מורפולוגיה עצבית מלאה. מעצים דנדריטיים שלמים, עד לבוטון הסינפטי הקטן ביותר, ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ל- NRDDC הליבה הנגיפית במכון הנוירולוגי יאן ודן דאנקן על ייצור ה- AAVs וה- lentiviruses המשמשים בניסויים אלה. בנוסף, ברצוננו להודות למרכז ביילור לרפואה השוואתית על גידול עכברים ותחזוקה כללית של העכברים המשמשים. ברצוננו להודות לאיגוד הלב האמריקאי על תמיכתם תחת פרס מספר 20PRE35040011, ו- BRASS: תומכי מחקר ביילור למדעני סטודנטים על תמיכתם (PJH). לבסוף, ברצוננו להודות ללוגואים על שסיפקו למעבדה שלנו את מערכת ניקוי הרקמות האלקטרופורטיות Logos X-Clarity.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
